胁迫浓度和胁迫时间对印度芥菜中镉形态分布的影响_杨红霞.pdf

2013 年 4 月 April 2013 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 32，No． 2 306 ～310 收稿日期 2012 －06 －06; 接受日期 2012 －08 －18 基金项目 国土资源部公益性行业科研专项 200911043 －26 ; 中国地质大调查项目 12120113015400 作者简介 杨红霞， 在读博士研究生， 副研究员， 地球化学专业。E- mail yanghongxia1 sina． com。 通讯作者 李冰， 研究员， 主要从事痕量超痕量元素分析、 元素形态分析和环境地球化学研究。E- mail libinggx163． com。 文章编号 02545357 2013 02030605 胁迫浓度和胁迫时间对印度芥菜中镉形态分布的影响 杨红霞1，刘崴1，李冰1*，魏巍2，张惠娟2 1． 国家地质实验测试中心，北京100037; 2． 南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京230026 摘要 螯合作用是植物对细胞内重金属耐受的主要方式之一， 植物中螯合肽 PCs 在植物耐重金属毒害中的 作用己有许多报道， 但作用程度并未得出一致的结论， 关于 PCs 是在镉刺激下直接合成还是以谷胱甘肽为底 物合成同样存在争议。本文研究了胁迫浓度和胁迫时间对超积累植物印度芥菜 Brassica juncea 中镉形态 分布的影响。印度芥菜幼苗分别用0． 5、 1． 0、 3． 0、 5． 0、 10． 0 mg/L 镉标准溶液胁迫24 h、 48 h、 72 h、 96 h 后收 获， 用体积排阻高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱技术测定植物体根部和叶部中镉形态的含量。结果 表明， 在低胁迫浓度下 ≤3． 0 mg/L ， 植物叶中 PCs － Cd 的含量与胁迫浓度成正比; 在高胁迫浓度下， PCs － Cd含量反而降低， 根中 PCs － Cd 的含量持续增加， 但叶中 PCs － Cd 总量高于根部， 说明 PCs 在植物体 内会由根部向叶部转移， 从而提高了镉耐受性。在持续长时间胁迫下， PCs － Cd 含量也降低， 表明 PCs 在镉 解毒机制中仅有短暂的作用; 持续高浓度胁迫下， 植物会引发其他机制来抵制 Cd 的毒性。研究认为 PCs 在 镉解毒机制中的作用需要考虑胁迫时间和胁迫浓度这两个重要参数。 关键词 印度芥菜; 镉形态; 胁迫浓度; 胁迫时间; 耐受性 中图分类号 O614． 242; O655． 6文献标识码 A 镉对植物具有一定的毒害性， 不仅能与蛋白质及 酶活性中心的巯基结合， 而且还能取代金属蛋白中的 必需元素， 导致生物结构的改变与酶活性的丧失， 从 而干扰细胞的正常代谢过程。为了减少其毒害效应， 植物在长期进化中产生了多种抵抗重金属毒害的防 御机制， 并通过调控金属的吸收、 积累、 运输和耐受过 程， 在植物体内形成复杂的耐受机制 ［ 1 －3 ］。 螯合作用是植物对细胞内重金属耐受的主要方 式之一， 谷胱甘肽、 草酸、 苹果酸和柠檬酸盐等小分 子物质， 植物螯合肽 PCs 和金属巯基蛋白都能螯 合重金属 ［4 －5 ］。PCs 是一种富含巯基的寡肽， 结构 通常为 － Glu － Cys n － Gly n 等于 2 ～ 11 ［6 ］。 PCs 在植物耐重金属毒害中的作用已有许多报道， 但用超积累植物所作的实验并未得出一致的结 论 ［7 －12 ］。通常认为， PCs 对重金属耐受的机理是重 金属离子进入植物体后， 与细胞内的 PCs 结合形成 复合物， 然后转运到特定的细胞器 主要为液泡 进 行区室化固定， 进而防止其干扰细胞的新陈代谢。 Wei 等 ［13 ］研究表明， 虽然在 Cd 胁迫下， PCs 可能参 与了 Cd 的长距离运输，PCs 和 GSH 或 cys 与 Cd 的结合也有竞争。di Toppi 等 ［14 ］指出， 植物对不同 浓度水平的镉的反应是一个非常复杂的现象， 可能 会有很多不同的机制同时起作用。然而， 也有报 道 ［15 －16 ］指出 PCs 在金属耐受机制中仅有短暂的作 用， 与超积累植物的高耐受性并不总是相关。部分 研究证实了植物络合素与 Cd、 Ni、 Zn、 Co 和 As 的超 积累无关 ［17 －18 ］。例如， Ebbs 等［19 ］研究显示， PCs 的 合成与超积累对 Cd 的超积累与耐性无关。同时， 对 Cd/Zn 共超积累植物东南景天研究发现， 超积累 东南景天对重金属的耐性和积累与 PCs 无关， 而推 测 GSH 可在体内参与重金属解毒过程 ［20 －21 ］。 关于 PCs 的合成机制同样存在争议。研究证 明， PCs 由谷胱甘肽 GSH 为底物的酶促反应合 成 ［22 ］。关于 GSH 如何生成 PCs， 研究者普遍赞同由 603 ChaoXing γ － 谷氨酰半胱氨酸二肽基转肽酶， 即植物螯合肽 合成酶催化合成的观点。Grill 等 ［23 ］通过蝇子草属 Silenecucubalis 细胞培养， 以 GSH 为底物首次合成 了 PCs。但是， 也有报道称 PCs 通常在超积累和非 超积累植物的根部由 Cd 胁迫直接产生 ［18， 24 ］。 本文针对 PCs 在植物耐重金属毒害中的作用及 PCs 的合成机制开展研究， 采用体积排阻高效液相 色谱 － 电感耦合等离子体质谱 SEC － HPLC － ICPMS 技 术 ［25 －26 ］ 分 析 超 积 累 植 物 印 度 芥 菜 Brassica Juncea 不同部位 Cd 的含量， 考察不同 Cd 胁迫浓度和胁迫时间条件下镉形态的分布规律， 初 步探讨了胁迫浓度、 胁迫时间和镉耐受性之间的关 系和 PCs 的合成机制。 