PLCL纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究.pdf

3 7 6 东 S o 南 u t h 大 eas 学 t Un 学 i v 报 M e d 医 S c 学 iE 版 d i 2 o 1 5， J u n ； 3 4J So u t h e a s t U n i v Me dS c i E d i 3 3 7 6 ‘ 3 8 。 、 一 ⋯， 、 ／ ． v ． ⋯ S F ／ P L C L纺丝材料 复合 骨髓 间充质 干细胞 修 复兔桡 骨骨缺 损的实验研 究 郑欣 ， 李东亚 ， 陈一心 ， 邱旭升 ， 朱彦丞 ， 施鸿飞 ， 王骏飞 ， 熊进 1 ． 南京大学医学院附属鼓楼医院 骨科 ， 江苏 南京2 1 0 0 0 8 ； 2 ． 徐州医学院附属医院 骨科 ， 江苏 徐州2 2 1 0 0 0 [ 摘要]目的 研究 S F ／ P L C L纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的能力。方法 取兔骨髓 间 充质干细胞 B MS C s 并制成 B MS C s ／ 藻酸钙水凝胶。选择 8只 6月龄雄性新 西兰兔 ， 于双侧桡 骨 中段制备 1 5 m m大段骨缺损模型。其中实验组双侧植入 S F ／ P L C L后 注入 B M S C s ／ 藻酸钙水凝胶 ； 对照组单纯行双侧 桡骨缺损手术。所有兔于术后 1 2周行 C T检查观察骨缺损修 复情况 ， 之后处死兔 ， 大体及组织学观察 骨修 复情况。结果 术后 1 2周 C T及组织学检查显示 实验组纺丝材料塌 陷， 材料部分 降解 ， 纤维细胞长入材料 内部 ； 骨缺损断端有骨组织沿套管材料生长， 但骨缺损 未完成桥接。对照组缺损 区域软组织填充 ， 骨缺损断 端封闭。结论 S F ／ P L C L套管材料虽具有 良好的生物相容性 ， 但 尚不足 以用于修复兔桡骨骨缺损 ， 其成骨能 力及降解能力有待进一步提升。 [ 关键词]丝素蛋白； 聚左旋乳酸一己内酯； 桡骨； 骨缺损； 兔 [ 中图分类号]R 6 8 3 [ 文献标识码]A [ 文章编号]1 6 7 1 6 2 6 4 2 0 1 5 0 3 ‘ 0 3 7 6 0 5 d o i 1 0 ． 3 9 6 9 ／ ． i s s n ． 1 6 7卜6 2 6 4 ． 2 01 5 ． 0 3 ． 0 1 0 Re pa i r o f r a d i u s d e t e c t i o n b y S F／ PLCL s p i nn i ng c o mpo s i t e d wi t h BM SCs i n r a b bi t s ZHE NG Xi n ， L I Do n g 。 y a ， CHEN Yi 。 x i n ， QI U Xu 。 s h e n g ， ZHU Ya n c h e n g ， SHI Ho n g 。 f e i ， WANG J u n 。 f e i ， XI ONG J i n 1 ． D e p a r t m e n t o fO r t h o p a e d i c s ， t h e A ffil i a t e d D r u m T o w e r H o s p i t a l o fN a n j i n g U n i v e r s i t y Me d i c a l S c h o o l ， N a n fi n g 2 1 0 0 0 8 ， C h i n a ； 2 ． D e p a rt me n t o fO rt h o p aed i c s ， t h e A ffil i a t e d H o s p i t a l of X u z h o u Me d ic a l C o l l e g e ， X u z h o u 2 2 1 0 0 0， C h i n a [ A b s t r a c t ]O b j e c t i v e T o s t u d y th e o s te o g e n i c p o t e n t i a l o f S F ／ P L C L e l e c t r o s p i n n i n g m a t e ri a l c o m p o s i t e d w it h b o n e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s B MS C s i n r e p a i r i n g t h e r a d i u s d e f e c t i o n i n r a b b i t s ．Me t h o d s B MS C s w e r e o b a i n e d f r o m r a b b i t s a n d t h e n mi x e d f o r B MS C s ／ A l g i n a t e h y d r o g e 1 ．