体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜(Brassica Juncea)中镉铜锌形态_杨红霞.pdf

2010 年 2 月 February 2010 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 29，No． 1 9 ～13 收稿日期 2009- 06- 17; 修订日期 2009- 09- 02 基金项目 国家地质实验测试中心基本科研业务费项目资助 200607CSJ02 ; 国土资源部公益性行业科研专项 资助 200911043 作者简介 杨红霞 1979 － ， 女， 助理研究员， 博士生， 主要从事元素形态分析研究。E- mail yanghongxia1 sina． com。 文章编号 02545357 2010 01000905 体积排阻高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法 同时测定印度芥菜 Brassica Juncea 中镉铜锌形态 杨红霞1，刘崴1，李冰1，魏巍2，张惠娟2，陈登云3 1． 国家地质实验测试中心，北京100037; 2． 南京农业大学，江苏 南京 230026; 3． 安捷伦科技有限公司，北京100022 摘要 建立了体积排阻高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜中镉、 铜、 锌形态分析 方法。为了防止巯基化合物氧化反应的发生， 样品采取液氮保护并在 －70 ℃保存， 样品分析全流程采取 氮吹防氧化措施。在镉、 铜、 锌胁迫下， 诱导产生植物螯合肽 PCs 。在叶片和根部均检测到 3 种元素的 4 种形态， 植物螯合肽 PC 3－ Cd Cu， Zn 、 植物螯合肽 PC2 － Cd Cu， Zn 、 谷胱甘肽 GSH － Cd Cu， Zn 、 半胱胺酸 Cys － Cd Cu， Zn 及其在植物体内的分布规律。结合植物不同部位 Cd、 Cu、 Zn 分布规律 初步推断， Cd、 Cu、 Zn 在与 GSH 及 Cys 的结合上存在竞争。 关键词 形态分析; 镉; 铜; 锌; 印度芥菜; 体积排阻高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法 中图分类号 O655． 6; O657． 62; O657． 63; S637文献标识码 A Speciation Analysis of Cadmium，Copper and Zinc in Indian Mustard Brassica Juncea by Size Exclusion- High Perance Liquid Chromatography- Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry YANG Hong- xia1，LIU Wei1，LI Bing1，WEI Wei2，ZHANG Hui- juan2，CHEN Deng- yun3 1． National Research Center for Geoanalysis，Beijing100037，China; 2． Nanjing Agriculture University，Nanjing230026，China; 3． Agilent Technologies，Beijing100022，China Abstract A based on the coupling of size- exclusion HPLC with ICP- MS was used for speciation analysis of Cd， Cu and Zn binding non- protein thiols in extracts of Indian mustard Brassica Juncea ． In the presence of Cd， Cu and Zn stress， phytochelatins PCs were induced and metal ions in extracts were associated with the induced PCs． Four different species of PC 3- Cd Cu， Zn ， PC2- Cd Cu， Zn ， GSH- Cd Cu， Zn ， Cys- Cd Cu， Zn were detected in stems and roots，and their distribution patterns within plants was studied． The results indicated that there was a competition on the combination of Cd，Cu，Zn with GSH and Cys． A non- oxidizing nitrogen sample preparation environment and－ 70 ℃ preservation condition were employed to avoid the oxidation of sulfhydryl groups． This research may be useful for understanding transportation of heavy metals in hyperaccumulator． Key words size exclusion chromatography- high perance liquid chromatography- inductively coupled plasma- mass spectrometry SEC- HPLC- ICP- MS ; speciation analysis; cadmium; copper; zinc; Indian mustard Brassica Juncea 9 ChaoXing Cu、 Zn 是生物必需的营养元素， 但过量的 Cu、 Zn 会对生物的生长发育造成危害。