1实验部分 1． 1仪器及主要试剂 Agilent 7500a 型电感耦合等离子体质谱仪 美 国 Agilent 公司 。工作参数 射频功率 1350 W; 采 样深度 5． 7 mm; Babinton 型雾化器; 载气流速 1． 10 L/min; 采样模式 时间分辨; 采样时间 2000 s; 样品 提升速率 1 mL/min。 Agilent 1100 型高效液相色谱仪 美国 Agilent 公司 。色谱柱 TSK － GEL G3000 分离柱及 TSK － GELTMPW 保护柱， 流速 0． 8 mL/min， 进样量 100 μL， 自动进样。 水 去离子水再经 Milli － Q 装置纯化 电阻率 ＞18 MΩcm 。 Cd 标准溶液 用 10 mmol/L EDTA 配制 1． 14 mg/L 的 EDTA － Cd 溶液， 对 Cd 未知峰进行定量， 使用时按需要逐级稀释。 流动相 配制 10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷 － 盐酸 Tris － HCl 缓冲液， 再加入 0． 1 mol/L NaCl， 调节 pH 7． 5， 用0． 45 μm 滤膜过滤， 氮气鼓泡赶干 净溶解氧。 1． 2植物培养 印度芥菜种子撒在珍珠岩上， 用蛭石覆盖完全。 放入周转箱内， 周转箱内放少量水至没过箱底， 外加 少量 Ca NO3 2营养液 不超5 mmol/L 。蒙上实验 用纱布， 置于培养箱中， 温度设置为 28℃。待发育 出两片子叶， 取出， 光照下培养。待长出的子叶完全 伸展开， 开始补加 1/4 营养液。待苗茁壮， 开始间苗 至周转箱。周转箱内放 1/4 营养液， 5 天后换全营 养液培养。以后每 3 天更换一次营养液。植株长成 后， 用不同浓度的 Cd 标准溶液进行刺激。 1． 3样品处理 取一定量的 Cd 标准溶液培养的鲜叶片和根系 样品， 在液氮中浸泡后， 于干净的玛瑙研钵中研磨。 加入1． 00 g 干净石英砂、 5． 00 mL 缓冲液， 将样品研 磨至浆状。磨碎后转移至 10 mL 离心管， 用 Tris － HCl 清洗研钵， 一并转移入离心管。在 4℃ 离心 10 min， 转速为 10000 r/min， 上层清液转移入干净 离心管置于冰箱 －70℃ 保存。分析前， 将样品从 冰柜中取出， 氮气保护下解冻， 0． 2 μm 滤膜过滤后 快速用 SEC － HPLC － ICPMS 分析。 2结果与讨论 2． 1镉形态的分离与检测 用文献［ 25］ 的分析检测方法， 在实际样品中检测 出4 种镉形态， 初步推断保留时间13．5 min 处为Cys － Cd， 10．2 min 为 GSH － Cd， 8． 8 min 为 PC 2 － Cd， 7． 8 min 为 PC 3－Cd， 谱图如图1 所示。为了考察 PCs 的 合成机制及其在镉耐受性的作用， 本工作重点研究了 GSH －Cd、 PC 2－Cd 和 PC3－Cd 的变化规律。 图 1镉形态分离色谱图 Fig．1Chromatogram of Cd species by SEC- HPLC- ICPMS 2． 2胁迫浓度对镉形态的影响 分别用 0． 5、 1、 3、 5、 10 μg/mL 镉标准溶液进行 刺激后， 植物体内镉形态如图 2 所示。可以看出， 根 中镉形态含量总和与刺激浓度呈正相关， 随着刺激 浓度的增大， 根部镉形态浓度明显增大。而在叶中， 刺激浓度为 3 μg/mL 时， 镉浓度达到最大值， 之后 开始下降， 至 10 μg/mL 时反而降至最低。说明 PCs 只有在低浓度镉胁迫下能够提高镉耐受性。 低浓度刺激时， 根部的 Cd 以 GSH － Cd 形态为 主; 随着刺激浓度的增加， PC 2－ Cd 和 PC3－ Cd 逐渐增加。而在叶部， Cd 的三种形态 GSH － Cd、 703 第 2 期杨红霞， 等 胁迫浓度和胁迫时间对印度芥菜中镉形态分布的影响第 32 卷 ChaoXing PC 2－ Cd、 PC3 － Cd 均能检出， 以 PC 2 － Cd 为主， 但随着刺激浓度的变化， 三种形态均先增大后 减少。说明 PCs 一部分是由 GSH 转化生成， 一部分 是在镉的胁迫下直接产生。 图 2胁迫浓度对植物体根部和叶部镉形态分布的影响 Fig． 2Effect of exposure levels on Cd species in root and leaf 图 3胁迫时间对植物体根部和叶部镉形态分布的影响 Fig． 3Effect of exposure time on Cd species in root and leaf 2． 3胁迫时间对镉形态的影响 用相同浓度的镉溶液分别对植物连续刺激 24、 48、 72、 96 h， 植物体内的镉形态分布如图 3 所示。 可以看出， 随着刺激时间的增加， 根中 GSH － Cd 浓 803 第 2 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 度先迅速增加， 72 h 达到最高值， 而后逐渐降低， 96 h降至最低。 PC 2 － Cd、 PC 3 － Cd 也是先迅 速增加， 而后缓慢降低， 96 h 降至最低。在叶片中， GSH － Cd、 PC 2 － Cd、 PC 3 － Cd 浓度先迅速增 加， 48 h 达到最高值， 而后逐渐降低， 96 h 降至 最低。 随着 刺 激 时 间 的 延 长， 叶 片 中 GSH － Cd、 PC 2－ Cd、 PC3－ Cd 三种形态均能检出， 但始终 以 PC 2 － Cd 形态为主。根部也能检测出三种形 态， 刺激48 h、 72 h时以 GSH － Cd 为主， 但96 h 时以 PC 2－ Cd、 PC3－ Cd 为主。