古气候古环境研究中类脂化合物单体同位素分析_王晓华.pdf

2008 年 12 月 December 2008 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 27，No． 6 435 ～440 收稿日期 2008- 04- 18; 修订日期 2008- 07- 22 基金项目 国家自然科学基金项目资助 40772119; 40572101 ; 国土资源部百人计划项目资助; 国家地质实验测试 中心院所长基金项目资助; 国土资源部地质大调查项目资助 1212010816028 作者简介 王晓华 1983 － ， 女， 山东烟台人， 硕士研究生， 第四纪地质学专业。E- mail yingkongshi7163． com。 通讯作者 孙青 1967 － ， 女， 安徽寿县人， 研究员， 地球化学专业。E- mail sunqingemail yahoo． com． cn。 文章编号 0254- 5357 2008 06- 0435- 06 古气候古环境研究中类脂化合物单体同位素分析 王晓华1， 2，石丽明3，刘美美4，孙青4*，储国强1 1． 中国科学院地质与地球物理研究所， 北京100029; 2． 中国科学院研究生院， 北京100049; 3． 中国地质大学 北京 地球科学与资源学院， 北京100083; 4． 国家地质实验测试中心， 北京100037 摘要 高精度准确测定类脂化合物单体同位素比值对重建古气候古环境具有重要意义。论 述了古气候、 古环境研究中适合单体同位素分析的类脂化合物提取、 分离富集方法， 介绍了单体 化合物碳、 氢同位素的仪器分析方法。 关键词 类脂化合物; 单体同位素比值; 样品前处理; 气相色谱 － 同位素比值质谱技术 中图分类号 O628; P593文献标识码 A Specific Isotope Analysis of Lipid Biomarker Compounds Applied in Paleoclimate and Paleoenvironment Reconstruction WANG Xiao- hua1， 2，SHI Li- ming3，LIU Mei- mei4，SUN Qing4*，CHU Guo- qiang1 1． Institute of Geology and Geophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing100029，China; 2． Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100039，China; 3． School of the Earth Sciences and Resources， China University of Geoscience， Beijing100083， China; 4． National Research Center for Geoanalysis，Beijing100037，China Abstract The technique of gas chromatography- isotope ratio mass spectrometry GC- IRMShas obtained significant development since 1970s． The development make it possible to measure the compound- specific isotope ratio of lipid biomarkers in organic matters． This paper presents the development in sample preparation extration and separation ，improvement of the instruments and analytical s of GC- IRMS，and its applications in the research on paleoclimate and paleoenvironment reconstruction． Key words lipid biomarkers compound; specific isotope ratio; sample preparation; gas chromatography- isotope ratio mass spectrometry 自世界上第一台色谱 － 同位素比值质谱 GC － IRMS 商业化以来， 类脂化合物的单体同位素就成 为古气候、 古环境研究的有力工具 ［ 1 －2 ］。