PVA固定化Corynebacterium sp.JY03降解苯酚的特性研究.pdf

PVA 固定化 Corynebacterium sp． JY03 降解苯酚的特性研究 * 姜立春阮期平王晓丽 绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室， 四川 绵阳 621000 摘要 以 PVA 聚乙烯醇 作为载体将降酚菌株 Corynebacterium sp． JY03 进行固定化包埋处理， 正交试验确定该菌株固 定化细胞制备的条件， 然后对固定化细胞的降酚性能进行研究。试验确定最佳固定条件为 PVA 质量分数为 6， 菌 液量/PVA 水溶液体积比为 6/30， 氯化钙含量为 2. 0， 钙化交联时间为 8 h; 固定化细胞降解苯酚的最适温度为 30 ～ 35 ℃， 最适 pH 值为 6. 5 ～7. 5， 在初始苯酚浓度为 700 mg/L， 装液量 50 mL， 培养42 h 后， 苯酚降解率达 99. 1。固定 化细胞重复利用 6 次苯酚降解率仍高于 85. 2， 其性能优于游离细胞， 这将为该菌株进一步应用于含酚废水的生物 处理提供实践条件。 关键词 Corynebacterium sp． JY03; 苯酚; PVA; 固定化细胞; 降酚性能 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201402009 STUDY ON THE OPTIMAL IMMOBILIZATION CONDITIONS OF PHENOL DEGＲADING BACTEＲIA JY03 AND ITS DEGＲADATION PEＲFOＲMANCE Jiang LichunＲuan QipingWang Xiaoli Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutics，Mianyang Normal University，Mianyang 621000， China AbstractOne strain of phenol- degrading Corynebacterium sp． JY03 was immobilized in polyvinyl alcohol PVA ． Optimal preparation conditions of the strain immobilization were carried out by the determined orthogonal experiments and its degradation perances were studied． The optimal immobilization conditions were found as belowPVA 6 mass fraction ，bacteria embeded ratio 1. 0∶5. 0 accounted by the volume ratio of bacteria solution and carrier mixture ， calcium chloride 2. 0，and curing time 8 h． The optimal temperature of degrading phenol was 30 ～35 ℃，the optimal pH value was 6. 5 ～7. 5，initial phenol concentration was 700 mg/L，the liquid volume was 50 mL． After 42 h of incubation，phenol degradation rate was up to 99. 1． The degradation efficiency of immobilized cells was apparently superior to that of free cells． Phenol degradation rate was still up to 85. 2 after immobilized cells were recycled for 6 times． These will provide a practical conditions for the strains further used in the biological treatment of phenolic wastewater． KeywordsCorynebacterium sp． JY03; phenol; polyvinyl alcohol; immobilized microorganism; phenol- degrading perance * 四川省教育厅项目 12ZB258，092B142 ; 绵 阳 师范 学 院 项 目 MA2009016，Mnu- JY1124 。 收稿日期 2013 －04 －23 0引言 苯酚是一种常见的工业污染物， 广泛来源于石油 化工、 橡胶、 炼油、 制革、 绝缘材料厂、 造纸和合成纤维 等各种行业。含酚废水如果不经处理而任意排放， 会 对环境造成严重的危害［1 ］。与其他处理方法相比， 采用生物法处理含酚废水具有较好的效果， 但由于目 前广泛使用的活性污泥法存在着微生物浓度低、 菌体 易流失、 产生大量的污泥易造成二次污染等缺点， 一 些研究者将固定化技术用于废水生物处理过程中， 取 得较好效果 ［2- 3 ］。