同时， 叶片中 PCs － Cd 要高于根部。 而刺激时间对 Cd 总量在植物不同部位的分布 影响规律为 随着刺激时间增加， Cd 含量持续增加， 且根部远远大于叶片。PCs 浓度的降低表明在植物 耐镉机制中 PCs 起部分作用， 受高浓度 Cd 胁迫时， 其他机制可能会被激发。 3结语 本工作利用已建立的 SEC － HPLC － ICPMS 分 析方法测定超积累植物印度芥菜叶片和根中的镉形 态， 并研究了胁迫浓度和胁迫时间对镉形态分布的 影响。研究表明， 植物体内镉的形态及含量与胁迫 浓度和胁迫时间密切相关， 且形态之间会相互转化， 说明 PCs 在镉解毒机制中仅有短暂的作用; 持续高 浓度胁迫下， 植物会引发其他机制来抵抗镉的毒性。 也证实了 PCs 一部分是由 GSH 转化生成， 一部分是 在镉的胁迫下直接产生。因此认为， 研究植物螯合 肽在镉解毒机制中的作用需要考虑胁迫浓度和胁迫 时间这两个重要参数。 4参考文献 ［ 1］Clemens S，Palmgren M G，Kramer U． A long way aheadUnderstandingandengineeringplantmetal accumulation［ J］ ． Trends in Plant Science， 2002， 7 7 309 －315． ［ 2］Clemens S．Toxic metal accumulation，responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants ［J］ ． Biochimie， 2006， 88 11 1707 －1719． ［3］Hall J L．Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance［ J］ ． Journal of Experimental Botany， 2002， 53 366 1 －11． ［ 4］Yang X E，Feng Y，He Z L，Stoffella P J． Molecular mechanismsofheavymetalhyperaccumulationand phytoremediation ［J］ ． Journal of Trace Elements in Medicine and Biology， 2005， 18 4 339 －353． ［ 5］Belcastro M，Marino T，Russo N，Toscano M． The role ofglutathioneincadmiumiondetoxification Coordination modes and binding propertiesA density functional study［J］ ． Journal of Inorganic Biochemistry， 2009， 103 1 50 57． ［ 6］Kpper H，Lombi E，Zhao F J，McGrath S P． Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to otherelementsinthehyperaccumulatorArabidopsis halleri［ J］ ． Planta， 2000， 212 1 75 －84． ［ 7］Salt D E，Prince R C，Pickering I J． Chemical speci- ation of accumulated metals in plantsEvidence from X- ray absorption spectroscopy［ J］ ． Microchemical Journal， 2002， 71 2 －3 255 －259． ［ 8］Sarret G，Saumitou- Laprade P，Bert V，Proux O， Hazemann J L，Traverse A，Marcus M A，Manceau A． s of Zinc accumulated in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri［ J］ ． Plant Physiology， 2002， 130 4 1815 －1826． ［ 9］Sarret G， Willems G， Isaure M P， Marcus M A， Fakra S C，Frrot H， Pairis S， Geoffroy N， Manleau A， Saumitou- Laprade P． Zinc distribution and speciation in Arabidopsis halleri x Arabidopsis lyrata progenies present- ing various zinc accumulation capacities ［J］ ． New Phytologist， 2009， 184 3 581 －595． ［ 10］ Callahan D L， Baker A J， Kolev S P， Wedd A G． Metal ion ligands in hyperaccumulating plants ［ J］ ． Journal of Biological Inorganic Chemistry， 2006， 11 1 2 －12． ［ 11］Haydon M J，Cobbett C S． Transporters of ligands for essential metal ions in plants ［J］ ． New Phytologist， 2007， 174 3 499 －506． ［ 12］Rauser W E． The role of thiols in plants under metal stress［M］∥ Brunold C， eds．