高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测土壤中的无机硒形态_秦冲.pdf

2018 年 11 月 November 2018 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 37，No． 6 664 －670 收稿日期 2018 －03 －20; 修回日期 2018 －05 － 02; 接受日期 2018 －07 －09 基金项目 河北省地质矿产勘查开发局科技项目 201827 作者简介 秦冲， 工程师， 主要从事地质实验测试工作。E- mail qinchong0013163． com。 通信作者 施畅， 工程师， 主要从事地质实验测试工作。E- mail shichang1218163． com。 秦冲，施畅，万秋月， 等． 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱联用检测土壤中的无机硒形态［ J］ ． 岩矿测试， 2018， 37 6 664 －670． QIN Chong，SHI Chang，WAN Qiu- yue，et al． Speciation Analysis of Inorganic Selenium in Soil by High Perance Liquid Chromatography- Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry［ J］ ． Rock and Mineral Analysis， 2018， 37 6 664 －670． 【DOI 10． 15898/j． cnki． 11 －2131/td． 201803200024】 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱联用检测土壤中的 无机硒形态 秦冲，施畅*，万秋月，王磊，刘爱琴，安彩秀 河北省地质实验测试中心，河北 保定 071051 摘要 土壤样品中亚硒酸盐 Se Ⅳ 和硒酸盐 Se Ⅵ 的形态分析中， 提取剂的选择和检测方法是技术的关 键。以往的提取剂容易导致硒形态发生转变或无法同时提取 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ ， 常用的氢化物发生原子荧 光光谱法无法直接测定 Se Ⅵ ， 而是通过差减法得出 Se Ⅵ 含量。本文对比了不同提取剂的提取能力， 确 定使用 0． 1 mol/L 氢氧化钠溶液作为提取剂， 在 55℃超声萃取土壤样品 30 min， 提取液经高效液相色谱分 离， 电感耦合等离子体质谱检测， 建立了土壤中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的形态分析方法。采用 Hamilton PRP X －100色谱柱， 以 6 mmol/L 柠檬酸为流动相， pH 5． 5， 在 8 min 内可完全分离 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ ， 两者的检 出限分别为 0． 15 μg/L、 0． 16 μg/L， 线性相关系数 r2 均大于 0． 999。以土壤为基体进行加标回收试验， Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的回收率在 84． 2 ～95． 8 之间， 相对标准偏差为 1． 4 ～5． 3 n 6 。该方法简单快 速， 具有良好的精密度和准确度， 适用于土壤中无机硒的形态分析。 关键词 土壤; 亚硒酸盐; 硒酸盐; 氢氧化钠; 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法 要点 1 氢氧化钠溶液作为土壤中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的提取剂。 2 硒形态萃取方式选用超声萃取。 3 HPLC － ICP － MS 用于 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的形态分析。 中图分类号 O655． 6; O657． 63文献标识码 A 硒是人体必需的微量元素之一， 是组成谷胱甘 肽过氧化酶的重要成分， 具有延缓衰老、 抗癌防癌、 提高免疫力、 拮抗重金属毒性、 清除人体内有害自由 基等功能 ［1 －5 ］。同时硒是典型的双功能元素之一， 其生理需求量范围比较窄， 日摄入量过低， 会导致硒 缺乏症; 日摄入量过高又会导致硒中毒 ［6 －9 ］。土壤 中的硒被植物吸收后， 通过食物链被人体吸收利用， 这是人体中硒最主要的来源 ［10 ］。植物对硒的吸收 效果不仅取决于硒的总量， 而且与硒的化学形态密 切相关 ［11 －12 ］。