Ei g h t 6 一 mo n t h ‘ o l d ma l e Ne w Z e a l a n d w h i t e r a b b i t s W e r e r e c r u i t e d a n d 1 5 mm d e f e c t wa s c r e a t e d i n b o t h s i d e s o f t h e r a d i u s ．I n t h e e x p e r i me n t a l g r o u p，S F ／ P L C L s p i n n i n g c o mp o s i t e d wi t h B MS C s ／ a l g i n a t e h y d r o g e l wa s i mp l a n t e d i n t o t h e b o n e d e f e c t ．I n t h e c o n t r o l g r o u p， o n l y b i l a t e r a l s u r g e r y o f r a d i a l d e f e c t w a s p e r f o r me d ．T w e l v e we e k s p o s t o p e r a t i v e l y ．C T s c a n r e c o n s t ruc t i o n w e r e u s e d t o e v alu a t e t h e bo ne f o r ma t i o n ． The n t h e r a b b i t s we r e s a c r i fic e d a n d t he s p e c i me n s we r e h a r v e s t e d f o r [ 收稿日期] 2 0 1 5 - O 卜 2 9 [ 修回日期] 2 0 1 5 ‘ 0 2 1 3 [ 基金项目]国家 自 然科学基金项目 8 1 4 0 1 7 9 3 ； 江苏省社会发展基金项目 B E 2 0 1 1 6 0 4 ； 江苏省六大人才高峰项 目 2 0 1 2 一 W S 0 9 2 ； 南京市卫 生局项 目 Y K K1 3 0 7 9、 Z K X1 2 0 1 6 资助 [ 作者简介] 郑欣 1 9 8 5 一 ， 男， 江苏东台人， 主治医师， 医学博士。E - m a i l t h i n d y 1 9 8 0 1 6 3 ． c o n [ 通信作者]陈一心E m a i l c h e n y i x i n 9 3 1 2 6 ． t o m [ 引文格式]郑欣， 李东亚， 陈一心， 等． S F ／ P L C L 纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究[ J ] ． 东南大学学报 医学版， 2 0 1 5 ． 3 4 3 3 7 6 3 8 0 ． 郑欣 ， 等． S F ／ P L C L纺丝材料复合骨髓 间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究 3 7 7 h i s t o l o g i c s t u d y ． T h e s p e c i me n s w e r e e mb e d d e d i n p a r a f f i n，f o ll o w e d b y d e c a l c i fi c a t i o n a n d t h e n s t a i n e d b y h e ma t o x y l i n a n d e o s i n HEf o r h i s t o mo r p h o m e t r i c a n a l y s i s t o e v a l u a t e t h e b o n e r e p a i r ．R e s u l t s T w e l v e w e e k s p o s t o p e r a t i v e l y，C T s c a n r e c o n s t r u c t i o n a n d HE s t a i n i n g s h o we d t h a t S F ／ P L C L s p i n n i n g d e g r a d e d p a r t l y i n t h e e x p e rime n t a l g r o u p，a n d t h e b o n e f o r me d a l o n g t h e c a s i n g s t u mp，b u t t h e b o n e d e f e c t wa s n o t f u l l y b ri d g e d； Wh i l e i n t h e c o n t r o l g r o u p，t h e d e f e c t wa s fi l l e d wi t h s o f t t i s s u e ，a n d t h e e n d s o f b o n e d e f e c t s we r e c l o s e d ．