Cd 是危害性最 大的重金属之一， 镉污染将影响植物的生理生化活 性， 进而通过食物链影响人类健康 ［ 1 ］。随着现代工 农业生产的迅速发展， 重金属复合污染问题日益严 重， 过去的研究大多只注重单个污染物的环境效应， 对多种污染物共存于同一环境并相互作用所形成的 环境污染效应重视不够。近年来， 选用超累积植物 修复重金属污染土壤成为植物修复的热点 ［ 2 ］。超积 累植物 Hyperaccumulator 是指能够超量吸收和积 累重金属的植物， Brooks 等 ［ 3 ］1977 年最早提出这一 概念。1983 年 Chaney［ 4 ］提出了利用超富集植物清 除土壤重金属污染的思想。Baker［ 5 ］在欧洲中西部 发现了能富集 Cd 高达2130 mg/kg 的十字花科植物 天蓝褐蓝菜。Salt［ 6］发现印度芥菜对镉有一定的耐 受和积累能力，而且生物量较大，吸镉总量很高。 这些积累植物能够耐受高浓度重金属的原因是在重 金属胁迫下， 植物体内生成一些特定功能的螯合体 与有毒元素结合成稳定的化合物而消除这些元素的 毒性作用， 表现出较强的重金属抗性。这种螯合体 即为植物螯合肽 Phytochelatins， PCs 。PCs 是一种 富含巯基的寡肽， 结构通常为 γ － Glu － Cys n－ Gly 其中 n 等于 2 ～11 ［ 7 ］。通常认为， PCs 对重金属 解毒的机理是重金属离子进入植物体后， 与细胞内 的 PCs 结合形成复合物， 然后转运到特定的细胞器 主要为液泡 进行区室化固定， 进而防止其干扰细 胞的新陈代谢 ［ 8 －9 ］。因此， 明确植物抗重金属的生 理和分子机理， 从而提高植物在污染环境下的适应 范围和生产能力， 对于高效利用自然资源和进行污 染环境的生物修复均具有重要意义。由于缺乏强有 力的分析检测技术， 植物体内重金属的迁移机制， 解 毒机制还没有明确结论。尤其是对 PCs 与重金属离 子的结合状态， 长距离运输以及解毒过程中的变化 的研究还很少。 体积排阻 － 高效液相色谱分离 SEC － HPLC 与电感耦合等离子体质谱 ICP － MS 联用技术， 具 有交联葡聚糖 Sephadex G50 分子筛凝胶过滤层析 的根据分子量分离化合物的优点， 和 ICP － MS 灵敏 的多元素同时检测优点， 又因为其流动相一般采用 中性的 Tris － HCl/NaCl 缓冲液， 与生物体本身体内 条件相似， 因此可以较准确反映植物螯合肽以及其 他巯基化合物在生物体内与元素的结合状况 ［ 10 ］。 Leopold 等 ［ 11 －13 ］建立了 SEC － HPLC － ICP － MS 测 定金属与植物螯合肽形成的复合物， 但由于柱效差， 谷胱甘肽 GSH 与 PC 峰重叠。Vacchina 等 ［ 14 ］用 HPLC －ICP －MS 测定植物中 Cd 的形态， 同时测定 Cd、 Cu、 Zn 在植物中的形态， 可以更清楚地了解 PCs 的形成以及在植物解毒机制中的作用。Wei 等 ［ 15 ］ 发现了 Cd、 Cu、 Zn 与谷胱甘肽和半胱胺酸的结合 态， 未检测出 Cu、 Zn 与 PCs 的结合态。 本研究建立了 SEC － HPLC － ICP － MS 同时测 定印度芥菜中 Cd、 Cu、 Zn 形态分析的方法。在叶 片和根部均检测到 3 种元素的 4 种形态， 即植物螯 合肽 PC 3－ Cd Cu， Zn 、 植物螯合肽 PC2 － Cd Cu， Zn 、 谷胱甘肽 GSH － Cd Cu， Zn 及半胱胺 酸 Cys － Cd Cu， Zn ， 并分析了其在植物体内的 分布规律， 可以为 Cu、 Zn、 Cd 复合污染条件下植物 的抗金属性研究提供技术支撑。 1实验部分 1． 1仪器和主要试剂 7500a Agilent 电感耦合等离子体质谱仪 美国 Agilent 公司 ; 1100 Agilent 高效液相色谱仪 美国 Agilent 公司 。工作参数见表 1。 表 1仪器工作条件 Table 1Operating parameters of SEC- HPLC and ICP- MS ICP －MS 工作条件 SEC －HPLC 工作条件 发射功率1360 W色谱柱 TSK －GEL G3000 300 mm 7．5 mm， TOSOH， 日本 采样深度5．8 cm保护柱 TSK －GELTMPW 40 mm 6．0 mm，TOSOH， 日本 载气流速1．05 L/min流动相10 mmol/L Tris －HCl 缓冲液 pH 7．5 雾化器Babington流速0．8 mL/min 采样模式时间积分进样量100 μL 自动进样 积分时间1000 s EDTA － Cd Cu， Zn 标准溶液 用 10 mmol/L EDTA 配制 EDTA － Cd 1． 14 mg/L 、 EDTA － Cu 1．26 mg/L 、 EDTA － Zn 1． 24 mg/L 溶液， 对 Cd、 Cu、 Zn 未知峰进行定量， 使用时按需要逐级稀释。 GSH － Cd、 GSH － Cu、 GSH － Zn 标准溶液 在 氮气保护下配制 10 ng/L 左右的 GSH － Cd、 GSH － Cu、 GSH － Zn 溶液， 用于确定色谱峰保留时间。 流动相 配制10 mmol/L Tris － HCl 缓冲液， 其 中加入 0． 1 mol/L NaCl 溶液和 φ 0． 03 体积分 数， 下同 的 NaN3， 调节 pH 7． 5， 0． 45 μm 滤膜过 滤， 氮气鼓泡赶干净溶解氧。 01 第 1 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2010 年 ChaoXing 分子量标准试剂 Albumin bovine 相对分子质 量 67000 、 Albumin egg 相对分子质量 45000 和 Vitamin B12 相对分子质量 1355． 