超高效液相色谱法直接快速测定环境水样中硝基苯和苯胺_黄毅.pdf

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2012 年 8 月 August 2012 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol. 31,No. 4 666 ~671 收稿日期 2012 -02 -29; 接受日期 2012 -05 -04 基金项目 中国地质大调查项目 1212011120283 ; 国家地质实验测试中心基本科研业务费项目 201012CSJ04 作者简介 黄毅, 助理研究员, 从事环境有机污染物研究。E- mail huangyi l26. com。 通讯作者 饶竹, 研究员, 从事环境有机地球化学研究。E- mail raozhu l26. com。 文章编号 0254 -5357 2012 04 -0666 -06 超高效液相色谱法直接快速测定环境水样中硝基苯和苯胺 黄毅1,饶竹1*,刘艳1, 2,刘晨1,郭晓辰1 1. 国家地质实验测试中心,北京100037;2. 北京莱伯泰科仪器有限公司,北京 101312 摘要 建立了超高效液相色谱直接快速测定环境水样中硝基苯和苯胺的分析方法。取 900 μL 水样与 100 μL乙腈混匀, 用微孔滤膜 0. 2 μm, 有机系 过滤。采用 1. 7 μm 小颗粒填料的 BEH phenyl 柱, 以乙腈/ 醋酸铵溶液为流动相, 硝基苯和苯胺分别用紫外和荧光检测器检测, 分析时间仅 1. 1 min。硝基苯和苯胺的 线性范围分别是 0. 485 ~4850 μg/L和 0. 495 ~1978 μg/L, 方法检出限分别是 0. 194 μg/L和 0. 099 μg/L, 相 关系数均在 0. 995 以上。硝基苯 9. 70 μg/L、 194 μg/L、 1940 μg/L三个浓度水平回收率在 98. 3 ~101, 相对标准偏差在 1. 11 ~2. 03。苯胺 9. 89 μg/L、 198 μg/L、 1978 μg/L三个浓度水平回收率在 98. 6 ~ 104, 相对标准偏差在 0. 75 ~5. 85。与传统液相分析方法相比, 本方法线性范围更宽, 灵敏度更高; 直 接进样简化了前处理环节, 减少采样体积和有机试剂的使用; 分析效率高, 适用于地下水、 地表水等多种水质 样品中痕量到常量范围的硝基苯和苯胺快速测定。 关键词 环境水样; 硝基苯; 苯胺; 直接进样; 超高效液相色谱法 中图分类号 P641; O625. 611; O657. 72文献标识码 B Direct and Rapid Determination of Nitrobenzene and Aniline in Environmental Water by Ultra Perance Liquid Chromatography HUANG Yi1,RAO Zhu1*,LIU Yan1, 2,LIU Chen1,GUO Xiao- chen1 1. National Research Center for Geoanalysis,Beijing100037,China; 2. Beijing Labtech Group,Beijing101312,China Abstract A rapid and direct analytic has been established for the determination of nitrobenzene and aniline in environmental water samples by Ultra Perance Liquid Chromatography UPLC . The mixture of 900 μL water and 100 μL acetonitrile was filtered through a microfiltration membrane 0. 2 μm,organic . The UPLC analysis program has been improved by using a BEH phenyl separation column,filled with 1. 7 μm BEH particles,and the mobile phase used acetonitrile ammonium acetate.Nitrobenzene and aniline were detected respectively at the ultraviolet 262 nm wavelength and fluorescence λex /λ em 280 nm/340 nm respectively. The whole analysis program took only 1.1 min. The linear range of nitrobenzene and aniline were 0.485 -4850 μg/L and 0.495 -1978 μg/L,respectively. The detection limits of the s were 0. 194 μg/L and 0. 099 μg/L,respectively,and the correlation coefficients were both above 0. 995. The recoveries of nitrobenzene in three concentration levels of 9.70 μg/L, 194 μg/L and 1940 μg/L were 98.3 -101,and the relative standard deviation was in the range of 1.11 -2.03. The recoveries of aniline in three concentration levels of 9. 89 μg/L,198 μg/L and 1978 μg/L were 98.6 -104,and the relative standard deviation was in the range of 0. 75 -5. 85. Compared with the traditional liquid chromatography analysis s,this is suitable for the determination of nitrobenzene and aniline in groundwater, surface water and other water samples, with the advantages of being simple, rapid, sensitive, highly efficient,with a wide linear range and less sample and reagent consumption. Key words environmental water; nitrobenzene; aniline; direct injection; Ultra Perance Liquid Chromatography 666 ChaoXing 硝基苯和苯胺主要来源于医药、 印染、 石油等工 业生产过程中排放的废水以及突发性环境污染事 件, 如 2004 年沱江工业废水排放污染事件, 2005 年 石化车间爆炸造成松花江重大水污染事件。由于硝 基苯和苯胺具有致畸、 致癌、 致突变的“三致” 效应, 给生态环境和人体健康造成极大危害, 被多个国家 列为优先控制污染物。我国也将这两类化合物列入 优先控制污染物黑名单, 并制定了最高容许排放浓 度。污水综合排放标准 GB 89781996 中规定了苯 胺类化合物的排放标准, 地表水环境质量标准 GB 38382002 中明确了硝基苯和苯胺的限值。目前 我国长江、 松花江、 淮河等主要水体中均有硝基苯和 苯胺检出 [1 -6 ]。为了加强水体监测, 特别是应急事 件处理, 建立准确、 灵敏、 操作简便的快速分析方法 十分必要。 目前环境水样中硝基苯、 苯胺的分析方法有分 光光度法 [7 -8 ]、 荧光光度法[9 ]、 电化学法[10 ]、 气相色 谱法 [11 -13 ]、 液相色谱法 HPLC[14 ], 以及新的联用 方法如吹扫捕集与色谱 [15 ]、 质谱联用[16 ]; 固相微萃 取与色谱 [17 ]、 质谱联用[18 ]等。其中, 光度法和电化 学法灵敏度不高, 应用范围有限。气相色谱法和液 相色谱法较为常用, 传统的前处理技术液液萃取, 操 作步骤繁琐, 并且使用大量有机溶剂, 对人体有害; 固相微萃取前处理技术, 操作简单, 基本不用有机溶 剂, 但总分析时间较长; 采用直接进样分析能有效缩 短分析时间, 但是方法检出限较高, 硝基苯和苯胺的 检出限分别为 21 μg/L和 18 μg/L[20 ], 不能满足生 活饮用水卫生标准 GB 57492006 中硝基苯的检测 要求 17 μg/L 。超高效液相色谱 UPLC 自 2004 年问世后, 因其在 HPLC 基础上增强了系统的耐高 压性能, 采用 1. 7 μm 小颗粒填料, 大幅度提高了系 统分离度、 样品通量和灵敏度, 缩短分析时间, 减少 有机试剂的用量, 在环境、 医药等领域得到广泛应 用 [21 -26 ]。本文使用 UPLC, 紫外检测器和荧光检测 器同时分析硝基苯和苯胺, 实验中环境水样与乙腈 混合过滤膜后, 直接用 UPLC 测定, 建立了适用于地 下水、 地表水等多种水质样品中痕量到常量范围的 硝基苯和苯胺快速测定方法。 1实验部分 1. 1仪器与主要试剂 超高效液相色谱 ACQUITY UPLC 系统 美国 Waters 公司 。Millipore 超纯水机 美国 Millipore 公 司 。溶剂过滤器 1 L, 天津津腾公司 。有机系滤 膜 0. 2 μm, 美国 Life Sciences 公司 。 硝基苯标准溶液 浓度为 0. 97 mg/mL, 中国计 量科学研究院 。 苯胺标准溶液 浓度为0. 989 mg/mL, 中国计量 科学研究院 。 醋酸铵 纯度不低于 99. 0, 美国 Sigma - Aldrich 公司 。 乙腈 HPLC 级, 百灵威化学有限公司 。 超纯水 电导率 18. 2 MΩcm 。 1. 2实验条件 色谱柱 ACQUITY UPLCBEH phenyl 100 mm 2. 1 mm 1. 7 μm, 美国 Waters 公司 , 柱温 30℃。 流动相 A 泵乙腈, B 泵醋酸铵溶液 20 mmol/L, pH 为 6 ~7 , 流速 0. 3 mL/min。紫外波长 262 nm, 荧光波长 λex /λ em280 nm/340 nm, 进样量 10 μL。 硝基苯、 苯胺梯度洗脱程序见表 1。 表 1梯度洗脱程序 Table 1Gradient elution procedure 时间 t/min 流动相 A 流动相 B 02080 0.5100100 3.0100100 4.02080 1. 3样品前处理 准确量取 900 μL 水样与 100 μL 乙腈混匀, 用 0. 2 μm 有机系微孔滤膜过滤, 收集到样品瓶中, 直 接进行 UPLC 检测。 2结果与讨论 2. 1流动相的优化 流动相是液相色谱分析方法优化的一个重要参 数, 它能影响检测目标化合物的分离效果和灵敏度。 实验考察了甲醇 - 水和乙腈 - 水两种不同流动相体 系对硝基苯和苯胺分析的影响。从图 1A 可以看 出, 使用甲醇体系时, 硝基苯保留时间靠后; 苯胺在 色谱柱上的保留较弱, 响应值较低, 色谱峰较宽。使 用乙腈体系作为流动相时, 硝基苯和苯胺均能获得 较强的保留、 较高的响应值和对称的色谱峰, 最后选 择乙腈体系作为流动相。 2. 2流动相 pH 的优化 溶液 pH 值的变化会改变化合物在色谱柱上保 留, 影响其分离度和灵敏度。分别使用氨水、 甲酸调 766 第 4 期黄毅, 等 超高效液相色谱法直接快速测定环境水样中硝基苯和苯胺第 31 卷 ChaoXing 图 1流动相的选择 Fig. 1Slection of the mobile phase A硝基苯 紫外检测器 ; B苯胺 荧光检测器 ; a乙腈体系; b甲醇体系。 节水相的 pH 值, 考察溶液 pH 值对硝基苯和苯胺的 影响。苯胺属于碱性化合物, 其存在形态受溶液 pH 值影响较大。在酸性条件下, 苯胺从分子状态转化为 离子状态, 无色谱响应。在碱性条件下, 苯胺色谱峰 响应值略高于中性条件。硝基苯在酸性、 中性、 碱性 条件下色谱峰响应基本一致。调节 pH 值对色谱峰 响应值提高效果有限, 中性条件下方法的检出限已能 满足要求。为简化流程, 缩短分析时间, 选定水相流 动相保持中性条件,本实验选择 pH 为6 ~7。 2. 3缓冲盐添加 在流动相中添加缓冲盐可以抑制样品组分的解 离, 增加组分在固定相上的保留, 并改善峰形。正确 选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化检出 限, 以及获得稳定的保留时间十分重要。结合文献和 实验结果, 选择醋酸铵作为缓冲盐, 并考察了水相中 醋酸铵浓度对实验结果的影响。配制 10 mmol/L、 20 mmol/L、 30 mmol/L 醋酸铵溶液分别进行实验, 结果 表明, 醋酸铵的浓度从 10 mmol/L增大到 20 mmol/L 时, 硝基苯和苯胺在色谱柱上的保留时间基本不变, 响应值未受影响。但是当其浓度达到 30 mmol/L 时, 硝基苯和苯胺在色谱柱上的保留稍降, 响应值略有下 降。最后确定水相中醋酸铵的浓度为20 mmol/L。 2. 4初始梯度的优化 梯度洗脱的变化对化合物保留时间、 色谱峰响 应值等有很大影响。图 2 显示了初始乙腈相和水相 为 80 ∶ 20、 60 ∶ 40、 50 ∶ 50、 20 ∶ 80 四种不同配比时, 硝基苯和苯胺的出峰情况。乙腈相所占比例大时, 洗脱能力强, 硝基苯和苯胺在 0. 45 ~0. 64 min 之间 出峰, 与溶剂峰分离效果不佳, 峰形拖尾, 对称性差; 水相比例增大, 保留时间延至 0. 9 min 左右。在乙 腈相和水相流动相为 20 ∶ 80, 硝基苯和苯胺色谱峰 有最佳响应, 综合考虑确定该比例作为两相初始浓 度比。 图 2初始梯度的选择 Fig. 2Slection of the initial gradient A硝基苯 紫外检测器 ; B苯胺 荧光检测器 。 aV 乙腈 ∶ V 水 80 ∶ 20; bV 乙腈 ∶ V 水 60 ∶ 40; cV 乙腈 ∶ V 水 50 ∶ 50; dV 乙腈 ∶ V 水 20 ∶ 80。 2. 5样品前处理 为优化样品前处理条件, 配制硝基苯和苯胺浓 度为 500 μg/L的水样, 直接按照不同比例与乙腈混 合均匀, 过有机系滤膜后按优化后分析条件 UPLC 测定。由图 3 可以看出, 纯水样直接测定时, 因缺乏 有机试剂保护, 滤膜对硝基苯和苯胺产生吸附导致 硝基苯和苯胺回收率都偏低; 随着有机相比例增大, 苯胺回收率基本稳定, 硝基苯回收率有所提高, 当有 机相比例达到 20 时开始降低。有机相比例为 866 第 4 期 岩矿测试 http ∥www. ykcs. ac. cn 2012 年 ChaoXing 50时, 有 “溶剂效应” 产生, 出现明显倒峰, 硝基苯 无色谱峰, 同时过多的有机相使样品被稀释, 检出限 提高。最终选定乙腈相浓度为 10进行前处理。 图 3不同样品前处理方法回收率比较 Fig. 3Recovery of different pretreatment 2. 6方法线性范围及检出限 配制硝基苯浓度为 0. 485、 1. 94、 4. 85、 19. 4、 48. 5、 194、 485、 1940、 4850 μg/L的标准系列溶液, 苯 胺浓度为0. 495、 0. 989、 4. 95、 9. 89、 49. 5、 98. 9、 495、 989、 1978 μg/L的标准系列溶液。按优化仪器条件 进行上机分析。对目标化合物不同浓度下的峰面积 进行线性回归分析, 线性范围、 相关系数及回归方程 见表 3, 结果表明, 在选定的实验条件下, 两种目标 化合物的线性相关系数均大于 0. 9950。取 3 倍信 噪比所对应的硝基苯和苯胺浓度作为方法检出限 LOD , 分别为 0. 194 μg/L和 0. 099 μg/L。 表 3硝基苯和苯胺的线性范围、 相关系数、 标准曲线参数 及检出限 Table 3The linear range,correlation coefficients and detection limits of nitrobenzene and aniline 目标 化合物 保留时间 tR/min 线性范围 ρ/ μgL-1 标准曲线方程 相关 系数 方法检出限 μgL-1 硝基苯0.980.485 ~4850 y 146.33x 21560.99900.194 苯胺0.940.495 ~1978 y 23652x -390925 0.99770.099 2. 7方法精密度及加标回收率 为验证方法的可靠性, 分别对硝基苯9. 70、 194、 1940 μg/L三个浓度水平, 苯胺9. 89、 198、 1978 μg/L 三个浓度水平的空白加标水样进行实验, 各浓度均 测定 7 次, 目标化合物平均回收率见表 4。可以看 出, 不同浓度下, 硝基苯和苯胺都有良好回收率。硝 基苯回收率范围在 98. 3 ~ 101, 相对标准偏差 RSD 在 1. 11 ~ 2. 03; 苯胺回收率范围在 98. 6 ~104, 相对标准偏差在 0. 75 ~5. 85。 表 4硝基苯和苯胺加标回收率和方法的精密度 Table 4Precision and recovery tests of the for nitrobenzene and aniline 目标化合物 添加浓度 ρ/ μgL -1 回收率 R/ RSD/ 硝基苯 9. 701011. 36 19499.32. 03 194098.31. 11 苯胺 9. 891045. 85 19898.61. 73 19781000. 75 2. 8标准物质色谱图 按照优化后方法, 硝基苯和苯胺标准物质液相 色谱图如图 4 所示。可以看出苯胺在紫外检测器上 也有响应, 但荧光检测器对苯胺选择性更高, 显著提 高方法灵敏度, 分辨率, 降低苯胺检出限。 图 4硝基苯和苯胺液相色谱图 Fig. 4Chromatograms of nitrobenzene and aniline A苯胺和硝基苯 紫外检测器 ; B苯胺 荧光检测器 。 a苯胺; b硝基苯。 966 第 4 期黄毅, 等 超高效液相色谱法直接快速测定环境水样中硝基苯和苯胺第 31 卷 ChaoXing 3实际水样分析 为验证方法的适用性, 采集地表水、 地下水、 污 水、 自来水等实际样品按优化后方法进行测定, 结果 见表 5。河水、 地下水、 自来水中都未检出硝基苯和 苯胺, 化工厂排水口处两个水样硝基苯和苯胺均有 检出, 但都未超过国家污水排放标准。 表 5实际水样测定结果 Table 5Analytical results of nitrobenzene and aniline in practical samples 样品 ρ/ μgL -1 硝基苯苯胺 河水<0. 194<0.099 化工厂排水 10. 72 0. 19 化工厂排水 20. 87 0. 23 地下水<0. 194<0.099 自来水<0. 194<0.099 4结语 通过对流动相、 缓冲盐、 初始梯度等分析条件的 优化, 建立了超高效液相色谱直接快速测定环境水 样中硝基苯和苯胺的分析方法。与传统液相分析方 法相比, 本方法采用 UPLC 技术, 线性范围更宽, 灵 敏度更高; 硝基苯和苯胺的检出限分别为 0. 194 μg/L和 0. 099 μg/L, 线性范围分别是 HPLC 直接进 样方法 [20 ]的 2. 5 倍和 4 倍。直接进样简化了前处 理环节, 减少采样体积和有机试剂的使用; 分析效率 高, 可在 2 min 内完成从前处理到上机测定整个流 程。满足大批量地质调查样品的快速检测要求, 适 用于地下水、 地表水等多种水质样品中痕量到常量 范围的硝基苯和苯胺快速测定。 5参考文献 [ 1]EPA/635/R - 08/004F,Toxicological Review of Nitro- benzene[ S] . 2009 5 -15. 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