类脂化合 物 烷烃、 脂肪酸、 醇、 烯酮等 的单体碳同位素被广 泛应用于追溯沉积物的来源 ［ 3 －15 ］， 推测植被的相对 变化， 研究控制植被扩张的环境与气候因素 ［ 15 －18 ］。 类脂化合物的单体氢同位素组成 ［ 19 －21 ］对突发性气 候事件高度敏感， 反映了生物合成时利用的水源的 氢同位素组成和一些与水循环有关的有机地球化学 信息 ［ 22 ］， 可以重建过去的温度、 湿度、 大气降水同位 素 δD 的变化 ［ 19， 23 ］。 精确分析沉积物、 石笋等环境介质中有机化合 物单体同位素比值对重建古气候古环境具有重要意 义。环境介质中有机化合物组成复杂、 含量低， 用 534 ChaoXing GC －IRMS 测定有机质单体化合物同位素组成的灵 敏度比气相色谱、 气相色谱/质谱低得多， 测量的精 度依赖于高含量目标化合物间的分离程度高低， 分 离程度高， 测量精度好; 与气相色谱、 气相色谱/质谱 测量所需的样品前处理相比， GC － IRMS 测量需要 更加高效的提取富集方案和更加彻底的目标物分 离、 纯化措施。前处理过程中避免同位素分馏对获 得准确的同位素比值至关重要 ［ 24 ］。本文主要介绍 类脂化合物的提取、 净化分离方法， 以及 GC － IRMS 分析单体同位素比值的方法。 1类脂化合物的提取 提取环境样品中生物标志化合物的溶剂主要有 氯仿、 二氯甲烷、 正己烷和甲醇等。提取方法主要有 索氏提取、 超声提取、 微波消解、 超临界流体萃取、 加 速溶剂萃取等， 各种提取方法各有优缺点。 索氏提取是一种经典高效的提取方法， 但所用 时间太长， 有机试剂用量大。 超声提取设备相对便宜， 适宜于样品量小、 批量样 品的操作， 并且重复进行可以提高提取效率; 但重复进 行比较繁琐， 时间、 试剂用量和劳动力耗费很大 ［ 25 ］。 微波消解是基于有机试剂在电磁场中震荡， 吸 收电磁辐射的能量发生重排而转化为热能， 不像传 统的通过红外能或热传导来加热， 微波消解能够使 溶剂整体同时升温 ［ 25 ］。较之传统的提取方法 索氏 提取、 超声提取 ， 微波消解提取的优势是样品回收 率较高， 提取时间缩短， 试剂用量较少 ［ 26 －27 ］。 超临界流体萃取技术是在超临界状态下， 将超 临界流体与待提取的物质接触， 使其有选择性地把 极性、 沸点和分子量不同的成分依次萃取出来， 从而 达到提取、 分离提纯的目的。超临界流体萃取的优 势是样品需要量少， 萃取速度快， 并且还是一种环境 友好的提取方法 ［ 28 ］。 对于复杂样品的前处理， 人们作了多种尝试 自 动索氏提取、 超声提取、 微波消解和超临界萃取等 ， 以期找到一种高效、 快捷的方法取代传统的萃取法。 20 世纪90 年代发展起来的加速溶剂萃取是一种在 提高温度 50 ～200℃ 和压力 1013 ～2016 MPa 的 条件下， 用有机溶剂萃取的方法。该方法的优点是 自动化程度高、 有机溶剂用量少、 速度快、 基体影响 小、 萃取效率高、 选择性好 ［ 29 －30 ］。加速溶剂萃取目 前被广泛应用于类脂化合物的提取， 并取得了很好 的效果 ［ 19 －20， 22， 31 －33 ］; 但较高的温度可能导致某些脂 肪酸类生物标志化合物分解。 目前古气候古环境研究中， 索氏提取、 超声提取 和加速溶剂萃取是广泛使用的类脂化合物提取方 法; 而微波消解和超临界流体萃取没有得到广泛的 应用。 类脂化合物可以分为自由相和键合相类脂化合 物。未经处理的干燥或湿润样品利用上述溶剂提取 的方法只能提取颗粒表面的和溶剂可以达到的颗粒 内部的有机质 分散可溶有机质或自由相类脂化 合物。经典的键合相类脂化合物是指分散可溶有机 质提取后的样品经 KOH － 甲醇溶液回流皂化后释 放的与大分子结合的类脂化合物。