Sulphur Nutrition and Sulphur Assimilation in Higher Plants．Switzerland Paul Haupt Bern， 2000 169 －183． ［ 13］ Wei Z G，Wong J W，Zhao H Y，Zhang H J，Li H X， Hu F．Separation and determination of heavy metals associated with low molecular weight chelators in xylem saps of Indian mustard Brassica juncea by size exclusionchromatographandatomicabsorption spectrometry ［J］ ． Biological Trace Element Research， 2007， 118 2 146 －158． ［ 14］di Toppi L S，Gabrielli R． Response to cadmium in higher plants ［J］ ． Environmental andExperimental Botany， 1999， 41 2 105 －130． ［ 15］LeopoldI， SchmideJ， NeumanD， GntherD． Phytoche- latinsandheavymetaltolerance ［J］ ． Phytochemistry， 1999， 50 8 1323 －1328． ［ 16］PiechalackA， TomaszewskaB， BaralkiewiczD， Malecka A． Accumulation and detoxification of lead ions in legumes［J］ ． Phytochemistry，2002，60 2 153 － 162． 903 第 2 期杨红霞， 等 胁迫浓度和胁迫时间对印度芥菜中镉形态分布的影响第 32 卷 ChaoXing ［ 17］ Zhao F J，Wang J R，Barker J H A，Schat H，Bleeker P M， McGrath S P． The role of phytochelatins in arsenic tolerance in the hyperaccumulator Pteris vittata［ J］ ． New Phytologist， 2003， 159 2 403 －410． ［ 18］ Verbruggen N，Hermans C，Schat H． Molecular mechan- isms of metal hyperaccumulation in plants ［J］ ． New Phytologist， 2009， 181 4 759 －776． ［ 19］Ebbs S，Lau I，Ahner B，Kochian L． Phytochelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescenes J． and C． Presl ［ J］ ． Planta， 2002， 214 4 635 －640． ［ 20］ Sun Q，Ye Z H，Wang X R，Wong M H． Increase of glutathione in mine population of Sedum alfredii A Zn hyperaccumulatorandPbaccumulator［ J ］ ． Phytochemistry， 2005， 66 20 2549 －2556． ［ 21］Sun Q，Ye Z H，Wang X R，Wong M H． Cadmium hyperaccumulation leads to an increase of glutathione rather thanphytochelatinsinthecadmiumhyper- accumulator Sedum alfredii ［J］ ． Journal of Plant Physiology， 2007， 164 11 1489 －1498． ［ 22］Cobbett C S． A family of phytochelatin synthase genes from plant fungal and animal species［ J］ ． Trends in Plant Science， 1999， 4 9 335 －337． ［ 23］Grill E，Winnacker E L，Zenk M H． Phytochelatins The principal heavy- metal complexing peptides of higher plants［ J］ ． Science， 1985， 230 4726 674 －676． ［ 24］Schat H，Llugany M，Vooijs R，Hartley- Whitaker J， Bleeker P M． The role of phytochelatins in constitutive and adaptive heavy metal tolerances in hyperaccumulator and non- hyperaccumulator metallophytes［ J］ ． Journal of Experimental Botany， 2002， 53 379 2381 －2392． ［ 25］ Yang H X， Liu W， Li B， Wei W， Zhang H J， Chen D Y． Speciation analysis ofCadmiuminIndianmustard Brassica Junceaby size exclusion chromatography- highperanceliquidchromatography- inductively coupled plasma mass spectrometry SEC- HPLC- ICP- MS［J］ ． Chinese Journal of Analytical Chemistry， 2009， 37 10 1511 －1514． ［ 26］ 杨红霞， 刘崴， 李冰， 魏巍， 张惠娟， 陈登云． 