Co n c l u s i o n S F ／ P L CL c a s i n g ma t e ri a l i n t h i s s t u d y s h o ws g o o d b i o c o mp a t i b i l i t y ，b u t i t s o s t e o g e n i c a b i l i t y a n d d e gra d a t i o n n e e d t o b e f u r t h e r r e fin e d． [ Ke y w o r d s ]s i l k p r o t e i n ； p o l y L l a c t i d e C O 。 c a p r o l a c t o n e ；r a d i u s ；b o n e d e f e c t ； r a b b i t s 骨组织工程技术是将种子细胞种植于支架材料后 植入骨缺损部位 ， 随支架材料降解 ， 种子细胞增殖分化 为成骨细胞， 进而完成骨缺损的修复， 现已广泛应用于 修 复 大 段 骨 缺 损 的基 础 研 究u j 。丝 素 蛋 白 s i l k p r o t e i n ， S F 属天然衍生物材料 ， 聚左旋乳酸一 己内酯 p o l y L l a c t i d e C O c a p r o l a c t o n e ， P L C L 为人 工合成高 分子材料 ， 两者在体 内均可完全降解且无毒副作用 ， 是 常用的骨组织工程支架材料 。本课题组前期研究 中， 成功建立了 6月龄雄性新西 兰兔 桡骨骨缺损 动物模 型 。本研究 中将 S F ／ P L C L复合兔 骨髓 基质干细胞 b o n e me s e n c h y m a l s t e m c e l l s ，B MS C s 构建 组织工程 骨， 用于修复新西兰兔桡骨缺损， 探讨其成骨能力， 以 期为骨组织工程研究提供参考。 1 材料 与方法 1 ． 1 实验材 料 1 ． 1 ． 1 主要试剂及仪 器 主要试剂为海藻酸钠干粉 上海贺宝化工公 司 、 P B S培养 液、 氯胺 酮、 3 ％戊 巴 比妥钠 、 青霉素。主要器 械及仪器为 骨髓 穿刺包 、 骨 科常用手术器械 、 X线摄片机 O P T I MU S 5 0 0 MA， 荷兰 P H I L I P S公司 、 C T L i g h t s p e e d 1 6层螺旋 C T， 美 国 G E 公司 。 1 ． 1 ． 2 实验材 料及 实验动 物 S F ／ P L C L套管 材料 内径为 4 m m ， 与兔桡骨 中段直径相适应 ， 经∞ C 0消 毒备用 该 材料 由东华大学材料学 院制备提供 。选 取 6月龄雄性新西兰兔 [ 由南京大学医学院附属鼓楼 医院动物 中心提 供 ， 动物 质量许 可证 号 S C X K 苏 2 0 0 6 ’ 0 0 0 9 ] ， 体重 3 ． 0 3 ． 5 k g ， 妊娠分娩正常 ， 无 明显 生长发育异常 、 肿瘤等疾病。 1 ． 2实验方 法 1 ． 2 ． 1 兔 B M S C s 的分离、 培养及成骨诱导3只实 验兔以 3 ％戊 巴比妥钠静脉麻 醉成功后 ， 无菌操作 下， 于股骨头行骨髓穿刺术抽取骨髓约 5 m l ， 置于离心管 中保存。将采集到的抗凝骨髓用密度梯度离心法分离 骨髓中的单个核细胞。运用差速贴壁法纯化细胞 ， 4 5 d 传代 1 次。收集 4 6代 M S C s ， 并调整浓度为2 l 0 。 个 m l ～。将海藻酸钠干粉 S i g m a A l d ri c h 溶于 超纯水中， 浓度为 1 ． 5 ％ ， 磁力搅拌 2 h后 以 0 ． 2 2 m 滤膜过滤除菌 ， 4℃保存备用 。将 1 m l 细胞 P B S悬 液 约 21 0 MS C细胞 缓 慢加人 4 m l 藻酸钠溶 液 中， 制成含细胞混悬液。以湿热灭菌的 1 ． 1 3 2 ％C a C 1 凝胶化， 制成 B MS C s ／ 藻酸钙水凝胶 ， 分装 于注射器 内 备用 。 1 ． 2 ． 2 兔桡骨缺损模型的建立及 S F ／ P L C L套 管置入 选取 6月龄雄性新西 兰大 白兔 8只 ， 随机分为实验 组及对照组 ， 各 4只。适应性饲养 1周后采用 3 ％戊 巴比妥钠 2 0 mgk g 麻醉 ， 将 双侧前臂备皮后仰 卧 位 固定于兔板 ， 消毒铺单 ， 于前臂桡侧 中上段切开皮 肤 、 皮下组织及筋膜 ， 分离肌 肉至桡骨骨膜； 以桡 骨弧 顶为 中点 ， 去除桡骨骨膜 ， 用装载直径 1 0 m m砂 轮磨 片的骨科电钻将桡骨截 除， 并仔细分离缺损区域 内残 留骨膜 ， 分别制作缺损长度为 1 5 m m 的骨缺损 。术中 使桡骨骨缺损两断面均垂直于尺骨纵轴 ， 截 除桡骨后 用2 O m l 生理盐水将缺损处骨碎屑 、 骨髓组织等彻底 冲 洗干净。实验组双侧 缺损 处植入 S F ／ P L C L套 管材料 后注人 B M S C s ／ 藻酸钙水 凝胶 ， 对 照组仅制造 双侧桡 骨 1 5 m m骨缺损 ， 不植入任何材料 图 1 。