4 。 水 去离子水再经 Milli － Q 装置纯化 电阻率 ＞18 MΩcm 。 1． 2样品处理 取一定量的鲜叶片和根系样品， 在液氮中浸泡 后， 加1．00 g 干净石英砂和5．00 mL 缓冲液， 将样品 置于干净的玛瑙研钵中研磨至浆状。磨碎后转移至 10 mL 离心管， 用 Tris － HCl 缓冲液清洗研钵， 一并 转移入离心管。在 4 ℃ 离心 10 min， 转速为10000 r/min， 上层清液转移入干净离心管， 置于冰箱 －70℃ 保存。分析前， 将样品从冰柜中取出， 氮 气保护下解冻， 0．2 μm 滤膜过滤后快速上机分析。 2结果与讨论 2． 1镉铜锌元素形态分离与检测 在印度芥菜的叶片和根部均检测到 Cd、 Cu、 Zn 三种元素的4 种未知峰， 根据分子量标准试剂所做 的分子量 －保留时间公式， 计算其大致分子量， 再通 过半胱胺酸 － Cd Cu， Zn 、 谷光甘肽 － Cd Cu， Zn 标准物质保留时间及文献［ 16 －17］ 报道的分子量范 围初步推断的各形态列于表2， 谱图如图1 所示。 表 2元素不同形态及保留时间 Table 2Species of heavy metals with retention time 元素标注形态 保留时间 tR/min Cd1Cys －Cd13．5 2GSH －Cd10．2 3 PC2－Cd8．8 4 PC3－Cd7．8 Zn1Cys －Zn11．4 2GSH －Zn10．6 3 PC2－Zn9．1 4 PC3－Zn7．8 Cu1Cys －Cu11．4 2GSH －Cu10．3 3 PC2－Cu9．1 4 PC3－Cu7．8 2． 2不同元素形态在植物体内的分布规律 Cd、 Cu、 Zn 三种元素在同一植物不同部位的不 同形态分布如图 2 ～ 图 4 所示。可以看出， Cd 在植 物体内的分布规律为 根部和叶片中均能检测到 4 种形态， 但叶片中 Cd 以 GSH － Cd 为主， 根部以 PC 2－Cd 为主。Cu 的分布规律是 叶片中能检测 到 4 种形态， 以 Cys － Cu 为主， 根部只检测到 PC 2－Cu和 Cys －Cu， 且叶片中 Cu 各形态浓度要 远高于根部。Zn 的分布规律是叶片中能检测到4 种 形态， 以 Cys － Zn 为主， 根部只检测到 Cys － Zn， 且 叶片中 Zn 各形态浓度要远高于根部。 另外， 从 3 种元素的形态分布规律看， Cd、 Cu、 Zn 在与 GSH 和 Cys 的结合上有竞争 ［10 ］。Cd 会取 代 GSH 上的 Cu 和 Zn， 生成 GSH － Cd， 进而以 GSH 为前体， 合成 PC 2－ Cd、 PC3 － Cd， 从而使印度 芥菜表现出强的耐 Cd 特性。 图 1Cd、 Zn、 Cu 同时色谱分离谱图 Fig． 1Chromatograms of Cd，Zn and Cu species by SEC- HPLC- ICP- MS 图 1 中 1、 2、 3、 4 对应表 1 中各元素的形态。 图 2同一植物叶片和根中 Cd 形态色谱分离谱图 Fig． 2Chromatograms of Cd species in leaf and root samples of the same plant by SEC- HPLC- ICP- MS 11 第 1 期杨红霞等体积排阻高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜 Brassica Juncea 中镉铜锌形态第 29 卷 ChaoXing 图 3同一植物叶片和根中 Cu 形态色谱分离谱图 Fig． 3Chromatograms of Cu species in leaf and root samples of the same plant by SEC- HPLC- ICP- MS 图 4同一植物叶片和根中 Zn 形态色谱分离谱图 Fig． 4Chromatograms of Zn species in leaf and root samples of the same plant by SEC- HPLC- ICP- MS 3结语 本工作建立了 SEC － HPLC － ICP － MS 同时测 定印度芥菜中 Cd、 Cu、 Zn 形态分析的方法。为了 防止巯基化合物的氧化反应发生， 本工作全流程采 取液氮及氮吹的防氧化措施 ［18 ］。在植物叶片和根 部同时检测出 3 种元素的 4 种形态， 即 Cys － Cd、 GSH － Cd、 PC 2 － Cd、 PC 3 － Cd， Cys － Cu、 GSH － Cu、 PC 2 － Cu、 PC 3 － Cu， Cys － Zn、 GSH － Zn、 PC 2－ Zn、 PC3－ Zn。在同一植物的 不同部位， 叶片中的形态以 GSH － Cd、 Cys － Cu、 Cys － Zn 为主， 根部以 PC 2－ Cd、 PC2－ Cu、 Cys － Cu 和 Cys － Zn 为主。另外， Cd、 Cu、 Zn 在与谷胱 甘肽 GSH 和半胱胺酸 Cys 的结合上有竞争。 4参考文献 ［ 1］游秀花， 聂丽华， 杨桂娣． 森林生态系统植物重金属 Cu， Zn， Cd 污染研究进展［J］ ． 福建林业科技， 2005， 32 3 154 －159． ［ 2］骆永明． 金属污染土壤的植物修复［J］ ． 土壤， 1999， 31 5 261 －265． ［ 3］Brooks R R，Lee J，Reeves R D，Jaffre T． Detection of nickeliferous rocks by alysus of herbarium species of indicatorplants ［J ］ ．