两种纯化方法获得脂肪酸的链长及碳同位素分布特征对比_赵江涛.pdf

2013 年 2 月 February 2013 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 32，No． 1 101 ～107 收稿日期 2012 －07 －12; 接受日期 2012 －08 －27 基金项目 国家自然科学基金项目 41073018 ; 国家重点基础研究发展计划 973 计划 项目 2010CB833400 ; 黄土与第四 纪地质国家重点实验室开放基金 SKLLQG1048 作者简介 赵江涛， 博士研究生， 第四纪地质学专业， 主要研究方向为稳定同位素地球化学。E- mail zhaojt ieecas． cn。 通讯作者 刘卫国， 研究员， 从事同位素生物地球化学研究。E- mail liuwg loess． llqg． ac． cn。 文章编号 02545357 2013 01010107 两种纯化方法获得脂肪酸的链长及碳同位素分布特征对比 赵江涛1， 2，刘卫国1， 3*，安芷生1 1． 中国科学院地球环境研究所黄土与第四纪地质国家重点实验室，陕西 西安710075; 2． 中国科学院研究生院，北京100049; 3． 西安交通大学人居环境与建筑工程学院，陕西 西安710049 摘要 饱和脂肪酸及其同位素组成是重建古环境和古气候的重要代用指标， 目前存在多种提取及纯化流程。 在全球变化研究中， 基于不同原理的纯化流程得到的脂肪酸含量及其同位素组成是否一致， 直接影响着该指 标应用于不同区域重建结果的对比。本文用两种常见的脂肪酸纯化流程提取脂肪酸标准、 现生植物和泥炭 样品类脂物， 通过对比发现 对脂肪酸标准两种流程都可以得到纯净的单体脂肪酸， 而且回收率均较高 85以上 ， 都是较为可靠的脂肪酸纯化流程; 然而对于天然样品， 虽然高碳数脂肪酸 碳数 ＞ C24 的回收 率相近， 流程 1 却能够获得相对较多的低碳数饱和脂肪酸， 如泥炭样品中该流程获得的 n － C22脂肪酸是 流程 2的 3 倍; 两种流程纯化狗尾草 Setaira viridis 和三叶草 Trifolium repens 得到 n － C16脂肪酸的 δ13C 不 同， 流程 1 分别为 －21． 1‰和 －36． 2‰; 流程 2 分别为 －23． 3‰和 －34． 9‰， 表明两个实验流程得到的低碳 数脂肪酸的含量、 脂肪酸链长分布模式以及碳同位素组成均存在明显的差异。实验结果显示， 流程 2 分离纯 化样品可得到几乎全部的游离态脂肪酸， 而流程 1 可提纯样品中游离态和酯态存在的总脂肪酸。由于在沉 积物中游离态脂肪酸和酯态脂肪酸可以相互转化， 因此使用流程 1 分析样品中的总脂肪酸更为合适， 也可以 将类脂物皂化使酯态脂肪酸释放为游离态， 然后使用流程 2。 关键词 脂肪酸; 链长分布特征; 碳同位素组成; 脂肪酸纯化流程 中图分类号 O613． 71; O628文献标识码 A 脂肪酸是许多有机体的主要组成部分， 普遍存 在于各种地质样品中， 饱和脂肪酸及其同位素组成 作为古气候代用指标已广泛应用于重建古环 境 ［1 －5 ］。Hughen 等［5 ］利用饱和脂肪酸的平均链长 及碳同位素组成重建了北美地区末次冰消期古植被 的变化特征; Naraoka 等 ［3 ］通过长链脂肪酸的分子 特征及碳同位素组成探讨了西北太平洋沉积物中有 机质的来源; Gao 等 ［6 ］通过建立数学模型研究了湖 泊沉积物中 n － C20和 n － C22脂肪酸主要来源; Tierney 等 ［4 ］使用湖泊沉积物中脂肪酸氢同位素重 建了非洲 Tanganyika 湖六万年以来降水的变化。 目前各实验室关于饱和脂肪酸的提取及纯化流 程并不一致， 甚至同一实验室在不同时期使用的方 法也有所差异， Sessions 等 ［7 ］、 Li 等［8 ］在分离脂肪酸 时所使用甲酸的浓度并不相同。不同方法纯化得到 的脂肪酸含量及其同位素组成是否一致， 直接影响 着该指标应用于不同区域研究结果的对比， 然而目 前还未见报道不同脂肪酸纯化方法之间的对比试 验。本文通过对比两种常见的脂肪酸纯化流程， 研 究实验流程的差异是否会影响脂肪酸的含量及其同 位素组成。使用两种流程分别处理了标准物质、 植 物叶片及泥炭等样品， 对比饱和脂肪酸的分布模式 及碳同位素组成的差异， 讨论了样品中脂肪酸的来 源及存在形式， 并对如何选取适当的脂肪酸纯化流 程处理样品提出建议。 1实验部分 1． 1样品和主要试剂 饱和脂肪酸标准样品 含 C12～ C24和 C30 为色 谱纯级， 德国 Meker 公司产品， 其余实验样品来自植 101 ChaoXing 物叶片样品和内蒙古多尔计沼泽泥炭样品抽提所得 脂类成分。 正己烷 色谱纯 ， 100 g/L 硝酸银硅胶 约 0. 074 mm 美国 Sigma － Aldrich 公司产品 ; 硅胶 0. 074 ～ 0. 038 mm 美国 Merck 公司产品 ; LC － NH2 美国 SUPLCO 公司产品 ; 二氯甲烷 DCM 、 甲醇和乙酰氯 均为色谱纯 德国 Meker 公司产 品 ; 氯化钠 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 产品 ; 冰乙酸 HPLC 级 天津科密欧化学试剂有限 公司产品 ; 异丙醇 IPA 和乙酸乙酯 色谱纯 德国 CNW Technologies GmbH 公司产品 。 1． 2饱和脂肪酸的提取及纯化流程 流程 1 下文的图表以 SNS 代替 ［9 －11 ］将获得 的类脂物在微弱 N2下吹干后直接用盐酸化甲醇在 60℃加热条件下酯化 12 h 盐酸化甲醇的配制方 法， V 甲醇 ∶ V 乙酰氯 95 ∶ 5， 为避免反应过于 剧烈， 将乙酰氯缓慢滴入到经过冷冻的甲醇中， 甲醇 冷冻时间要大于 30 min， 在酯化后的样品中加入 1 mL 50 g/L NaCl 溶液， 用 4 mL 正己烷分三次萃 取， 然后通过硅胶柱 柱内径为6 mm、 硅胶填充长度 为 4 cm， 硅胶使用前需在 40℃ 条件下活化至少 24 h 进行纯化， 即先用 4 mL 正己烷将烷烃组分洗 脱 洗脱过程中需要使用氮气加压 ， 再用 4 mL 二 氯甲烷将脂肪酸甲酯及酮类化合物洗脱下来。接着 将得到的脂肪酸甲酯等样品加到硝酸银硅胶柱上 柱内径为 6 mm、 硅胶填充长度为 4 cm， 100 g/L 硝 酸银硅胶使用前需在 40℃条件下活化至少 24 h ， 分别用 15 mL 正己烷 － 二氯甲烷 体积比 4 ∶ 1 和 4 mL二氯甲烷 － 乙酸乙酯 体积比 4 ∶ 1 将饱和脂 肪酸甲酯与不饱和脂肪酸甲酯及酮类分离 ［9 ］。最 后将饱和脂肪酸甲酯组分可进行气相色谱以及单体 脂肪酸稳定碳同位素分析。 流程2 下文的图表以 SPE 代替 ［ 2， 12 ］将抽提得 到的类脂物直接加到氨基硅胶柱 LC － NH2， 不用活 化 ， 分别用4 mL 二氯甲烷 －异丙醇 体积比2 ∶ 1 和4 mL 含4乙酸的乙醚将中性组分与酸性组分洗 脱 固相萃取法， 洗脱过程中需要 N2加压 ， 然后将酸 性组分吹干后在 60℃ 加热条件下用甲醇 － 乙酰氯 体积比95 ∶ 5， 1 mL 进行酯化， 酯化后的样品经过 萃取后在硅胶柱 柱内径为 6 mm、 硅胶填充长度为 4 cm， 硅胶使用前需在40℃条件下活化至少 24 h 上进 一步纯化除去带羟基的脂肪酸， 所得样品即纯净的脂 肪酸甲酯可进行色谱以及单体脂肪酸稳定碳氢同位 素分析 ［ 13 ］。为保证实验流程的质量， 实验过程中均 附有空白实验， 测试结果未发现文中所讨论的有机 组分。 1． 3仪器及工作条件 Agilent 6890 气相色谱仪 美国 Agilent 公司 ， 色谱柱为 HP －1MS 型毛细管柱 60 m 0. 32 mm 0. 25 μm 。载气为氦气 流量 1. 3 mL/min ， 分流 比为 4 ∶ 1， 汽化室温度 310℃， 进样量 1 μL， FID 检 测。升温程序 40℃ 保持 1 min， 10℃ /min 升温至 150℃， 6℃ /min 升温至 315℃， 恒温 20 min。饱和脂 肪酸定性由标准样品和碳数规律得出。 气相色谱 － 燃烧 － 同位素比值质谱仪 GC － GC/C － IRMS 进行单体饱和脂肪酸甲酯单体化合 物碳同位素测定。GC － GC/C － IRMS 由 Thermo Trace Ultra 气相色谱仪与高温裂解装置在线连接的 Thermo Delta V Advantage 同位素比值质谱仪组成。 单个化合物经气相色谱分离后依次进入热解装置， 并在 950℃ 下与 CuO 反应生成 CO2， 然后 CO2被载 气带入同位素比值质谱仪进行碳同位素组成的测 定。色谱柱和升温程序与进行 GC 分析时完全一 致。在每 6 次样品注射后均测量一套具有已知同位 素值的饱和脂肪酸标准来检测分析的准确性， 分析 误差小于 0. 3‰。土壤类脂物饱和脂肪酸组分分 布和碳同位素分析实验均在中国科学院地球环境研 究所同位素实验室完成。酯化中引入甲基的碳同位 素校正方法如下 δ13Creal n 1 δ13Cmeasured50． 5 n 式中， n 代表单体化合物中碳的个数， δ13Creal为脂肪 酸的真实值， δ13Cmeasured为测量值 ［14 ］。 2结果与讨论 2． 1实验流程回收率的检验 为考察两种脂肪酸纯化流程的可靠性， 本文首 先使用脂肪酸标准检验实验的流程回收率。分别称 取约 3 mg 的 n － C12～ n － C24和 n － C30脂肪酸溶于 15 mL 甲苯中， 在超声振荡条件下混合均匀。分别 量取 0． 2 mL 脂肪酸标准样品通过流程 1 Sed － SNS 和流程 2 Sed － SPE 实验流程进行纯化， 样品 纯化后使用气相色谱定量， 然后计算实验流程的回 收率 图 1 。从实验结果可以看出两种流程对单体 脂肪酸标准的回收率均较高， 除 n － C12脂肪酸外回 收率都超过了 85， n － C12脂肪酸回收率较低可能 是由于实验过程中过度吹干样品导致的 图 1 。因 此， 两种方法都是较为可靠的脂肪酸纯化流程。 201 第 1 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 图 1脂肪酸标准在不同实验流程中的回收率 Fig． 1The recovery rate of standard fatty acids by different purification procedures 表 1不同流程纯化狗尾草、 三叶草和多尔计泥炭类脂物得到的各单体脂肪酸含量 Table 1The individual fatty acid content of Setaira viridis， Trifolium repens and Duoerji peat samples by different purification procedures 样品 编号 脂肪酸含量 w/ μgg －1 C12C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C24C25C26C27C28C29C30C31C32 ACL16 －32ACL20 －32 C16FA δ13C/‰ SD GW- SNS 290111 40 2410 56 436 10431 2645636284209679012124338218．8823．56－21． 1 0． 05 GW- SPE 12012718363802482463864989316 138289024．2728．11－23． 3 0． 20 SY- SNS190150 59 2354 5669911 322 2320657202225014601565312318．0223．