依次缝合 肌膜及皮下组织、 皮肤 ， 碘伏 消毒切 口并仔细包 扎， 单 笼饲养。术后连续 3 d肌肉注射青霉素 8 0万单位 ， 切 口每天予碘伏消毒换药直至 2周拆线。 1 ． 2 ． 3 观察指标记 录兔 的进食、 活动等一般情况 ， 切口有无红肿 、 渗出等表现 。于术后 1 2周摄 x线片 ， 并进行 C T扫描三维重建 ， 观察骨缺损修复情况 ； 影像 学 检查完成后 处死实 验兔 ， 大体观察后 留取 标本行 HE染色， 组织学观察骨修复情况。 2 结 果 2 ． 1 术后 一般情况 切 口无红肿、 渗液等炎症反应 ， 均一期愈合 ， 实验 兔进食和 日常活动正 常。术后 4周时 ， 实验组 1只实 验兔左侧尺骨骨折 ， 在进行组织学及影像学分析时该 只兔骨折侧不予计人结果分析。 3 8 0 东 So 南 u t h 大 eas 学 t Un 学 i 报 M e d 医 S c 学 i E 版 d iJ S o u t h e a s t U n i v Me d S c E d 2 。 1 5 ， J u n ； 3 4 3 3 8 。 3 8 2 ＼ 一 ⋯’ ‘ ’ ’ ， ‘ ⋯一 2 0 0 9， 1 1 1 5 1 5 5 ． [ 8 ]MA K， C H A N C K， L I A O S ， e t a1． E l e c t r o s p u n n a n o fi b e r s c a f - f o l d s f o r r a p i d a n d r i c h c a p t u r e o f b o n e ma r r o w。 d e ri v e d h e ma t o poi e t i e s t e m c e i l s[J ] ．B i o m a t e r i al s ， 2 0 0 8 ， 2 91 3 2 0 9 6 - 2 1 0 3 ． [ 9 ]L E E J ， T A E G， K I M Y H， e t a1． T h e e ff e c t o f g e l a t i n i n c o r p o r a t i o n i n t o e l e c t r o s p u n p o l y L ’ l a c t i d c C O ‘ e p s i l o n 。 c a p r o l a c t o n e f i b e r s o n m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s a n d c y t o c o m p a t i b i l i t y [ J ] ． B i o ma t e ri als ， 2 0 0 8 ， 2 9 1 2 1 8 7 2 1 8 7 9 ． [ 1 0 ]H O R A N R L ， A N T L E K， C O L L E T T E A L ， e t a 1 ． ／ n v i t r o d e g r a d a t i o n o f s i l k fi b r o i n[ J ] ． B i o ma t e r i a l s ， 2 0 0 5 ， 2 6 1 7 3 3 8 5 3 3 9 3 ． [ 1 1 ]M U R P H Y A R， J O H N P S ， K A P L A N D L ． Mo d i f i c a t i o n o f s i l k fi b r o i n u s i n g d i a z o n i u m c o u p l i n g c h e mi s t r y a n d t h e e f f e c t s o n h MS C p r o l i f e r a t i o n a n d d i ff e r e n t i a t i o n [ J ] ． B i o ma t e r i a l s ， 2 0 0 8 ， 2 9 1 9 2 8 2 9 ‘ 2 8 3 8 ． [ 1 2 ]ME I N E L L ， H O F M A N N S ， K A R A G E O R G I O U V， e t a 1 ． T h e i n fl a mm a t o r y r e s p o n s e s t o s i l k f il ms i n v i t r o a n d i n v i v o [ J ] ． B i o m a t e r i als ， 2 0 0 5 ， 2 6 2 1 4 7 ’ 1 5 5 ． [ 1 3 ]K E U N K I ， K I D O A K I S ， MA T S U D A T ． E l e c t r o s p u n n a n o - t o mi c r o fi b e r f a b ri c s ma d e o f b i o d e g r a d abl e c o pol y e s t e r s s t r u c t u r a l c h a r a c t e ris t i c s ， me c h a n i c a l p r o p e rt i e s a n d c e l l a d h e s i o n p o t e n t i al[ J ] ． B i o ma t e r i a l s ， 2 0 0 5， 2 6 1 8 3 9 2 9 3 9 3 9 ． [ 1 4 ]何晓敏， 付炜 ， 王浩 ， 等． 利用 C o l l a g e n ／ P L C L复合纳米纤 维电纺膜构建组织工程化气管补片的初步研究[ J ] ． 中华 临床医师杂志 电子版， 2 0 1 2 ， 6 2 2 7 0 9 5 - 7 0 9 9 ． [ 1 5 ]K I M B S ， MO O N E Y D J ． D e v e l o p me n t o f b i o c o m p a t i b l e s y n t h e t i e e x t r a c e l l u l a r ma t ri c e s for t i s s u e e n g i n e e ri n g [ J ] ． T r e n d s B i o t e c h n o l ， 1 9 9 8 ， 1 6 5 2 2 4 - 2 3 0 ． [ 1 6 ]李纲 ， 钱婷婷， 洪佳旭， 等． 丝素蛋白和乳酸 己内酯共聚 物纳米纤维支架构建组织工程化角膜上皮 的实验研究 [ J ] ． 中国眼耳鼻喉科杂志， 2 0 1 3 ， 1 3 2 9 6 9 9 ． [ 1 7 ]钱卫庆， 王宸， 陈昌红． B c P ／ H A F G - 一 r h B MP 2复合人工骨 修复骨缺损 的实验研究 [ J ] ． 现代 医学， 2 0 0 7 ， 3 5 4 2 6 5 - 2 7 0 ． [ 1 8 ]B O D D E E W， S P A U WE N P H， MI K O S A G， e t a 1 ． C l o s i n g c a p a c i t y o f s e g m e n t a l r a d i u s d e f e c t s i n r a b b i t s [ J ] ． J B i o m e d Ma t e r R e s A， 2 0 0 8 ， 8 5 1 2 0 6 - 2 1 7 ． 论 著 上海市 5 7 9 4 9名健康体检者贫血情 况调查 王海旭 ， 吴建峰 ， 黄丽丽， 韩振格 华东疗养院 检验科 ， 江苏 无锡2 1 4 0 6 5 [ 摘要]目的 分析健康体检者贫血的发生情况， 为健康评估和管理提供依据。方法 采取整群分层方法， 将 体检者按年龄分为 ≤2 9岁组 、 3 0～ 3 9岁组、 4 O～4 9岁组 、 5 0 5 9岁组和 ≥6 O岁组。比较各组的贫血检 出 率、 贫血严重程度和 贫血分类情况。结果 5 7 9 4 9名体检者共检 出贫血患者 1 0 8 8名 ， 检 出率为 1 ． 8 8 ％。男 性贫血检出率为 0 ． 4 4 ％ 1 6 6 ／ 3 7 9 0 4 ， 且随着年龄增大， 贫血栓 出率有增高趋势。女性贫血检 出率为 4 ． 6 0 ％ 9 2 2 ／ 2 0 0 4 5 ， 明显高于男性 1 2 3 2 ． 6 4， P 0 ． 0 0 1 ； 而且随着年龄增大贫血检 出率增高， 至更年 期前后 4 0 4 9岁 达最高 8 ． 5 2 ％ ， 之后明显下降。男女均 以轻度 贫血为主， 占8 1 ． 4 3 ％ 8 8 6 ／ 1 0 8 8 ， 贫 血者中8 2 1名可以按 M C H、 MC HC和 M C V进行分类 ， 其中 6 5 ． O 7 ％ 为小细胞低 色素性 贫血 ， 其次是正细胞 性贫血 占7 ． 0 8 ％ 。结论 在体检人群 中， 贫血是女性较为常见的疾病 ， 应定期进行血 常规检 查， 以便早期 发现并及时治疗。 [ 关键词]贫血； 血常规； 健康体检 [ 中图分类号]R 4 4 6 ． 1 1 [ 文献标识码] A [ 文章编号]1 6 7 1 。 6 2 6 4 2 0 1 5 0 3 0 3 8 0 0 3 d o i 1 0 ． 3 9 6 9 ／ j ． i s s n ． 1 6 7 卜6 2 6 4 ． 2 0 1 5 ． 0 3 ． 0 1 1 [ 收稿日期] 2 0 1 4 1 2 一 O l [ 修回日 期] 2 0 1 5 。 0 2 ’ 1 4 [ 作者简介]王海旭 1 9 7 8一 ， 男 ， 江苏无锡人 ， 检验技师 。E m a i l 3 0 9 5 3 1 3 4 q q ． c o rn [ 通信作者] 韩振格E m a i l 2 2 6 4 9 0 9 7 9 8 q q ． c o rn [ 引文格式]王海旭， 吴建峰， 黄丽丽， 等． 上海市 5 7 9 4 9 名健康体检者贫血情况调查[ J ] ． 东南大学学报 医学版， 2 0 1 5 ， 3 4 3 3 8 0 。 3 8 2