体积排阻 高效液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法同时测定 印度芥菜 Brassica Juncea 中镉铜锌形态［J］ ． 岩矿 测试， 2010， 29 1 9 －13． Effect of Exposure Levels and Exposure Time on Distribution of Cadmium Species in Indian Mustard Brassica Juncea YANG Hong- xia1，LIU Wei1，LI Bing1*，WEI Wei2，ZHANG Hui- juan2 1． National Research Center for Geoanalysis，Beijing100037，China; 2． College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing Agriculture University，Nanjing230026，China Abstract Chelation is one of the main ways to tolerate the heavy metals in the cells of plants． Phytochelatin PCs was reported to have detoxification and compartmentalization of heavy metals，but no accordant conclusion for its contribution． Whether the PCs were directly synthetized under the stimulation of Cd or synthetized by glutathione is still an unsolved issue． In this paper，a study is described examining the relationship between exposure levels， exposure time and Cd tolerance． Root and leaf samples were placed in 0． 5，1． 0，3． 0，5． 0 and 10． 0 mg/L Cd standard solutions and harvested after 24，48，72，96 hours． The Cd species in the root and leaf samples were measured by using Size- Exclusion High- Perance Liquid Chromatography and Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry． Results indicated that PCs- Cd contents were positively correlated with Cd exposure levels when the lower Cd exposure levels were less than 3． 0 mg/L． Under the higher exposure levels，the contents of PCs- Cd were reduced，the PCs- Cd contents in root samples were continually increasing，but lower than those found in the leaf samples，which indicated that the PCs were transported from root to leaf with a higher tolerance of Cd． Increasing exposure time also reduced PCs- Cd production which indicated PCs may only have a temporary role in metal resistance． Under continuous higher exposure，plants may trigger other mechanisms that tolerate heavy metal toxicity． Our results suggest that concentration and time of exposure are important factors that must be taken into consideration when uating the true role of PCs in heavy metal detoxification． Key words Indian mustard; cadmium species; exposure levels; exposure time; tolerance 013 第 2 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing