PLC+delta1基因在上皮性卵巢肿瘤中的表达和临床意义.pdf

第 3 l 卷第 4期 2 0 1 0年7月 中山大学学报 医学科学版 J O U R N A L O F S U N Y A T S E N U N I V E R S I T Y ME D I C A L S C I E N C E S V0 l _ 3 1 No ． 4 J u 1 ． 2 0 1 0 P L C d e l t a l 基因在上皮性卵巢肿瘤中的表达和临床意义 何剑辉 ， 一 ，杨国奋 H，蔡木炎 ， ，谢丹 1 ． 中山大学附属第一医院妇科 ， 广东 广州 5 1 0 0 8 0 ；2 ． 广东省人民医院妇产科， 广东 广州 5 1 0 0 8 0 ； 3 ． 中山大学肿瘤防治中心∥华南肿瘤国家重点实验室，广东 广州 5 1 0 0 6 0 摘要【 目的】 本研究旨在探讨 P L C d e l t a l在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其临床意义。 【 方法 】 采用免疫组化方法 ， 检 测 P L C d e l tal 在 2 2 3例上皮性卵巢肿 瘤 1 8 3例卵巢癌 和对照组 4 0例交界性 卵巢肿瘤 组织 芯片 中的表达 结合 患者 的临床 资料 ， 分析 P L C d e h a l 的表达与上皮性卵巢癌的关系。【 结果 】 在有效检测的 1 9 7例上皮性卵巢肿瘤标本中， 大多数 2 5 例 ， 8 0 ． 6 ％ 交界性肿瘤呈现正常表达， 而在卵巢癌中， 多数 9 1 例 5 4 ． 8 ％ 肿瘤出现 P L C d e l t a l 的过度表达 。 两者存在显著差异 J P 0 ． 0 0 0 1 ； 而且 P L C d e l ta l 在卵巢癌中表达与肿瘤的临床分期、 患者年龄有显著的相关性 P0 ． 0 0 0 1 。 【 结论】 P L C d e l t a l 在卵巢癌组织中的过度表达与肿瘤的恶性进展密切相关 ， 可能是未来检测卵巢癌的一种有价值的新肿瘤标志物。 关键词卵巢肿瘤 ；P L C d e l t a l ；癌基因 中图分类号 R 7 3 7 。 3 1 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 2 3 5 5 4 2 0 1 0 0 4 ． o 5 4 0 一 o 5 P LC De l t a 1 E x p r e s s i o n i n Ep i t h e l i a l Ov a r i a n T u mo r a n d I t s Cl i n i c a l S i g n i fi c a n c e HE J i a n h u i 一 ，ANG Gu o - F e n ，C AI Mu y a h 。 ，XI E Da n 1 ． D e p a r t m e n t o f G y n e c o l o g y ， T h e F i r s t A ff i l i a t e d H o s p i t a l ，S u n Y a t s e n U n i v e r s i t y ，G u a n g z h o u 5 1 0 0 8 0 ， C h i n a ； 2 ． De p a r t me n t o f G y n c o l o g y ，Gu a n g d o n g g e n e r a l h o s p i t a l ，G u a n g z h o u 5 1 0 0 8 0，Ch i n a ； 3 ． S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f O n c o l o g y i n S o u t h e r n C h i n a ffC a n c e r C e n t e r ， S u n Y a t - s e n U n i v e r s i t y ，G u a n g z h o u 5 1 0 0 6 0 ， C h i n a A b s t r a c t 【 O b j e c t i v e 】T o i n v e s t i g a t e t h e e x p r e s s i o n o f P L C d e l t a 1 i n e p i t h e l i a l o v a ri a n t u mo r a n d i t s c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e ． 【 M e t h o d 】 E x a m i n a t i o n o f P L C d e l t a 1 e x p r e s s i o n i n t h e t i s s u e m i c r o a r r a y a m o n g 2 2 3 c a s e s o f e p i t h e l i a l o v a r i a n t u m o r i n c l u d i n g 1 8 3 c a s e s o f o v a ri a n c a n c e r a n d t h e c o n t r o l g r o u p，4 0 o f b o r d e d i n e o v a r i a n t u m o r ，u s i n g i mm u n o h i s t o c h e m i s t ry m e t h o d ． S u b s e q u e n t a n a l y s i s w a s c o n d u c t e d t o r e v e al t h e r e l a t i o n s h i p b e t we e n P L C d e l t a 1 e x p r e s s i o n a n d t h e o c c u r r e n c e o f e p i t h e l i al o v a r i a n c a n c e r ． 【 R e s u l ts 】A m o n g 1 9 7 v a l i d s a m p l e s ， m o s t o f t h e b o r d e r l i n e t u m o r c a s e s 2 5 s a m p l e s ， 8 O ． 6 ％i n d i c a t e d n o r m al e x p r e s s i o n o f P L C d e l ta 1 ；m o s t o f t h e o v a ri a n c a n c e r c a s e s 9 1 s a mp l e s ， 5 4 ． 8 ％ ， o n t h e o t h e r h a n d ， i n d i c a t e d o v e r e x p r e s s i o n o f P L C d e l ta 1 ． T h e s t u d y a l s o f o u n d a s i g n i fi c a n t d i ff e r e n c e i n P L C d e l t a 1 e x p r e s s i o n P 0 ． 0 0 0 1 b e t we e n t h e t w o t y p e s o f c a s e s ． Al s o ，t h e re i s a s i g n i fi c an t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e P L C d e l t a 1 e x p r e s s i o n i n t h e o v a r i a n c a n c e r c a s e s a n d t h e i r c l i n i c al s t a g e s ，a s w e l l a s t h e a g e o f t h e p a t i e n t s P0 ．0 0 0 1 ． 【 C o n c l u s i o n 】 T h e o v e r e x p r e s s i o n o f P L C d e l t a 1 i n t h e o v a r i a n c a n c e r t i s s u e i s c l o s e l y r e l a t e d t o t u mo r ma l i g n a n c y，s u g g e s t i n g t h a t P L C d e l t a 1 c o u l d b e a n o t h e r e ff e c t i v e ma r k e r f o r the d i a g n o s i s o f o v a r i an c a n c e r ． Ke y wo r d so v a r i a n t u mo r ；P L C d e l ta 1 ；c a n c e r g e n e s [ J S U N Y a t s e n U n i v Me d S c i ， 2 0 1 0 ， 3 1 4 5 4 0 5 4 4 ] 卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤 ， 发病 年龄 以 5 0岁左右 为高峰。 由于卵巢肿瘤发病 隐 匿 ， 早期诊断困难 ， 大多数 约 7 0 ％ 卵巢癌患者在 初诊时已是浸润晚期 F I G O III 或Ⅳ期 的肿瘤 ， 其 5 年生存率不超过 3 0 ％， 死亡率居妇科恶性肿瘤的 首位[ 。在我 国， 卵巢癌 的发病呈上升趋势 ， 在一 些大城市如上海今年的卵巢癌发病率达 6 ． 9 ／ 1 0 万[ 引 ． 成为危害女性生命健康的主要“ 杀手” 之一 。 收稿 日期 2 0 1 0 0 3 2 5 基金项目 广东省科技计划项目 2 0 0 4 B 3 5 0 0 1 0 0 4 作者简介 何剑辉 ， 妇科在职硕士研究生， 医师， 工作单位 广东省医学科学院广东省人民医院妇产科 ， 研究方向妇科肿瘤， E ． m a i l j e ff y h o 1 6 3 ．c o rn； 通信作者 杨国奋， 副教授， 硕士导师， 研究方向妇科肿瘤， E m a i l p g f _ y a n g 1 2 6 ．