JournaloffGeochemical Exploration， 1977， 7 49 －57． ［ 4］Chaney R L． Plant up take of inorganic waste constituents ［ M］ ∥Land treatment of hazardous wastes． Parr J F． ed． New Jersey Noyes Data Corporation， P198350 －76． ［ 5］Baker A J M． Terrestrial higher plants which hyper accumulatemetallicelementsAreviewoftheir distribution， ecologyandphytochemistry ［J ］ ． Biorecovery， 1989， 1 81 －126． ［ 6］Salt D E，Prince R C，Pickering I J，Raskin I． Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in Indian Mustard ［J］ ． Plant Physiology， 1995， 109 1427 －1433． ［ 7］Rauser W E． The role of thiols in plants under metal stress［ M］ ∥ Sulphur nutrition and sulphur assimilation in higher plants．Brunold C．ed．Switzerland Paul Haupt Bern， 2000 169 －183． ［ 8］Vgeli- Lange R，Wagner G J． Subcellular localisation of cadmium and cadmium- binding peptides in tobacco leaves［ J］ ． Plant Physiology， 1990， 92 1086 －1093． ［ 9］Ortiz D F，Ruscitti K F，McCue K F，Ow D W． Transport of metal- binding peptides by HMT1，a fission yeast ABC- type vacuolar membrane protein ［J］ ． The Journal of Biological Chemistry， 1995， 27 4721 －4728． ［ 10］ Wei Z G， Wong J W C， Zhao H Y， Zhang H J， Li H X， Hu F． Separation and determination of heavy metals associated with low molecular weight chelators in xylem saps of Indian Mustard Brassica junceaby size exclusionchromatographyandatomicabsorption spectrometry ［J］ ． Biological Trace Element Research， 2007， 118 146 －158． ［ 11］ Leopold I， Gnther D． Investigation of the binding pro- perties of heavy- metal- peptide compls in plant cell cultures using HPLC- ICP- MS［ J］ ． Fresenius Journal of Analytical Chemistry， 1997， 359 367 －370． ［ 12］ Leopold I，G nther D，Neumann D． Application of high perance liquid chromatography- inductively coupled plasmamassspectrometrytotheinvestigationof phytochelatin compls and their role in heavy metal detoxification in plants［ J］ ． Analusis， 1998， 2628 －31． ［ 13］ LeopoldI， GntherD， SchmideJ， NeumanD． Phytochelatinsandheavymetaltolerance ［J］ ． Phytochemistry， 1999， 501323 －1328． ［ 14］ Vacchina V，Polec K，Szpunar J． Speciation of cadm- ium in plant tissues by size- exclusion chromatography 21 第 1 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2010 年 ChaoXing with ICP- MS detection ［J］ ． Journal of Analytical Atomic Spectrometry， 1999， 14 1557 －1566． ［ 15］ Wei Z G， Wong J W C， Chen D Y． Speciation of heavy metalbindingnon- proteinthiolsinAgropyron elongatumbysize- exclusionHPLC- ICP- MS ［J］ ． Microchemical Journal， 2003， 74 207 －213． ［ 16］Weon Bae，Rajesh K． Properties of glutathione- and phytochelatin- cappedCdSbionanocrystallites ［J］ ． Journal of Inorganic Biochemistry， 1998， 69 33 －43． ［ 17］ Polec- Pawlaka K，Ruzik R， Abramski K， Ciurzynska M， Gawronska H．CadmiumspeciationinArabidopsis thaliana as a strategy to study metal accumulation system in plants ［J］ ． Analytica Chimica Acta， 2005， 54061 －70． ［ 18］ Yang Hongxia， Liu Wei， Li Bing． Speciation analysis of cadmium in Indian mustard Brassica Juncea by size exclusionchromatography- highperanceliquid chromatography- inductivelycoupledplasmamass spectrometry SEC- HPLC- ICP- MS［J］ ．Chinese Journal ofAnalyticalChemistry，2009，37 10  1511 －1514． 参考文献上接第 8 页 4参考文献 ［ 1］Shikazono N， Zakir H M， Sudo Y． Zinc contamination in river water and sediments at Taisyu Zn Pb mine area， TsushimaIsland， Japan ［J］ ．Journalof Geochemical Exploration， 2008， 98 3 80 －88． ［ 2］Cappuyns V，Swennen R，Vandamme A． Environ- mental impact of the er Pb Zn mining and smelting inEastBelgium ［J］ ．JournalofGeochemical Exploration， 2006， 88 1 －3 6 －9． ［ 3］Verner J F，Ramsey M H，Helios- Rybicka E，J drzejczyk B．Heavy metal contamination of soils around a Pb- Zn smelter in Bukowno，Poland［J］ ． Applied Geochemistry， 1996， 11 1 －2 11 －16． ［ 4］Jung M C，Thornton I． Heavy metal contamination of soils and plants in the vicinity of a lead- zinc mine， Korea［J］ ． Applied Geochemistry， 1996， 11 1 － 2 53 －59． ［ 5］Moles N R，Smyth D，Mather C E，Beattie E H， Kelly M．Dispersion of cerussite- rich tailings and plant uptake of heavy metals at historical lead mines near Newtownards， Northern Ireland ［J］ ． Applied Earth Science， 2004， 113 21 －30． ［ 6］Wilson B，Lang B，Pyatt F B． The dispersion of heavy metals inthevicinityofBritanniaMine， British Columbia， Canada［ J］ ． Ecotoxicology and Environmental Safety， 2005， 60 3 269 －276． ［ 7］Kachur A N，Arzhanova V S，Yelpatyevsky P V，von Braun M C，von Lindern H． Environmental conditions in the Rudnaya River watershedA compilation of Soviet and post- Soviet era sampling around a lead smelter in the Russian Far East［ J］ ． The Science of the Total Environment， 2003， 303 1 －2 171 －185． ［ 8］Sobanska S，Ledsert B，Deneele D，Laboudigue A． Alteration in soils of slag particles resulting from lead smelting［J］ ． Earth and Planetary Sciences， 2000， 331 4 271 －278． ［ 9］钟格梅， 唐振柱． 我国环境中镉、 铅、 砷污染及其对 暴露人群健康影响的研究进展［ J］ ． 环境与健康杂 志， 2006， 23 6 562 －564． ［ 10］褚桂棠． 南京栖霞山环境地质问题的研究［J］ ． 江苏地质， 1986， 10 4 38 －42． ［ 11］ 项长兴， 董雅文， 钱君龙， 黄景苏， 朱育新． 南京栖 霞山铅锌矿区土壤环境质量评价［J］ ． 土壤， 1993， 25 6 319 －323． ［ 12］ GB 156181995， 土壤环境质量标准［ S］ ． ［ 13］ HJ/T 1622004， 土壤环境监测技术规范［ S］ ． 31 第 1 期杨红霞等体积排阻高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜 Brassica Juncea 中镉铜锌形态第 29 卷 ChaoXing