亚硒酸盐 Se Ⅳ 和硒酸盐 Se Ⅵ 能够溶于水或吸附在土壤表面， 植物利用率最 高 ［13 －14 ］， 而元素态硒和硒化物不能溶于水， 植物利 用率较低 ［15–16 ］， 因此土壤中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的形 态分析具有重要意义。 分析土壤样品中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 形态时， 要 选择合适的提取剂将其提取出来， 同时保持硒形态 不变。针对土壤中硒的提取， 目前多采用连续浸提 法测定土壤中水溶态硒、 离子交换态硒、 碳酸盐结合 466 ChaoXing 态硒、 腐殖酸结合态硒、 铁锰结合态硒、 强有机结合 态硒和残渣态硒 ［17 －19 ］， 但连续浸提法提取步骤复 杂， 容易导致硒的损失及形态的转变， 只能测定每一 态提取液中硒元素的总量。土壤有效硒的提取剂最 常用的是磷酸盐 如磷酸二氢钾 ［20 －22 ］， Stroud 等 ［23 ］用磷酸二氢钾提取土壤中的有效硒， 并测定了 提取液中的硒形态， 研究发现提取液中只存在 Se Ⅳ 。对于土壤样品中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的测 定， 目前应用最多的是氢化物发生原子荧光光谱法 HGAAS ［24 －26 ］， 但该方法无法同时测定 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ ， 而是分别测定出 Se 总量和 Se Ⅳ 含量， 再 通过差减法得出 Se Ⅵ 含量， 分析步骤比较复杂。 本文以土壤样品为研究对象， 在文献已知的提 取剂中， 通过实验最终选择能够同时提取 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 且提取效果最好的氢氧化钠溶液作为提取 剂， 优化了超声萃取条件和高效液相色谱 HPLC 分离条件， 建立了应用高效液相色谱 － 电感耦合等 离子体质谱 HPLC － ICP － MS 联用技术同时测定 提取液中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 两种无机硒形态的分析 方法。 1实验部分 1． 1仪器及主要试剂 电感耦合等离子体质谱 仪 7700 型， 美 国 Agilent 公司 ; 高效液相色谱仪 1200 型， 美国 Agilent 公司 ; PRP X － 100 分析柱 250 mm 4． 1 mm 10 μm， 瑞士 Hamilton 公司 ， PRP X － 100 保 护柱 20 mm 2． 1 mm， 10 μm， 瑞士 Hamilton 公 司 ; 色谱柱与 ICP － MS 雾化器用 PEEK 管连接。 MARS 微波消解系统 美国 CEM 公司 。超声 波清洗仪 SB － 1000DYD 型， 宁波新芝生物科技股 份有限公司 。真空冷冻干燥机 LGJ －30FD 型， 北 京松源华兴科技发展有限公司 。 硒酸根标准溶液 GBW10033 、 亚硒酸根标准 溶液 GBW10032 购自中国计量科学研究院。质 谱调谐液 美国 Agilent 公司 为 Li、 Y、 Ce、 Tl、 Co 浓 度都为 1 μg/L 的混合标准溶液。柠檬酸、 氨水、 氢 氧化钠均为分析纯。 实验用水为超纯水。 1． 2仪器工作条件 液相色谱工作条件 色谱柱 Hamilton PRP X － 100 分析柱 250 mm 4． 1 mm 10 μm， 瑞 士 Hamilton 公司 ; 保护柱 Hamilton PRP X －100 保护 柱 20 mm 2． 1 mm 10 μm， 瑞士 Hamilton 公司 ; 流动相为 6 mmol/L 柠檬酸 用氨水调节 pH 为 5． 5 ， 流速为 1． 5 mL/min; 进样体积 100 μL。 ICP － MS 工作条件 射频功率 1350 W; 等离子 体气流速 15 L/min; 辅助气流速 1． 0 L/min; 积分模 式为峰面积; 监控元素为77Se 和82Se。 1． 3土壤样品前处理 土壤样品采集自京津冀地区， 样品经冻干后研 磨， 过 100 目筛， 置于 4℃冰箱中避光保存。 超声萃取测定硒形态 称取 1． 0000 g 上述样品 于离心管中， 加入 10． 00 mL 0． 1 mol/L 氢氧化钠溶 液， 混匀， 放入超声波清洗仪内， 控温 55℃超声萃取 30 min。超声后以 6000 r/min 转速离心 5 min， 上清 液过 0． 45 μm 水性滤膜， 按照 1． 2 节仪器工作条件 进行硒形态分析。同样方法做试剂空白实验。 微波消解测定总硒 按照土壤和沉积物汞、 砷、 硒、铋、锑 的 测 定 微 波 消 解/原 子 荧 光 法 HJ6802013 测定上述样品硒总量。具体方法如 下 称取 0． 2000 g 上述样品于消解罐中， 加入 6 mL 浓盐酸和 2 mL 浓硝酸， 采用如下程序进行微波消 解 5 min 升温到 100℃保持 2 min， 然后 5 min 升温 到 150℃保持 3 min， 最后 5 min 升温到 180℃ 保持 25 min。消解结束后冷却， 打开消解罐， 将样品溶液 转移至25 mL 容量瓶中， 用超纯水洗涤3 次， 合并洗 涤液， 再用超纯水定容并摇匀， 使用原子荧光光度计 测定硒总量。同样方法做试剂空白实验。 2结果与讨论 2． 1硒形态分离条件的选择 2． 1． 1流动相的类型 在硒形态分析中， 常用到磷酸二氢铵、 烷基磺酸 钠等混合离子对试剂作为流动相， 并添加少量甲醇 来提高分离效果， 流动相组分比较复杂。例如， 彭岚 等 ［27 ］用5 mmol/L 四丁基硫酸氢铵 －2． 5 mmol/L 磷 酸二氢铵 －5甲醇作为流动相分离测定了底泥中 的 4 种硒形态。Hsieh 等 ［28 ］用 2 mmol/L 1 － 戊磺酸 钠 －5 mmol/L 柠檬酸 － 3 甲醇和 5 mmol/L 磷酸 二氢钠 －5 mmol/L 柠檬酸 －3 甲醇作为流动相分 离测定了大米中的 5 种硒形态。为选择出成分单 一、 配制简单且无毒的试剂作为流动相， 本实验考察 了磷酸二氢铵和柠檬酸两种试剂分别作为流动相的 分离测定效果， 经研究发现使用柠檬酸作为流动相， 在 8 min 内可完全分离两种不同硒形态， 而使用磷 酸二氢铵分离需要 25 min， 因此本实验选用柠檬酸 作为流动相。 566 第 6 期秦冲， 等 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱联用检测土壤中的无机硒形态第 37 卷 ChaoXing 2． 1． 2流动相的浓度 在流动相浓度为 2 ～10 mmol/L 范围内， 考察了 柠檬酸浓度对两种硒形态保留时间的影响， 结果如 图 1a 所示。随着流动相浓度升高， Se Ⅵ 的保留 时间迅速减少; 当流动相浓度为 6 mmol/L 时， 各硒 形态的色谱峰峰形较好， 分离效果令人满意。因此 本文选择流动相浓度为 6 mmol/L， 各硒形态可在 8 min 内实现较好的分离。 2． 1． 3流动相的酸度 在不同的酸度条件下， 硒的不同形态是以阳离 子、 阴离子或者两性离子的形式存在 ［29 ］， 因此流动 相 pH 变化对 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的分离效果和保留 时间影响很大。用 20 的氨水调节柠檬酸溶液的 pH， 在 pH 为 4． 0 ～6． 5 范围内， 考察了柠檬酸酸度 对 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 保留时间的影响， 结果如图 1b 所示。随着 pH 增大， Se Ⅵ 的保留时间急剧减少; 当 pH 5． 5 时， 两种硒形态的色谱峰峰形较好， 分 离效果令人满意。因此本实验选择流动相的 pH 值 为 5． 5。 图 1柠檬酸浓度 a 、 酸度 b 对 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 保留时 间的影响 Fig． 1Effect of a concentration and b acidity of citric acid on the retention time of Se Ⅳ and Se Ⅵ 2． 2硒形态萃取条件优化 本实验以 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 阳性土壤样品为例 考察超声萃取温度及萃取时间对 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 萃取效率的影响， 实验结果如图 2a 和 b 所示。超声 萃取温度在 25 ～ 55℃ 时， 萃取液中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 含量随温度升高而提高; 萃取温度在 55 ～ 75℃时， 随着温度升高， 萃取效率几乎不变。为防止 较高的萃取温度导致硒形态发生变化， 本实验选择 萃取温度为 55℃。超声萃取时间在 10 ～30 min 时， 萃取液中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 含量随时间增长而提 高， 在 30 ～ 60 min 内随萃取时间增长， 萃取效率几 乎不变， 本实验选择萃取时间为 30 min。 图 2超声萃取温度 a 、 萃取时间 b 对 Se Ⅳ 和Se Ⅵ 萃取效率的影响 Fig． 2Effect of athe temperature and bultrasonic extraction time on the extraction rate of Se Ⅳ and Se Ⅵ 2． 3硒形态提取试剂的选择 本实验以采自不同地区的 3 个 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 阳性土壤样品进行实验， 试验了几种不同试 剂对土壤中硒形态提取效果， 包括超纯水、 0． 1 mol/L柠檬酸、 pH 7 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓 冲溶液 以下简称磷酸盐溶液 、 0． 1 mol/L 碳酸氢 钠 溶液、 0． 1mol /L氢氧化钠溶液， 实验结果列于 666 第 6 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2018 年 ChaoXing 表 1。超纯水和 0． 1 mol/L 柠檬酸溶液都无法将 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 从土壤中提取出来， 磷酸盐溶液、 碳酸氢钠溶液只能提取 Se Ⅳ ， 而氢氧化钠溶液可 有效提取 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 。实验表明， 磷酸盐溶 液、 碳酸氢钠溶液和氢氧化钠溶液提取的 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 之和分别与微波消解得到土壤中的总硒量 相比， 氢氧化钠溶液对硒提取率最高。因此， 本实验 选择使用 0． 1 mol/L 氢氧化钠溶液作为土壤中硒形 态的提取剂。 表 1使用不同提取剂提取土壤中硒形态分析结果 Table 1Analytical results of selenium species in soil extracted with different agents 土壤样品硒形态 提取剂 超纯水 柠檬酸 磷酸盐 溶液 碳酸 氢钠 氢氧 化钠 Se Ⅳ 含量 mg/kgNDND0．0550．0290．135 Se Ⅵ 含量 mg/kgNDNDNDND0．038 土壤1硒形态总量 mg/kg －－0．0550．0290．173 总硒 mg/kg0．3020．3020．302 0．3020．302 硒提取率 －－18．21 9．657．28 Se Ⅳ 含量 mg/kgNDND0．1540．1220．206 Se Ⅵ 含量 mg/kgNDNDNDND0．078 土壤2硒形态总量 mg/kg －－0．1540．1220．284 总硒 mg/kg0．3620．3620．362 0．3620．362 硒提取率 －－42．54 33．7078．49 Se Ⅳ 含量 mg/kgNDND0．0630．0350．118 Se Ⅵ 含量 mg/kgNDNDNDND0．022 土壤3硒形态总量 mg/kg －－0．0630．0350．140 总硒 mg/kg0．2180．2180．218 0．2180．218 硒提取率 －－28．90 16．0664．19 注 ND 表示未检出。 表 2Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 的线性范围、 检出限和加标回收试验 Table 2Linear ranges，detection limits and spiked recoveries of Se Ⅳ and Se Ⅵ 硒形态 线性范围 μg/L 线性方程 相关系数 r2 方法检出限 μg/L 加标回收率试验 n 6 标准加入量 mg/kg 测定值 mg/kg 回收率 RSD 00． 135－－ Se Ⅳ0．5 ～500y 667．2x 843． 80．99960．150．1000． 22387．72．5 0．2000． 32293．41．4 00． 038－－ Se Ⅵ0．5 ～500y 685．4x －233． 00．99970．160．0200． 08084．25．3 0．0500． 13495．84．2 2． 4方法技术指标 2． 4． 1标准曲线和方法检出限 分别配制 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 浓度为 0、 0． 1、 0． 5、 1． 0、 10、 100、 300、 500、 800、 1000 μg/L 的标准系列， 使用本文建立的方法进行检测， 测定结果列于表 2。 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 线性范围为 0． 5 ～500 μg/L， 相对 标准偏差 RSD， n 6 分别为 3． 1 和 2． 6， 线性 相关系数 r2 均大于 0． 999， 以 3 倍信噪比计算检 出限， Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 检出限分别为 0． 15 μg/L、 0． 16 μg/L。Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 标准溶液色谱图如图 3a 所示。 图 3标准溶液 a 和土壤样品 b 中 SeⅣ 和 SeⅥ 色谱图 Fig． 3Chromatograms of Se Ⅳand Se Ⅵ in athe standard solution and b soil sample 2． 4． 2加标回收实验 将本文建立的方法应用于土壤样品中硒形态分 析， 色谱图如图3b 所示， 对样品中 Se Ⅳ 和Se Ⅵ 进行 6 次加标回收实验的分析结果列于表 2。得到 766 第 6 期秦冲， 等 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱联用检测土壤中的无机硒形态第 37 卷 ChaoXing 的加标回收率在 84． 2 ～95． 8 之间， 回收率的相 对标准偏差 RSD 在 1． 4 ～5． 3 之间， 说明本方 法可保持 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 在提取过程中形态不变 且具有良好的准确度和精密度。 3实际样品分析 将本文建立的方法应用于测定 25 个土壤样品 中的硒形态， 分析结果汇总于表 3。样品中 Se Ⅳ 含量在 0． 028 ～ 0． 433 mg/kg 之间， Se Ⅵ 含量在 0． 015 ～ 0． 092 mg/kg 之间， 提 取 的 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 总量在 0． 045 ～0． 465 mg/kg 之间， 微波消解 得到土壤中的总硒量在 0． 088 ～0． 762 mg/kg 之间， 提取的硒形态总量占土壤中总硒量的 18． 68 ～ 82． 06， 说明本方法可同时提取出土壤中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ ， 并可满足土壤中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 同时 测定的要求， 能够更准确、 全面地了解土壤中硒的形 态和含量。 表 3样品分析结果 Table 3Analytical results of the sample 样品 编号 Se Ⅳ 含量 mg/kg Se Ⅵ 含量 mg/kg 硒形态总量 mg/kg 总硒 mg/kg 硒提取率 10．0280． 0160．0450．23918．68 20．0480． 0240．0720．33021．77 30．0410． 0150．0560．12345．17 40．0820． 0400．1220．15976．51 50．0480． 0180．0660．16440．29 60．3060． 0770．3840．64659．37 70．4330． 0320．4650．76261．03 80．1580． 0390．1970．34657．04 90．0470． 0200．0670．10165．97 100．0490． 0190．0680．11260．96 110．1920． 0670．2590．36071．82 120．2830． 0920．3750．50274．73 130．0570． 0210．0780．16048．70 140．0440． 0180．0620．12748．49 150．0570． 0190．0760．16546．14 160．0660． 0360．1010．21447．40 170．0870． 0270．1140．23049．65 180．0600． 0210．0810．16848．39 190．1180． 0220．1400．21864．19 200．0580． 0280．0850．22138．52 210．1700． 0330．2030．24782．06 220．0500． 0160．0660．08874．60 230．0760． 0310．1070．21749．30 240．0550． 0230．0770．14852．36 250．2060． 0780．2840．36278．49 4结论 以 0． 1 mol/L 氢氧化钠溶液作为提取剂可同时 提取土壤中的 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ ， 且能够保持提取 过程中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 形态不发生变化， 通过优 化超声萃取条件和 HPLC 分离条件， 建立了 HPLC － ICP － MS 联用技术同时测定提取液中 Se Ⅳ 和 Se Ⅵ 两种无机硒形态的分析方法。该方法萃取 时间短、 操作简单、 精密度和准确度良好， 为了解土 壤中无机硒形态和含量提供了一种可行性方法， 在 土壤中无机硒形态分析领域具有较好的应用前景。 5参考文献 ［ 1］Kpolna E， Fodor P． Speciation analysis of selenium enriched 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