高效液相色谱法测定盐酸阿考替胺三水合物工业品含量_周圩群(1).pdf

2014 年 12 月 December 2014 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 33，No． 6 871 ～875 收稿日期 2014 －07 －01; 修回日期 2014 －10 －05; 接受日期 2014 －11 －15 基金项目 国家重点基础研究发展计划 973 计划 项目 2011CB911003 ; 国家自然科学基金项目 21275069 ; 南京大学分析测试基金 作者简介 周圩群， 实验师， 主要从事色谱分离和分析。E- mail zwq66440126． com。 通讯作者 练鸿振， 教授， 博士生导师， 主要从事色谱分离和分析。E- mail hzlian nju． edu． cn。 文章编号 02545357 2014 06087105 DOI 10． 15898/j． cnki． 11 －2131/td． 2014． 06． 018 高效液相色谱法测定盐酸阿考替胺三水合物工业品含量 周圩群1，乔俊琴2，练鸿振2* 1． 南通市广播电视大学，江苏 南通 226006; 2． 生命分析国家重点实验室，南京大学化学化工学院和现代分析中心，江苏 南京 210093 摘要 盐酸阿考替胺三水合物为第一个胃肠蠕动改善药物， 用来治疗功能性消化不良， 作为一种新药， 其分 析测定方面的报道甚少， 已有的报道采用高效液相色谱 HPLC 以甲醇 － 磷酸二氢钾 － 辛烷磺酸钠为流动 相进行测定， 由于使用了离子对试剂辛烷磺酸钠， 因而分析过程比较耗时且保留不够稳定。本文基于盐酸阿 考替胺三水合物为两性化合物， 建立了测定其含量的高效液相色谱分析方法。测定方法采用 C18 色谱柱 4． 6 mm 150 mm， 5 μm ， 以甲醇 －20 mmol/L 乙酸铵水溶液 45 ∶ 55 V/V 为流动相 pH 6． 8 进行等度 洗脱， 紫外检测波长选择 280 nm， 盐酸阿考替胺三水合物的保留时间合适且峰形较好， 出峰时间为 8 min， 总 分析时间为 23 min。在优化色谱条件下， 盐酸阿考替胺三水合物的浓度在 0． 0006 ～1． 0 mg/mL 范围内线性 关系良好， 检出限为 0． 0002 mg/mL， 日内、 日间测定的相对标准偏差 RSD 均小于 1． 0。该方法不添加离 子对试剂， 有利于色谱系统的快速平衡， 提高了实验的重复性和可操作性， 可对盐酸阿考替胺三水合物工业 品进行快速分析， 实现对原料药的质量控制。 关键词 高效液相色谱法; 盐酸阿考替胺三水合物; 辛烷磺酸钠; 甲醇 － 乙酸铵; 质量控制 中图分类号 O657． 72; O213． 1文献标识码 A 盐酸阿考替胺是由日本 Zeria 公司研制的一种 新型 Ml、 M2 受体拮抗剂， 临床上用于提高胃的蠕 动， 以治疗功能性消化不良 ［1 ］， 2013 年 2 月在日本 批准上市。与一般促胃肠动力药 伊托必利、 莫沙 比利 不同， 盐酸阿考替胺能够通过促进肠内胆碱 神经末梢乙酰胆碱的释放来提高胃肠蠕动 ［2 －8 ］ ， 为 第一个胃肠蠕动改善药物。盐酸阿考替胺三水合物 的化学名为 N － { 2 －［ 1 － 甲基乙基］乙基} － 2 － ［ 2 － 羟基 －4， 5 － 二甲氧基苯甲酰基 氨基］ 噻唑 －4 － 甲酰胺盐酸盐三水合物 结构图见图 1 。目 前， 促胃动力药占消化道用药的市场份额呈现出快 速增长的趋势， 因此， 盐酸阿考替胺三水合物有着巨 大的市场前景。本世纪初， 国外已有盐酸阿考替胺 水合物合成方法的报道 ［9 ］。近年来， 国内外相继出 现多个关于盐酸阿考替胺以及盐酸阿考替胺三水合 物合成方法的专利 ［10 －15 ］。对于一个产品， 分析测试 不仅可以对产品的质量进行检验， 还对产品研发和 生产起着重要的指导作用 ［16 ］， 然而对盐酸阿考替胺 三水合物分析方法的公开报道甚少， 目前只有 Furuta 等 ［17 ］报道了用固相萃取提取狗血中盐酸阿 考替胺三水合物， 以甲醇 － 磷酸二氢钾 － 辛烷磺酸 钠为流动相采用高效液相色谱 HPLC 进行测定的 方法。该方法使用的离子对试剂辛烷磺酸钠， 在流 动相中使用时， 系统前平衡和后冲洗均需较长时间， 因而整个分析过程比较耗时。此外， 离子对试剂对 pH 值比较敏感， 配制流动相时要求精确度较高， 直 接影响了实验的重复性和重现性。 HPLC 因其快速、 准确、 测试条件温和等优点， 在 有机化合物分离、 分析中发挥着重要作用。本文拟建 立一种更为简单的 HPLC 方法， 通过改变流动相组成 包括流动相种类、 有机相比例、 缓冲盐浓度 和检测 波长来优化色谱条件， 实现对盐酸阿考替胺三水合物 快速、 准确的测定， 为盐酸阿考替胺三水合物的合成 和提纯工艺质量控制提供可靠的依据。 178 ChaoXing 图 1盐酸阿考替胺三水合物结构图 Fig． 1Structure diagram of acotiamide hydrochloride trihydrate 1实验部分 1． 1仪器与主要试剂 Agilent 1200 高效液相色谱仪 美国 Agilent 公 司 ， 配有四元泵 包含真空脱气机 ， 自动进样器， 智能型柱温箱， 二极管阵列检测器 DAD 。 