固定化微生物技术与其他生物修复 技术相比， 具有保持生物高浓度， 反应启动快， 处理效 率高， 操作稳定， 耐毒物冲击， 污泥排放量少， 固液分 离简单等优点 ［4- 5 ］。包埋法固定化技术关键是要选择 合适包埋剂， 主要有聚乙烯醇 PVA 、 明胶、 海藻酸 钠、 琼脂、 聚丙烯酰胺及几丁质等［6 ］。研究表明聚丙 63 环境工程 Environmental Engineering 烯酰胺凝胶对生物有毒性， 琼脂强度较差， 明胶内部 结果密实， 但传质性能差， 相比较海藻酸钠和聚乙烯 醇凝胶机械强度和传质性能均较好， 而且对生物无 毒， 且耐生物分解性能良好， 是比较合适的固定化细 胞载体 ［7- 8 ］。 聚乙烯醇是一种新型的微生物固定化载体具有 良好的亲水性及反应性［9- 10 ］， 经过化学交联或硬化改 性处理后， 其化学稳定性及机械强度会显著提高， 抗 微生物分解性能增强并且对微生物无毒， 价格低廉， 是一种具有较大潜力的细胞固定化材料， 近年来在国 内外获得了较广泛的应用［11- 12 ］。本研究以 PVA 作为 包埋剂， 以海藻酸钠和活性炭作为辅助材料， 通过正 交试验选择固定化微生物的最适包埋条件， 并对固定 化微生物的发酵特性进行研究， 为进一步采用固定化 技术处理含酚废水的应用提供依据。 1试验部分 1. 1材料 1. 1. 1菌株 Corynebacterium sp． JY03 由绝缘材料厂污水处 理池筛选、 驯化得到。 1. 1. 2培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 蛋白胨 10 g、 牛肉膏 3 g、 NaCl 5 g、 加蒸馏水定溶至 1L， 固体加 20琼脂。 无机盐培养基［13 ］ K2HPO40. 5 g、 KH2PO40. 5 g、 NaCl 0. 2 g、 NH4NO31. 0 g、 MgSO40. 2 g、 CaCl20. 2 g、 FeSO4 7H2O 0. 01 g、 微量 MnSO4 H2O、 苯酚 根据需 要加入 ， 加蒸馏水定溶至 1 L。 1. 2方法 1. 2. 1Corynebacterium sp． JY03 固定化细胞制备 向烧杯中加入聚乙烯醇和 0. 3 g 海藻酸钠， 加少 量活性炭 以 0. 5 ～1. 0为宜 ， 搅拌均匀， 加无菌 水 50 mL， 在 100 ℃左右的水浴锅中加热、 搅拌， 呈均 一状态的聚乙烯醇溶液后， 放置冷却; 在另一个烧杯 中加入 10 g 硼酸， 加少许无水碳酸钠， 加热搅拌使其 充分溶解。冷却后， 调节硼酸溶液 pH 接近 6. 5， 然后 向其中加入试验所需量的 CaCl2， 搅拌均匀， 备用。 将斜面菌种 JY03 接入 50 mL 液体培养基， 在 30 ℃、 150 r/ min 条件下培养 16 h， 5 000 r/min 离心 15 min， 用生理盐水洗涤 2 次， 重悬得到 8 mL 浓缩菌 液。取一定量的菌浓缩液与 PVA 溶液于常温下混 合， 混匀后用注射针管滴入经过灭菌的交联剂饱和硼 酸溶液中， 钙化交联， 得到直径3 ～5 mm 的 PVA 凝胶 小球， 用生理盐水洗涤后， 4 ℃保存。 1. 2. 2固定化条件选择 为确定 PVA 作为载体材料最适的包埋条件， 以 小球粒径 3 ～ 5 mm 作为包埋固定的前提条件， 以包 埋浓缩菌液量 A 、 氯化钙 CaCl2 的浓度 B 、 PVA 浓度 C 以及固定时间 h D 为影响因素， 设计了 4 个因素 3 个水平的正交试验 L9 43 ， 以苯酚降解率 为指标进行试验 表 1 。 表 1正交试验因素及水平 Table 1Factors and levels of the orthogonal experiments 水平 浓缩菌/包埋剂 A CaCl2质量分数/ B PVA 质量分数/ C 钙化时间/h D 12/30164 24/301. 588 36/3021012 1. 2. 3固定化菌株 JY03 降解苯酚特性 采用由表 1 正交试验得到的最佳包埋条件固定 化 JY03 菌株， 用于降解苯酚的最适条件的探究。以 不同初始苯酚浓度、 降解时间、 pH 值、 温度、 接种量等 因素来探究固定化 JY03 菌降解苯酚性能。 1. 2. 4分析方法 菌种浓度采用比浊法测定， 使用分光光度计在波 长 600 nm 处的吸光度来表示; 苯酚浓度采用 4- 氨基 安替吡啉直接分光光度法来测定培养液中苯酚含量， 并计算出苯酚降解率［13 ］。 2结果与讨论 2. 1固定化条件确定 在固定化细胞制备过程中， PVA 浓度、 浓缩菌包 埋量、 CaCl2浓度及钙化时间对固定化细胞起主要影 响因素。在不同条件下 表 1 ， 以苯酚降解率为指标 分析固定化条件， 结果见表 2。由 Ｒ 值可知 各因素 对试验结果的影响依次为 A ＞ B ＞ D ＞ C; 同样从表 3 的方差分析可看出 因素 A 的主效应很显著， 即浓缩 菌量对固定化小球的降解效率有较大影响 P 0. 023， P ＜ 0. 05 ， 其次是氯化钙浓度 P 0. 141， P ＞0. 05 ， 最后为钙化时间 P 0. 371， P ＞ 0. 05 。 综合各种因素得出 采用 PVA 包埋 JY03 菌制备固定 化细胞的适宜条件是 A3B3C1D2， 即 菌液量/PVA 水 溶液为 6/30、 氯化钙含量为 2. 0、 PVA 含量为 6、 钙化时间为 8 h 表 3 。 2. 2苯酚降解特性研究 2. 2. 1初始苯酚浓度对降酚性能的影响 将固定化 JY03 包埋小球 30 g 接种于 100 mL 初 73 水污染防治 Water Pollution Control 表 2正交试验结果 Tabel 2The results of orthogonal test 方案 因素 ABCD 降解率/ 1111150. 