15－36． 2 0． 02 SY- SPE100771666405105107175127301260113221．7128．11－34． 9 0． 19 Sed- SNS－－－－25231268747138613 1045684201323． 724．65－－ Sed- SPE－－－－50601021685410916936422826． 226．54－－ 注 样品编号中 GW、 SY 和 Sed 分别代表狗尾草、 三叶草、 沉积物; ACL16 －32代表 C16～ C32脂肪酸的平均链长 Average chain length，ACL ; SD 代表两次测量之间的标准偏差 Standard deviation 。 2． 2不同方法得到的饱和脂肪酸组分分布及 碳同位素组成 2． 2． 1泥炭样品脂肪酸链长分布对比 本文选取3． 2 g 冷冻干燥的内蒙古多尔计沼泽 泥炭样品， 使用约 50 mL 二氯甲烷 － 甲醇混合液 体 积比9 ∶ 1 在超声振荡条件下分 3 次抽提， 然后将抽 提物平均分为 8 份， 在微弱高纯氮气下吹干， 分别用 两种流程对其中两份样品进行脂肪酸提纯实验。 实验结果如图2 所示， 两种流程均可以得到纯净 的各单体脂肪酸， 而且高碳数脂肪酸 碳数 ＞ C24 含 量相近， 但流程1 Sed －SNS 得到的低碳数脂肪酸明 显高于流程2 Sed － SPE， 图 2， 其原因将在下文中详 细讨论 ， 其中 n －C22脂肪酸含量达流程2 的3 倍， 以 致单体脂肪酸分布模式差别很大。两种方法纯化同 一样品得到的饱和脂肪酸平均链长 ACL16 －32分别为 23．7 流程1 和26．2 流程2， 表1 。 图 2不同纯化方法得到的多尔计泥炭样品中单体脂肪酸 的链长分布模式 Fig． 2The individual fatty acids distribution patterns of Duoerji peat samples purified by different procedures 由于流程 2 中分离脂肪酸的基本原理是， 氨基 硅胶柱中的氨基对脂肪酸有很强的吸附力， 只有酸 性较强的酸 如乙酸 才能将脂肪酸从氨基硅胶柱 上置换下来， 然而不同的实验室使用酸的种类和浓 度并不相同 ［3， 7， 15 ］。为了检验洗脱试剂中酸的浓度 是否影响样品中脂肪酸的回收率， 本文尝试通过改 变洗脱试剂中乙酸与乙醚的比例 乙酸浓度为 2、 4、 10和 20 ， 纯化等量的多尔计泥炭类脂物， 试验脂肪酸的量是否有变化。结果显示， 随着洗脱 试剂中乙酸浓度的增加， 得到脂肪酸的含量并未见 显著增加， 而且得到的单体脂肪酸分布模式也较为 一致 表 2 ， ACL16 －32和 ACL20 －32分别为25．95 0．10、 26． 20 0． 07。因此， 应用 SPE 法分离纯化脂肪酸 时， 洗脱试剂中乙酸的浓度不会对脂肪酸回收率造 成影响。 301 第 1 期赵江涛， 等 两种纯化方法获得脂肪酸的链长及碳同位素分布特征对比第 32 卷 ChaoXing 表 2不同浓度的乙酸洗脱多尔计泥炭样品的各单体脂肪酸相对于 C 26脂肪酸的含量 Table 2The relative content of individual fatty acid of Duoerji peat sample eluted by different concentration of acetic acids 乙酸浓度 脂肪酸相对含量 w/ 相对于 n － C26FA C16C17C18C19C20C21C22C23C24C25C26C27C28C29C30C31C32 ACL16 －32ACL20 －32 250621632110646100149611328625．8526． 14 440501522010611110081026373726．0826． 30 1050511632110631110010988358725．9526． 21 205052153211063610011996341425．9026． 16 平均值/505 1153211063810011998345625．9526． 20 标准偏差 0．570．000． 39 0． 940．630．380．700．33 1．143．060．002．792．582． 402． 06 3．271． 400．100．07 2． 2． 2现生植物脂肪酸链长分布及碳同位素组成 对比 为了进一步对比两种流程纯化结果的差别， 本 文再次对狗尾草 Setaira viridis 和三叶草 Trifolium repens 两种植物进行对比试验。植物叶片采集后用 去离子水清洗， 在通风干燥箱内烘干 40℃ 。然后 分别称取 0． 21 g 狗尾草 GW 和 0． 15 g 三叶草 SY， 植物只选取叶片 ， 在超声条件下各自用 15 mL 二氯甲烷 － 甲醇 体积比 9 ∶ 1 抽提 3 次， 得到 的溶液在柔弱的氮气下吹干后分别使用两种流程纯 化样品。 如表 2 所示， 实验结果与泥炭样品的实验结果 相似， 高碳数部分 ＞ C24 两者相当， 流程 1 得到的 低碳数脂肪酸要远高于流程 2 图 3 。单体脂肪酸 的分布模式也存在较大的差异， 流程 2 得到的脂肪 酸 ACL16 －32远高于流程 2 表 1 。饱和脂肪酸碳同 位素组成在重建古环境的研究中扮演着越来越重要 的角色， 本文进一步分析不同流程纯化得到的脂肪 酸的碳同位素组成是否一致。两种流程纯化狗尾草 和三 叶 草 得 到 n － C16脂 肪 酸 的 δ13C 分 别 为 －21． 1‰和 － 36． 2‰ 流 程 1 ，－ 23． 3‰ 和 －34． 9‰ 流程 2 ， 存在明显差异。 从本文的实验结果可以看出， 不同的实验流程 纯化天然样品得到的低碳数脂肪酸的含量、 分布模 式以及碳同位素组成存在明显的差异。类脂物的链 长分布用于判定有机物来源有较广泛的应用， 如 Ficken 等 ［16 ］的研究表明中等链长的类脂物主要来 源于水生植物， Gao 等 ［6 ］通过建立数学模型认为其 研究的湖泊沉积物中 n － C20和 n － C22脂肪酸主要来 源于水生高等植物。还有学者研究表明， 类脂物的 平均链长 ACL 与温度之间存在正相关关系 ［17 ］。 因此， 很有必要探讨不同的实验流程得到的脂肪酸 分布模式存在明显差异的原因。 图 3狗尾草和三叶草通过不同流程纯化得到的各单体脂 肪酸含量分布图 Fig． 3The individual fatty acids distribution patterns of Setaira viridisandTrifoliumrepenspurifiedbydifferent procedures 3沉积物中脂肪酸的来源及意义 沉积物中的羧酸既可以游离态存在， 也能够与长 链脂肪醇结合为酯 Ester 的形态存在， 陆生植物体 内也存在大量的以叶蜡酯和甘油酯形式的 C16和 C18 脂肪酸 ［ 1 ］， 如磷脂脂肪酸 PLFA 是构成生物细胞膜 401 第 1 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 的主要成分 ［ 18 ］。而酯类化合物在酸或碱作为催化剂 的条件下可以进行水解生成相应的脂肪酸和醇。 流程 2 纯化脂肪酸的基本原理为由于呈碱性的 氨基硅胶与脂肪酸之间的结合力较强， 一般有机试 剂很难将其洗脱， 需要用较强的酸 如乙酸、 甲酸 等 将其置换下来， 据此可将脂肪酸与其他中性类 脂物分开， 因此流程 2 获得的脂肪酸中不包含呈中 性的酯态脂肪酸。由于流程 2 对脂肪酸标准的回收 率接近 100， 因此该流程可以纯化分离出全部的 游离态脂肪酸。