甲醇、 乙腈均为 HPLC 级， 购自 Honeywell 公司 Honeywell Burdick ＆ Jackson， Muskegon， MI， USA ; 乙酸铵为分析纯 购自南京化学试剂有限公 司， 南京 ; 冰乙酸为分析纯 购自国药集团化学试 剂有限公司， 上海 ， 氨水为分析纯 购自南京化学 试剂有限公司， 南京 ; 纯净水 购自杭州娃哈哈集 团有限公司， 杭州 。 盐酸阿考替胺三水合物对照品 ≥99． 5 和 粗品均购自南京复兴生物有限公司。 1． 2色谱条件 色谱柱 Ultimate XB － C18 柱 4． 6 mm 150 mm， 5 μm 购自月旭材料科技 上海 有限公司; 柱 温 30℃; 流动相 甲醇 － 20 mmol/L 乙酸铵水溶液 45 ∶ 55 V/V ; 流速 1． 0 mL/min; 进样量 10 μL; 检测波长 280 nm。 1． 3对照溶液及样品溶液的配制 精确称取盐酸阿考替胺三水合物对照品 25 mg 于 25 mL 容量瓶中， 以流动相溶解， 并定容， 配制成 1 mg/mL 的储备溶液， 分别用流动相稀释成 0． 5、 0． 4、 0． 2、 0． 1、 0． 05、 0． 02、 0． 01、 0． 005、 0． 002、 0． 001、 0． 0006、 0． 0005 和 0． 0001 mg/mL 的系列标 准溶液， 待用。 精确称取盐酸阿考替胺三水合物粗品 10 mg 于 25 mL 容量瓶中， 以流动相溶解并定容。 2结果与讨论 2． 1流动相种类的选择 分别用甲醇 － 水、 乙腈 － 水、 甲醇 － 乙酸铵水溶 液、 乙腈 － 乙酸铵水溶液作为流动相。以甲醇 － 水 和乙腈 － 水分别作为流动相时， 盐酸阿考替胺三水 合物峰形展宽严重， 而以甲醇 － 乙酸铵水溶液和乙 腈 － 乙酸铵水溶液作为流动相时， 样品的保留时间 合适且峰形较好， 这是由于盐酸阿考替胺三水合物 为两性化合物， 必须在一定的 pH 缓冲环境下才能 得到好的峰形。考虑甲醇的毒性较乙腈低， 且价格 较便宜， 故选择甲醇 － 乙酸铵水溶液作为流动相。 2． 2有机调节剂比例的选择 固定其他色谱条件不变， 通过改变流动相中甲 醇的比例优化盐酸阿考替胺三水合物的分离 见图 2 。从图2 中可以看出， 55甲醇时， 杂质1、 2 重叠 在一起并与主峰部分重叠; 50甲醇时， 杂质 1、 2 分 离虽有改善， 杂质 2 与主峰依然没有完全分离。随 着甲醇比例的降低， 主峰与杂质峰均得到良好分离， 但当甲醇比例下降至 40时， 杂质 4 在 50 min 时还 没有完全出峰; 而当甲醇比例降至 35 时， 50 min 内杂质 3 和 4 都未出峰。考虑到主峰与杂质峰的分 离情况以及合适的分析时间， 甲醇比例选择 45 为 最佳有机调节剂比例。该条件下， 盐酸阿考替胺三 水合物出峰时间为 8 min， 总分析时间为 23 min， 优 于文献［ 17］ 中报道方法。 图 2盐酸阿考替胺三水合物粗品在不同甲醇比例下的 色谱图 Fig． 2HPLC chromatograms of acotiamide hydrochloride trihydrate products under different methanol ratio 2． 3缓冲溶液 pH 值的选择 保持乙酸铵浓度为 20 mmol/L 不变， 用冰乙酸 或氨水分别调节其 pH 值在 5． 5 ～ 7． 5 之间。考察 流动相的 pH 值对保留时间及峰形的影响。结果表 明， pH 值的改变对保留时间影响不大， 只会影响盐 278 第 6 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2014 年 ChaoXing 酸阿考替胺三水合物的峰形。当 pH 值在 6． 5 ～7． 0 之间时主峰峰形对称性均良好， 本实验选择缓冲溶 液的 pH 6． 8。 2． 4缓冲盐浓度的选择 保持其他条件不变， 分别配制 10、 15、 20、 30、 40、 50 mmol/L 的乙酸铵缓冲溶液 pH 6． 8 进行 样品测定， 分析结果显示， 当缓冲盐浓度小于 20 mmol/L 时， 盐酸阿考替胺三水合物保留不稳定， 当 缓冲盐浓度在 20 ～50 mmol/L 之间时， 峰形良好， 保 留稳定且差异不大， 考虑高浓度缓冲盐对色谱柱可 能的损伤， 故选择缓冲盐浓度为 20 mmol/L。 2． 5检测波长的选择 用二极管阵列检测器在 210 ～400 nm 波长下进 行扫描， 盐酸阿考替胺三水合物的紫外特征吸收波 长为220 nm、 280 nm 和355 nm 图3 ， 其中， 220 nm 为末端吸收， 甲醇和乙酸铵在此波长下会有较强的 背景吸收， 而 280 nm 比355 nm 吸收要强， 因此选择 280 nm 为检测波长。 图 3盐酸阿考替胺三水合物紫外吸收光谱 Fig． 3UV spectrum of acotiamide hydrochloride trihydrate 2． 6标准曲线与方法检出限 以峰面积 A，μVS 对标准溶液的质量浓度 ρ， mg/mL 进行线性回归， 在 0． 0006 ～ 1． 0 mg/mL 浓度范围内， 盐酸阿考替胺三水合物线性良好， 线性 回归方程为 Y 34． 57 17083． 72X， 相关系数 r2 0． 9998。其中对浓度为 0． 002 mg/mL 的标准溶液 重复进样 5 次， 盐酸阿考替胺三水合物峰面积相对 标准 偏 差 RSD 为 0． 14。在 3 倍 信 噪 比 S/N 3 时， 测得方法的检出限 LOD 为0． 0002 mg/mL， 10 倍信噪比 S/N 10 时， 测得方法的定量 限 LOQ 为 0． 0006 mg/mL。 3样品分析 精确称取盐酸阿考替胺三水合物粗品 10 mg 于 25 mL 容量瓶中， 以流动相溶解并定容， 连续配制 5 份， 每份样品重复进样2 次并用外标法进行日内含量 测定。以同样方法每天配制一份盐酸阿考替胺三水 合物粗品溶液， 连续配制5 天， 进行日间含量测定， 测 定结果见表1。日间、 日内含量在 91． 31 ～92． 68 之间， RSD 均小于1， 表明方法具有良好的精密度， 适用于盐酸阿考替胺三水合物工业品的分析。 表 1盐酸阿考替胺三水合物样品测定 Table 1Determination of acotiamide hydrochloride trihydrate in crude samples 平行样品日内测定含量 日间测定含量 192．0492．19 291．3192．47 392．1792．21 492．0791．46 592．4792．68 平均值92．0192．20 RSD 0．460．50 4结语 针对盐酸阿考替胺三水合物的结构， 采用 HPLC 法对其进行分析测定， 主要难点是选择合适 的缓冲盐和合适的 pH 值， 提高分析的重复性和可 操作性。本研究建立的 HPLC 方法采用 C18 4． 6 mm 150 mm， 5 μm 色谱柱为主流通用柱， 以甲醇 － 乙酸铵水溶液 20 mmol/L， pH 6． 8 作流动相有 利于色谱系统的快速平衡。该方法为盐酸阿考替胺 三水合物药物的快速分析提供了基础， 可用于盐酸 阿考替胺三水合物工业品的检测， 并用于原料药的 质量控制。 5参考文献 ［ 1］Seto K，Sasaki T，Kstdunuma K，Kobayashi N，Tanaka K，Tack J． Acotiamide hydrochloride Z- 338 ，a novel prokinetic agent，restores delayed gastric emptying and feeding inhibition induced by restraint stress in rats［ J］ ． Neurogastroenterol Motility，2008，20 5 1051 － 1059． ［ 2］Nakajima T，Nawata H，Ito Y． Z- 338，a newly synth- etizedcarboxyamidederivative， stimulatesgastric motility through enhancing the excitatory neurotrans- mission［ J］ ． Journal of Smooth Muscle Research，2000， 36 2 69 －81． 378 第 6 期周圩群， 等 高效液相色谱法测定盐酸阿考替胺三水合物工业品含量第 33 卷 ChaoXing ［ 3］Ogishima M，Kaibara M，Ueki S，Kurimoto T，Taniyama K． Z- 338 facilitates 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of Analytical Chemistry for Life Science， School of Chemistry ＆ Chemical Engineering and Center of Materials Analysis，Nanjing University，Nanjing 210093，China Abstract Acotiamide hydrochloride trihydrate，which is the first gastrointestinal prokinetic agent，has been proven effective in treating functional malnutrition． There is little in analyzing this new medicine． The only reported is using High Perance Liquid Chromatography HPLC ，with methanol- monopotassium phosphate- sodium octanesulfonate as the mobile phase． However，this is time wasting and unstable because of the using of an ion paring agent in the mobile phase． In this paper，a new HPLC is established to quantitatively analyze industrial acotiamide hydrochloride trihydrate based on its amphoteric structure．