目前存在许多不 同的化学处理方法， 不同的化学处理可以释放不同 来源的类脂化合物。近年来比较引人注目的化学处 理方法是盐酸酸解法， 被认为可以释放细菌来源的 通过酰胺键与其他细胞等结合的脂肪酸。酸解法还 是一种对碳酸盐含量高的样品的常用的处理方 法 ［ 33 －36 ］。直接萃取法提取碳酸盐中分散可溶有机 质; 但是碳酸盐中还存在相当数量的晶包有机 质 ［ 37 ］， 可以通过样品酸解增加生物标志化合物的提 取量， 减少样品的使用量。例如， 石笋中含有的生物 标志化合物非常低， 最丰富的生物标志化合物 n －C16脂肪酸的含量小于 2 μg/g CaCO3， 一般需要 70 ～100 g CaCO3才能提取满足丰度分析所需的目标 化合物 ［ 38 ］， 酸解后降低了污染， 同时释放了溶剂直 接提取不能提取的大分子键合相的有机化合物， 样 品的使用量降至10 g， 时间分辨率从千年提高至 10 ～100 年 ［ 39 ］。但是自由相和键合相类脂化合物的分 布和碳同位素组成可能存在明显差异 ［ 36 ］， 自由相和 键合相类脂化合物的同时提取， 可能损失许多环境 信息， 因为不同的有机组分可能来自不同的源， 反映 不同的气候变化。近年来， 顺序提取的方法在土壤 和沉积物的提取中受到关注 ［ 40 ］， 一些研究集中在顺 序提取的优化和提取物反映的古气候、 古环境意义 方面的研究。 2类脂化合物的净化分离 提取的类脂化合物中， 存在成千上万种有机化 合物， 在色谱图上表现为未分峰; 此外， GC － IRMS 分析所需进样量远远超过普通色谱柱的容量， 致使 峰宽变宽、 拖尾， 分辨率降低， 分离效果变差; 但类脂 化合物的单体同位素准确分析需要保证目标化合物 不受共流出组分的干扰， 在 GC － MS 图上表现出基 线分离 ［ 24 ］。所以， 单体同位素分析对目标物的净化 分离要求比类脂化合物的丰度分析 GC 和 GC － MS 634 第 6 期 岩矿测试 http ∥ykcs． i3t． com． cn/ 2008 年 ChaoXing 分析 高， 一般采取多级分离方案， 即在族分离之后， 依据目标化合物和共流出杂质化合物间性质的差 异， 采取特殊的方法， 分离纯化目标化合物。 在对正构烷烃进行单体同位素分析时， 为了提 高测定结果的精度和准确度， 需要将正构和异构烷 烃分离开来， 以减少不同构型的分子化合物之间的 相互影响 ［41 －43 ］。利用交叉通道的三维网状交叉结 构 5A 分子筛选择吸收正构烷烃， 可以将正构和异 构烷烃分离 ［44 ］。传统的分析流程是把 5A 分子筛 与溶解在苯、 甲苯、 异构辛烷或环己烷中的样品回 流 24 h［45 ］， 正构烷烃被分子筛吸附， 然后用稀氢氟 酸溶解分子筛， 把吸附在分子筛上的正构烷烃释放 出来 ［42 ］， 这种前处理方法可以用于定量分析正构 烷烃的丰度和单体同位素比值。Collister［45 ］和 Grice 等 ［42 ］发展了一种更加新颖的方法 不用氢氟 酸溶解分子筛， 而是利用正己烷回流的方式， 洗脱 吸附在分子筛上的正构烷烃， 这种快速、 安全的分 离流程适合正构烷烃的单体碳同位素分析; 但不能 用于定量分析低分子量正构烷烃的丰度。随后 Grice 等 ［42 ］改进了这种分离方法， 用含 12环己烷 的正戊烷溶液来解析吸附在 5A 分析筛上的正构 烷烃 C8～ C30 ， 回收率达到 90 以上， 而且没有 同位素分馏的迹象， 适用于单体同位素分析。尿素 络合或尿素络合的薄层色谱法可以分离正构和异 构烷烃， 并且适合正构烷烃的单体同位素分析， 是 一种危险性较小的方法; 但通常由于操作过程中的 蒸发作用而丢失低分子量的烃 ［46 ］， 而且效果不如 分子筛法， 同时， 低温络合用时太长 4 ～5 天 ; 常 温络合用时短， 但操作不便。 脂肪酸的净化和分离相对成熟， 类脂经简单的 硅胶柱色谱分离后获得的脂肪酸馏分， 衍生化后上 机测定时， 100的甲基硅酮色谱柱不能分离16 ∶ 1/ 16 ∶ 0 或18 ∶ 2/18 ∶ 1/18 ∶ 0 脂肪酸甲酯等化合物 对， AgNO3络合色谱可以有效地把饱和与不饱和脂 肪酸分离开来， 16 ∶ 0、 18 ∶ 0 和 18 ∶ 1 脂肪酸甲酯的 回收率达到100， AgNO3络合色谱分离前后的 δ13C 值没有发生同位素分馏 ［ 47 ］。另一可能发生的问题 是一些脂肪酸 16 ∶ 1 或18 ∶ 1 与异构体的共洗脱， 只能测定目标物与异构体总和的同位素比值 ［ 48 ］。 长链不饱和酮的单体同位素分析， 尤其是单体 氢同位素分析十分困难， 在 C37和 C38长链烯酮的 GC 和 GC －MS 分析时需要1 ng 左右的进样量， 在这种 条件下， 各种烯酮化合物能很好地分离; 然而对于单 体同位素的测量， 单体碳同位素比值测量需要 70 ng 的进样量， 单体氢同位素比值测量至少需要 400 ng 的进样量， 远远超过普通气相色谱柱的容量， 使得碳 链长度相同但饱和度不同的烯酮共洗脱。一些有关 长链烯酮同位素研究只是报道共洗脱烯酮的混合 δD 值 ［ 49 －50 ］。William 等［ 51 ］利用 AgNO 3硅胶色谱， 比 较有效地分离了不同数目双键的长链烯酮， 用于单 体烯酮化合物氢同位素分析， 提高了分析精度 C37 ∶ 3的精度为 1． 7‰， C37 ∶ 2为 0． 6‰ 。Schwab 等 ［ 52 ］利用高效液相色谱 HPLC 净化长链烯酮， 减 少了进样量， 并使长链烯酮的回收率达到最高; 但他 没有列出长链烯酮的回收率。标准加入法研究表 明， 当 C37∶ 3长链烯酮的回收率达到 92 时， 可以准 确测定长链烯酮的单体同位素比值， 分离过程不引 起长链烯酮的同位素分馏 ［ 52 ］。 对于一些化合物 如甾醇、 羟基何伯烷、 三萜 醇 在自然界含量较高， 且生物源比较确定， 是古 环境研究的良好工具; 但它们具有相似的分子量、 极性和挥发性， 分离起来比较困难。传统的净化方 式， 尿素络合、 柱色谱、 AgNO3络合硅胶薄层色谱等 对目标物的分离效果不佳、 回收率低不易重复、 而 且容易造成同位素分馏; 而 HPLC 法是分离这些化 合物的有效方式。脂肪酸、 甾醇和甲藻甾醇经 HPLC 净化后回收率较高 达 60 以上 ， 而且 HPLC 进样和组分收集实现了自动化， 可以快速、 重复进行， 分离效果稳定可靠 ［24， 52 ］。HPLC 法分离 净化类脂化合物用于单体同位素分析是一种比较 理想的选择。 3气相色谱 －同位素比值质谱分析 1976 年 Sano 首次提出在气相色谱和质谱之 间加一个燃烧炉来实现复杂混合物中的单体化合 物同位素组成的在线分析， 随后经多人改造， 提高 了 GC － IRMS 在线测定有机质单体化合物同位素 组成的灵敏度和精度， 目前 GC － IRMS 分析类脂化 合物单体碳同位素所需进样量 50 ～100 ng， 分析单 体氢同位素所需进样量 200 ～400 ng， 使得有机质 的同位素组成研究达到了分子水平 ［53 ］。 仪器接口技术、 色谱各种参数和数据处理方式 等明显影响了单分子同位素分析结果的精度和准 确度 ［54 －56 ］。GC － IRMS 仪器的氧化炉、 除水和分 流装置， 以及与其他装置相连的接口带来许多潜在 问题， 例如氧化炉接口， 通常的做法是用口径很大 的玻璃或陶瓷炉管与毛细管连接， 死体积增加， 且 易于产生泄漏。Leroy 等 ［54 ］把传统的玻璃或陶瓷 734 第 6 期王晓华等 古气候古环境研究中类脂化合物单体同位素分析第 27 卷 ChaoXing 管的炉子换成聚酰亚胺毛细氧化管炉子， 这种设计 的优势是 接口减少， 降低了泄漏发生的可能性; 在 氧化炉处没有死体积， 减少了化合物间的干扰， 使 色谱峰的分辨率几乎不会有损失， 测定的同位素比 值更加准确。 在测定碳同位素比值时， 由于色谱分离的同位 素效应， 13CO 2的 m/z 45 信号平均而言比 12CO 2的 m/z 44 早 150 ms， 这种时间移位主要取决于化合 物的性质和色谱的参数， 例如固定相的极性、 柱温 和载气流量， 所以峰检测的时间窗设置不合适可能 导致峰信息丢失， 峰积分不完整会严重影响同位素 的准确测定 ［57 ］。气相色谱升温程序不仅影响有机 化合物的分离， 而且影响基线的斜率， 所以影响单 体同位素测定结果。选择单一升温速率或在待测 化合物溢出的时间范围内保持较平缓的升温梯度， 对多拐点基线模式进行分段数据处理等方法可提 高分析结果的精度和准确度 ［43 ］。