t o m 第 4期 何剑辉， 等． P L C d e l t a l 基因在上皮性卵巢肿瘤中的表达和临床意义 5 4 1 众所周知，卵巢癌的发生发展是一个多基因改变 多步骤的复杂过程[ 引 。因此 ， 卵巢癌密切相关基 因 的分子致 癌机制及 其 临床 肿瘤 学意 义的深 入研 究 ，将对加强和促进卵巢癌 的防治工作 提供实验 研究的基础。目前 ， 越来越多的新基 因如 R U N X1 、 T A C C 1 、 D e l t a T A p 7 3 、 c l u s t e r i n 、 T H Y 1及 Y K L 一 4 0蛋 白等异常已被证 实与卵巢癌 的发生发展和预后密 切相关 [ 4 _ 。人类 P L C d e l t a l基 因定位于染 色体 3 p 2 2 ， 包括 l 6个外 显子 ， 编码 7 5 6个氨基 酸的蛋 白质。P L C d e h a l是哺乳动物 中磷酸肌醇 P L C大 家庭 中的一员。P L C d e l t a 1的表达水平 、 调节机理 和生物学特征已经被广泛研究 。 但是 ， 该基因在癌 症发生 、 发展中的作用研究很少 。国外有学者研究 发现 ， P L C d e l t a l与食 管鳞癌 [ ] 和结肠癌[ 。 ] 的恶性 进展密 切相关 。 目前 ，国内外 暂 时还没 有关 于 P L C d e h a l在上 皮性 卵 巢肿 瘤 中表 达 的相关 研 究 。 因此 ， 本研究 旨在初步探讨 P L C d e l t a 1在上 皮性卵巢肿瘤 中的表达情况及其临床意义。 1 材料 与方法 1 ． 1 材料 选取 1 9 9 4年至 2 0 0 3年 问在 中山大学附属第 一 医院妇产科 接受 手术治疗 的上 皮性 卵巢肿 瘤 患者 2 2 3例 术前 均未行放化疗 或生物治疗 ， 收 集其临床病理资料。其中卵巢癌患者 1 8 3例， 交 界性卵巢肿瘤患者 4 0例 。本 组上皮性 卵巢 癌患 者 的中位 年龄为 5 0 ． 5岁 ，其 中浆液性 腺 癌 1 2 0 例 、 粘液性腺癌 2 3例 、 其它类型肿瘤 4 O例 在肿 瘤 的 S i l v e r b e r g氏分级 中， 3 6例是 G1 级 卵巢 癌 、 1 0 4例 为 G 2级卵巢癌 、 4 3例为 G 3级卵巢癌 。临 床分期按 国际 F I G O分期标准 I 期 3 5例 。 Ⅱ期 2 1 例 ， Ⅲ期 1 0 1 例 ， Ⅳ期 2 6例 。 所有组织标本均再 次切片 H E染色证实诊断。同时选取 2 0例非卵巢 疾病 如子宫肿瘤等 手术切除的正常卵巢组织作 为实验对照组 标本 经 4 0 g ／ L多聚 甲醛 溶液 固 定 ， 常规石蜡包埋 。 1 ． 2 主要仪器和试剂 仪器 组织芯片制作机为美 国 N I H国家人类 基因研究所肿瘤遗传实验室制造 。石蜡切片机购 自 德国L e ic a 公司。 显微镜及显微摄像装置为 日本 O l y mp u s 公司产品 。试 剂 P L C d e h a l的多克隆抗 体购 自S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y ．I n c 1 ． 3组织芯片的制作及结果判断 首先在显微镜下对 “ 供体” 蜡块 的切片选 出典 型病变部位 ， 然后从“ 供体” 蜡块标本 中取 出所需 组织 每例肿瘤选定 2个不 同取样 位点 ，取样确 保组织的代表性 ， 插入 “ 受体 ” 蜡块 的洞 内 ， 排列 成微组织阵列 ， 制成组织芯片蜡块 。 用切片机对组 织芯片蜡块进行 连续切 片 。 厚 约 4 ix m， 选取石蜡 切片作 H E染色 ，检查每一点是否 与设计阵列 中 的组织一致 。组织芯片石蜡切片作 H E染色后 ， 对 组织芯片阵列 中的每一点在显微镜下进行观察与 核对 ，为保证实验结果的可靠性组织芯片中若存 在以下情况之一 即予剔 出 组织定位与取材 的偏 差导致无效组织过多 ， 有效细胞数过少 ， 缺乏代表 性 组织芯 片脱片 ， 即制片过程 中组织芯的移位或 脱落 ； 记录被剔除的组织芯所在阵列 ， 在下一步实 验将不列入观察统计。 1 ． 4 免疫组织化学染色 采用免疫组化染色二步法 。 首先 ， 将制作成的 组织芯片脱蜡 至水 ，然后放人 3 mL ／ L H 2 0 甲醇 液 中 2 0 mi n 室温 。 接着蒸馏水洗后 ， 放入抗原修 复液 p H 6 ． O 内微波修复 2 0 m i n 。p H 7 ． 2 P B S缓 冲液洗 3次 ， 滴加正常血清 3 7℃， 放置 2 0 m i n ； 甩 去多余血 清后 ，将其放人 P L C d e l t a 1的多克 隆抗 体 中， 4 c I 过夜。p H 7 ． 2 P B S缓冲液洗 3次后 ， 放 入 1 2 0 0的二抗液体中， 3 7℃下放置 3 0 m i n 。p H 7 ． 2 P B S缓 冲液洗 3次 ， D A B显色 5 m i n ， 水洗后 ， 苏木素淡染 ， 蓝化 ， 脱水 ， 透 明， 封固 图 1 。结果 观察采用半定量 的 9分法 按染 色的强度 ． 阴性染 色记 为 0分 ， 弱 阳性染 色 1分 ， 中度 阳性 2分 ， 强 阳性 3分。 按 阳性细胞数 ，4 0 0倍显微镜下每例 观察 5个视野 ， 每个视野 1 0 0个细胞 ， 计数染色阳 性细胞数 ， 当阳性 细胞 数少于 1 ％时 ， 为 0分 ； 1 ％ 一 3 0 ％为 1 分 ； 3 1 ％ ～7 0 ％为 2分 超过 7 0 ％为 3 分 。将 两者 的积 分相乘 即 0～9分 ， 记 录染 色 结果 。 1 ． 5 统计学方法 采用 S P S S 1 0 ． 0统计软件进行统计处理。 计数 资料采用 x 检验 。所有检验结果以 P0 ． 0 5为有 统计学意义 。 2 结 果 在本组 2 2 3例上皮性卵巢肿瘤组织中 ， 有 1 6 6 5 4 2 中山大学学报 医学科学版 第 3 1 卷 图 1 免疫组化染 色后 的组织芯 片 Fi g． 1 Ti s s ue m i c r oa r r ay s t ai n ed b y E a c h c a s e g e t t w o t i s s u e s t i s s u e s o f o v e r i a n c a n c e r s a r e o n t h e l e ft s i d e ， a n d t h e t i s s u e s o f b o r d e r l i n e t u mo r s a r e o n t h e r i g h t s i d e ． 例卵巢癌标 本和 3 1 例交 界性卵巢肿 瘤标本威 地进行了 P L C d e h a l 免疫组化检测 1 7例卵 标 本和 9例交 界性 肿瘤标 本无效 检测 的病 仍 组 织芯 片取材 代表 性不 足或芯 片组 织脱 落而 剔 除 。 因为 2 0例 正 常卵巢组 织均 呈 P L C d e l t a 1 水平的表达 ， 根据半定量积分法 ， 表达积分均f f { 2分 图 2 ， 所以我们定义染色积分小于 2分 性 ， 正 常表达 ； 大 于 2分则判 为 阳性 ， 过度 表乏 2 ． 1 P L C d e l t a l在上皮性卵巢肿瘤 中表达情； j P L C d e h a l在卵巢上皮性肿瘤 组织 中的薏 是经免疫组化染色后胞浆 内呈现棕黄色颗粒 。 半定量 的 9分法积分标准观察 ，有效检测的 肿瘤标本 中 ．我们发现 P L C d e h a l 在 卵巢癌缍 中的表达 明显高于交界性 卵巢肿瘤 大多数 图 2 P L C d e l tal在正 常卵巢组织 中的表 达 F i g ． 2 P L C d e l tal e x p r e s s i o n i n n o r ma l o v a r i a n t i s s u e 2 0 0 图 3 P L C d e l tal 在 交界性肿瘤 中的表达 F i g ． 3 P L C d e l tal e x p r e s s i o n i n b o r d e r l i n e o v a r i a n t u mo r s 2 0 0 图 4 P L C d e i tal 在 卵巢癌 中的表达 F i g ． 4 P L C d e l tal e x p r e s s i o n i n o v a da n c a n c e r 2 0 0 J 界性卵巢肿瘤 2 5例 ， 8 0 ． 3 ％表现为 P L C d e h a l 正 常表 达 图 3 ； 而 多 数 的卵 巢癌 组 织 9 1例 ， 5 4 ． 8 2 ％ 则 呈 P L C d e l t a l的过度 表 达 图 4 ； 两 者之 间存在 显著差 异 x 1 3 ． 1 4 5， P 0 ． 0 5 。 3讨论 人类 P L C d e h a l基因定位于染 色体 3 p 2 2 ， 包 括 1 6个外显 子 ，编码 7 5 6个 氨基 酸 的蛋 白质 。 P L C d e h a l是哺乳动物 中磷酸肌醇 P L C大家庭 中 的一员，它主要存在于静止期细胞的细胞膜上和 胞浆 中。 P L C d e l t a l 可以与具有 Ⅱ型转谷氨酰胺酶 t r a n s g l u t a m i n a s 1 1，T G I I 活性 的 G 能够结合 并活化[ 9 ] ； 另外 ， R h o A特异性 的 p 1 2 2 G T P酶活化 蛋 白 p 1 2 2 G A P 也 能够活化 P L C d e l t a l [ m ； G i ／ G o 蛋白偶联受体激动剂能够通过 C a 2 介导激活 P L C d e h a l [ 川。这些激活的 P L C d e h a l 可 以水解小 分子 的脂质混合 物和 P I P 2 ， 同时释放第二信使 ， 如 可以使钙离子从细胞 内释放 出来 的 I P 一 3 ．可 以介 导 P K C激活 的二 酰基甘油[ 1 2 - 1 3 3 。 进 而将 细胞外的 信息传递给下游的效应分子， 调节生命活动。 在本研究中 ．我们采用免疫组织化学染色的 方法 ．检测 了卵巢肿瘤组织 中 P L C d e h a l的表 达 水平。结果发现 ， P L C d e h a l 在 卵巢癌的过度表达 率明显高于交界性卵巢肿瘤。提示 P L C d e l t a 1 在 上皮性卵巢肿瘤组织 中的表达上调与肿瘤的恶性 程度有关 。