The separation is accomplished in a C18 column 4． 6 mm 150 mm， 5 μm with methanol and 20 mmol/L ammonium acetate 45 ∶ 55，V/V aqueous solution pH 6． 8 as the mobile phase． The detection wavelength is set at UV 280 nm． The retention time of acotiamide hydrochloride trihydrate is 8 min with good peak shape，and the total analysis time is 23 min． Under the optimized chromatographic condition，the calibration curve of acotiamide hydrochloride trihydrate is linear in the range of 0． 0006 and 1． 0 mg/mL，detection limit is 0． 0002 mg/mL，and both the intra-and inter- day relative standard deviations RSDs are lower than 1． This contains no ion paring agent，benefiting the rapid balance of chromatographic condition and improving the analysis repeatability and maneuverability． The can be pered for rapid detection of acotiamide hydrochloride trihydrate and used in the quality control of raw medicine． Key words High Perance Liquid Chromatography HPLC ; acotiamide hydrochloride trihydrate; sodium octanesulfonate; methanol- ammonium acetate;  quality control 分析测试学报 2015 年征订启事 国内刊号 CN 44 －1318/TH邮发代号 46 －104 国际刊名代码 CODEN FCS 国际标准刊号 ISSN 1004 －4957国外代号 BM 6013 广告经营许可证 440000100186 分析测试学报 是由中国广州分析测试中心、 中国分析测试协会共同主办的全国性学术刊物， 中文核心期刊。刊登质谱 学、 光谱学、 色谱学、 波谱学、 电化学、 电子显微学等方面的分析测试新理论、 新方法、 新技术的研究成果， 介绍新仪器装置及在 生物、 医药、 化学化工、 商检、 食品检验等方面实用性强的实验技术。适合科研院所、 高等院校、 检测机构、 医药、 卫生以及厂矿 企业分析测试工作和管理人员阅读。 经过多年的发展， 本刊已成为国内知名的化学类核心期刊。2011 年， 影响因子在全国化学类刊物排名中位列第 5 名， 被 引频次每年递增约 30， 稿源丰富， 基金论文比超过 70。近几年， 本刊刊发的论文被 CA 美国化学文摘 收录率达 94， 2006 年引文频次在 CA 千种表中国部分中列第 38 名， 并被国际上其它知名的数据库如日本科技文献速报、 俄罗斯文摘、 英国 分析文摘 AA 、 质谱公报 等收录。在 中文核心期刊要目总览 2011 年版的化学类期刊列第 9 位; 入选 2012 年度 “中国国 际影响力优秀学术期刊” ; 进入由全国 8000 种期刊遴选出的 500 种科技期刊组成的 “中国科技期刊精品数据库” ; 本刊是中国 学术期刊综合评价数据库 CAJCED 统计刊源; 中国科技论文统计源期刊 中国科技核心期刊 ; 中国科学引文数据库 来源 期刊; 中国期刊全文数据库 CJFD 收录期刊 ; 中国核心期刊 遴选 数据库 收录 ; 中国学术期刊 光盘版 全文收录期刊; 中国期刊网 全文收录期刊 ; 中国学术期刊文摘 中、 英文版 源期刊。 本刊为月刊，国内外公开发行。大 16 开， 单价 18． 00 元/册， 全年 216 元。请在全国各地邮局订阅。未在邮局订到者可 直接向本编辑部补订。补订办法 请从邮局汇款至广州市先烈中路100 号 分析测试学报 编辑部， 邮编 510070， 写明订户单 位、 详细地址、 收刊人姓名、 邮编及补订份数 全年或某期 ，电话 020 87684776 或 37656606， http / /www． fxcsxb． com 可在 线投稿 ， E － mail fxcsxb china． com。 578 第 6 期周圩群， 等 高效液相色谱法测定盐酸阿考替胺三水合物工业品含量第 33 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