此外， 分流进样 和载气流速也会影响 δ13C 的测定 ［56 ］。 样品的净化和分离技术可以减少但不能消除 共洗脱对测量精度和准确度的影响， 在测定气相色 谱流出物的单体同位素比值的同时， 需要利用质谱 定性检测样品， 可以了解是否存在共洗脱的影响， 以控制和保证同位素比值测量质量。质谱定性检 测有在线和离线两种方式， 在线方式的 GC － IRMS 设备同时并联四级杆质谱， 经 GC 分离的样品被分 流， 一部分进入四级杆质谱定性， 一部分进入磁质 谱测量同位素比值， 保证了定性和同位素比值测定 的物质的一致性， 但降低了检测信号。有些实验室 采用离线检测的方式; 但离线方式难以保证定性和 同位素比值测定的物质的一致性。近来， Vetter ［58 ］ 等通过对 GC － IRMS 的色谱进行求导， 发现导数色 谱可以监测目标物的同位素测量时是否受到共流 出杂质的影响， 有助于区分合格与不合格数据， 可 以对目标物的同位素分析进行有效的质量监控。 4结语 样品前处理是高精度准确分析类脂化合物的 单体同位素的关键。目前， 在古气候古环境的有机 地球化学研究方面， 经典的索氏提取、 超声提取方 法和新颖的加速溶剂萃取类脂化合物方法共存; 但 研究介质中类脂化合物的不同提取方法、 提取效率 缺乏系统比较。加速溶剂萃取提取古气候研究介 质中类脂化合物的方法应用虽广; 但方法优化并不 多见。自由相和键合相类脂化合物的顺序提取物 可能反映了不同的古气候古环境意义， 因此， 顺序 提取方法的研究将备受关注。类脂化合物常用的 分离富集方法难以满足同位素准确测定要求， 一般 需要选择合适的多级分离方法降低共流出物对目 标化合物分析的影响， 简单的柱色谱之后采取无氢 氟酸溶解的分子筛络合法、 硝酸银络合色谱和高效 液相色谱分离净化类脂化合物用于单体同位素分 析是比较理想的选择。仪器接口技术、 色谱参数和 数据处理方式等的改进明显提高了单分子同位素 分析结果的精度和准确度。总之， 随着气相色谱 － 同位素比值质谱技术的不断完善， 相关前处理技术 的逐步发展， 类脂化合物单体碳、 氢同位素的测定 将会更加准确， 精度更高。 5参考文献 ［ 1］Enno Schefuβ，Stefan Schouten，Ralph R Schneider． Climatic controls on central African hydrology during the past 20000 years［ J］ ． Nature， 2005， 4371003 －1006． ［ 2］Yoshito Chikaraishi，Hiroshi Naraoka． δ13C and δD identification of sources of lipid biomarkers in sediments ofLakeHaruna Japan［J］ ．Geochimicaet Cosmochimica Acta， 2005， 69 13 3285 －3297． ［ 3］Collister J W， Rieley G， Stern B， Eglinton G， Fry B． Compound- specific δ13C analyses of leaf lipids from plants with differing carbon dioxide metabolisms［J］ ． Organic Geochemistry， 1994， 21 619 －627． ［ 4］Simoneit B R T． Compound- specific carbon isotope analy- ses of individual long- chain alkanes and alkanoic acid in Harmattan aerosols［ J］ ． Atmospheric Environ- ment， 1997， 312225 －2233． ［ 5］James W Collister，Gareth Rieley，Benjamin Stern． Compound- specific δ13C 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