另外 ， 在本组卵巢癌组织 中 ， 我们发现 P L C d e h a l 过度表达率随着卵巢癌的临床分期的 进展 而增高。这一观察结果提示 P L C d e h a l 在卵 巢癌组织 中的过度表达与肿瘤 的恶性进 展密切相 关 ，可 以作为临床上评估卵巢癌有价值 的候选肿 瘤标志物。同时 ， 我们还观察到 P L C d e l t a l 的表达 与年龄相关 年龄越小表达越活跃。这可能与年轻 患者 的卵巢组织 生长活跃有关 。目前 ，关于 P L C d e h a l 在肿瘤发生发展 中的分子机制还很不清楚 。 S t a l l i n g s等[ ] 研究发现 ， 在真核生物细胞 中， 抑制 P L C d e h a l的表 达 ，可 以通 过对 细 胞周 期 中的 c y c l i n E的调控 ，从 而 抑制 细 胞 的增 殖 K a p r o t h J o s l i n等 l 1 5 ] 的研究也表 明 ， P L C d e l t a l可以通 过激 活 c y c l i n E ． C D K 2活性和增加 P 2 7水平 ． 促进细胞 周期从 Gl 期进入 S期 ， 从而促进细胞的增殖 。因 此，我们推测 P L C d e h a l 在卵巢癌组织中的表达 上调 ， 可能通过对细胞周期 的调控 ， 从而促进肿瘤 细胞的增殖 和恶性进展。显然 ， P L C d e l t a l在卵巢 癌发生发展 中的确切分子机制 ．尚有待进一步 的 研 究 参考文献 [ 1 ] Wa l s h J M，D o l a n N C，C h a me y P ，e t a 1 ．U p d me i n w o me n ’ S h e a l t h[ J ] ．A n n I n t Me d ，2 0 0 0 ，1 3 3 1 0 8 08 -8 1 4． [ 2 ] 刘恩菊 ， 项永兵， 金凡 ， 等． 上海市区恶性肿瘤发病趋 势分析 1 9 7 2 1 9 9 9年[ J ] ． 肿瘤． 2 0 0 4 ， 2 4 1 1 1 - 1 5 ． [ 3 ] Me n o n U，J a c o b s J ．R e c e n t d e v e l o p me n t s i n o v a r i a n c a n c e r s c r e e n i n g[ J ] ． C u r r O p i n O b s e t e t G y n a e c o l ， 2 0 0 0，1 2 1 3 9 4 2 ． 5 4 4 中山大学学报 医学科学版 第 3 1 卷 上接第5 2 9页f r o m p a g e 5 2 9 t r e a t e d b y r a d i o c h e m o t h e r a p y[ J ] _ G y n e c o l o g i c o n e o l o g y ， 2 0 0 7 ，1 0 6 1 8 - 1 1 ． [ 1 0 ]L i a o Y，A b e l U，G r o b h o l z R，e t a1． U p r e g u l a t i o n o f i ns u l i n l i k e g r o wt h f a c t o r a x i s c o mp o ne n t s i n hu ma n p r i ma r y p r o s t a t e c a n c e r c o r r e l at e s wi t h t u mo r g r a de [ J ] ． Hu m P a t h o l ，2 0 0 5 ， 3 6 1 1 1 1 8 6 - 1 1 9 6 ． [ 1 1 ]H a y d o n A M， M a c i n n i s R J ， E n g l i s h D R， e t a 1 ． P h y s i c a l a c t i v i t y ， i n s u l i n - l i k e gro w t h f a c t o r 1 ， i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n 3， a n d s u r v i v a l f r o m c o l o r e e t a l c a n c e r[ J ] ． G u t ， 2 0 0 6 ， 5 5 5 6 8 9 6 9 4 ． [ 1 2 ]K a u l s a y K K，N g E H， J i C Y，e t a 1 ． S e r u m I G F b i n d i n g p r o t e i n 一 6 a n d p r o s t a t e s p e c i f i c a n t i g e n i n b r e a s t c a n c e r [ J ] ． E u r J E n d o c r i n o 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o e h e mi c a l s t u d y[ J ] ． A r c h P a t h o l L a b M e d ，2 0 0 3 ，1 2 7 1 1 1 4 8 0 1 4 8 4 ． 编辑徐杰