而流程 1 中先对样品进行酯化然后 纯化脂肪酸， 酯化过程中的强酸在加热条件下可以 促使 样 品 中 的 酯 类 化 合 物 进 行 酯 交 换 反 应 Transesterification ， 使样品中的酯态脂肪酸转化为 脂肪酸甲酯 FAME ［19 ］， 流程 1 得到的脂肪酸应该 是游离态脂肪酸和酯态脂肪酸的混合物， 从而使该 流程得到了较多的低碳数饱和脂肪酸。 应用脂肪酸作为恢复古环境代用指标， 研究者更 关心植物体内的酯态脂肪酸能否被运移到沉积物中 记录当时的环境， 以及沉积物中酯态脂肪酸的存在是 否会影响到其作为代用指标重建古环境。Huang 等 ［ 2 ］指出尽管陆生植物体内含有大量的 n － C 16脂肪 酸， 但其很难运移到湖泊中心的沉积物中， 因为 n －C16脂肪酸主要位于细胞内部， 不能像高等植物叶 子表面的叶蜡那样被风运移到湖泊沉积物中， 而且在 土壤表层 特别是在温带土壤中 n － C16脂肪酸一般 很快地被降解 ［ 2， 6， 20 ］。在沉积物中 n －C 16脂肪酸的分 解速率大约是 n －C30脂肪酸的 10 倍 ［ 21 ］， 在土壤中低 碳数脂肪酸也可能很快地被分解， 陆生植物体内的酯 态脂肪酸可能很难被保存到湖泊沉积物中。因此， 研 究海洋和湖泊沉积物中脂肪酸的来源时， 使用流程 2 提纯植物游离态脂肪酸可能更为合理。 然而， 如果沉积物中含有大量的植物残体及其 分解物， 例如在沼泽泥炭中高等植物的遗体很可能 被保存在沉积物中， 陆生植物体内的酯态脂肪酸也 会在一定程度上保存于沉积物中， 进而对脂肪酸分 布模式及同位素组成产生影响。在多尔计泥炭样品 中应用流程 2 得到的低碳数脂肪酸即属于此类酯态 脂肪酸， 而且这些酯态低碳数脂肪酸含量非常高， 例 如酯态 n － C20脂肪酸含量约为游离态的 3 倍， 这直 接影响到沉积物中单体脂肪酸的分布模式 如游离 态脂肪酸的平均链长 ACL20 －32为 26． 5， 而加上酯态 脂肪酸后平均链长为24． 7， 见表2 。在沉积物中游 离态的脂肪酸和醇可以直接结合为分子量较大的酯 类化合物， 如果沉积环境变为酸性时， 酯类化合物很 容易被水解成相应的脂肪酸和醇， 即转变为游离态 的类脂物 ［22 ］， 在沉积物中游离态脂肪酸和酯态脂肪 酸可以相互转化， 由于植物叶片中两种流程得到的 n － C16脂肪酸碳同位素组成并不一致 表 2 ， 这很 可能会影响到沉积物中游离态脂肪酸的同位素组 成。因此使用流程 1 分析样品中总脂肪酸可能更为 合适， 也可以将类脂物皂化使酯态脂肪酸释放为游 离态， 然后使用流程 2［23 ］， 甚至可以直接酯化样 品 ［19 ］来分析样品中脂肪酸的特征。 4结语 通过一系列对比试验， 本研究发现两种流程都 可以得到比较纯净的脂肪酸， 而且回收率均较高 85以上 ， 都是较为可靠的脂肪酸纯化流程。并 且应用流程 2 分离脂肪酸时， 洗脱试剂中乙酸的浓 度 2、 4、 10 和 20 不会对脂肪酸回收率造 成明显的影响， 因此使用 4的乙酸即可。 流程 2 分离纯化样品可得到几乎全部的游离态 脂肪酸， 而流程 1 可提纯样品中游离态和酯态存在 的总脂肪酸。两种流程纯化狗尾草和三叶草得到 n － C16脂肪酸的 δ13C 值有所差异， 分别为 － 21． 1‰ 和 －36． 2‰ 流程 1 ， －23． 3‰和 －34． 9‰ 流程 2 。因此， 有必要在将来的研究中对比更多的试验 流程， 以及不同纯化方法获得单体脂肪酸氢同位素 之间的差异。 研究结果显示， 由于在沉积物中游离态脂肪酸 和酯态脂肪酸可以相互转化， 因此使用流程 1 分析 样品中是总脂肪酸较为合适， 也可以将类脂物皂化 使酯态脂肪酸释放为游离态， 然后使用流程 2。而 研究海洋或湖泊沉积物中脂肪酸来源时， 使用流程 2 提纯植物中的游离态脂肪酸可能更为合理。 致谢 感谢中国科学院地球环境研究所王政助理研 究员和曹蕴宁高级工程师在实验过程中提供的 帮助。 5参考文献 ［ 1］Cranwell P． 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