08 2323176. 31 3331281. 86 4213268. 72 5232172. 68 6221368. 67 7133365. 45 8312377. 87 9122256. 31 k1 57. 28065. 55766. 87066. 357 k270. 02367. 09768. 95368. 963 k379. 08573. 33070. 16070. 663 Ｒ21. 8057. 7733. 2904. 306 表 3方差分析 Table 3Variance analysis 因素离差平方和自由度均方F 值显著性 A695. 292347. 64541. 8330. 023 B101. 651250. 8256. 1160. 141 C16. 62028. 310 D28. 232214. 1161. 6990. 371 始苯酚浓度不同的无机盐培养基中 pH 7. 0 ， 于 180 r/min、 30 ℃下震荡培养 32 h 试验结果如图 1 所 示。结果表明 当苯酚质量浓度为 500 ～ 800 mg/L 时， 菌株降解能力较好， 其降解率均高于 82. 3; 在 浓度为 700 mg/L 时， 其降解率最高， 为 95. 1。随 着浓度的升高， 苯酚降解效率降低， 当浓度高于 1 600 mg/L时， 苯酚降解率最低， 为28. 7， 这可能由 于高浓度苯酚对细胞的毒害作用， 抑制了其生长从而 影响了对苯酚的降解。因此， 固定化降酚菌的最适初 始苯酚浓度为 700 mg/L。 图 1初始苯酚浓度对苯酚降解性能的影响 Fig． 1The influence of initial phenol concentration on the phenol degradation perance 2. 2. 2时间对苯酚降解的影响 将固定化 JY03 包埋小球 30 g 接种于 100 mL 无 机盐培养基中 苯酚质量浓度为 700 mg/L， pH 7. 0 ， 在 180 r/min、 30 ℃ 下震荡培养 48 h， 每隔 6 h 测苯酚浓度， 试验结果如图 2 所示。结果表明 苯酚 浓度随培养时间的延长而降低， 其降解率逐渐升高; 在 42 h 时， 培养液中苯酚浓度仅为 51. 8 mg/L， 其降 解率达 92. 6， 此后随着培养时间的延长， 其苯酚降 解率变化不大。因此， 选择 42 h 为最适培养时间。 图 2时间对苯酚降解性能的影响 Fig． 2The influence of time on the phenol degradation perance 2. 2. 3pH 对降酚性能的影响 将固定化 JY03 包埋小球 30 g 接种于 100 mL 无 机盐培养基中 苯酚质量浓度为 700 mg/L ， 在初始 pH 值不同的条件下， 在 180 r/min、 30℃ 下震荡培养 42 h， 试验结果如图 3 所示。结果表明 在 pH 为 6. 0 ～8. 5 时， 菌株降解苯酚的效果比较好， 说明通过 固定化菌株能够在较宽的酸碱范围内对苯酚有较好 的降解。当 pH 7. 5 时， 降解效果最好， 其降解率达 93. 7。而 pH ＜ 5. 5 或 ＞ 8. 5 时菌株降解苯酚的能 力下降较快。这可能是由于 pH 改变， 引起微生物表 面电荷改变， 进而影响微生物对污染物的吸收。因 此， 固定化降酚菌的最适 pH 为 7. 0 ～8. 0。 2. 2. 4温度对降酚性能的影响 将固定化 JY03 包埋小球 30 g 接种于 100 mL 无 机盐培养基中 苯酚浓度为 700 mg/L， pH 7. 5 ， 在 培养温度不同的条件下， 在 180 r/min、 pH 7. 5 震荡 培养 42 h， 试验结果如图 4 所示。结果表明 温度过 低或过高对苯酚的降解都有较大影响， 在 28 ～40 ℃， 菌株降解苯酚效果较好， 在32 ℃时降解率达到最高， 为 93. 9。 83 环境工程 Environmental Engineering 图 3 pH 对苯酚降解性能的影响 Fig． 3The influence of pH on the phenol degradation perance 图 4温度对苯酚降解性能的影响 Fig． 4The influence of temperature on the phenol degradation perance 2. 2. 5固定化细胞量对降酚性能的影响 将固定化 JY03 包埋小球按不同接种量接种于 100 mL 无机盐培养基中 苯酚浓度 700 mg/L ， 于 180 r/min、 pH 7. 5、 32 ℃下震荡培养42 h， 试验结果 如图 5 所示。结果表明 随着接种量的增多， 其降解 率逐渐增高， 在接种小球质量为 40 g 时， 其降解率最 高为 92. 6， 当接入量为 15 ～35 g 时， 随接入量的增 加， 降解率急剧上升， 但固定化小球的接入量高于 40 g时降解率上升幅度不大， 其降解率趋于平稳。因 此， 选择 40 g 为最适接种量。 2. 2. 6降解次数对降解苯酚性能的影响 将游离菌体和固定化包埋细菌分别接入苯酚液 体培养基中， 在恒温摇床振荡培养 40 h， 游离菌体 5 000 r/min， 离心 10 min， 用生理盐水洗涤游离菌体 和固定化小球， 在相同条件下培养后测定苯酚降解 率， 反复循环 6 次， 结果见图 6。固定化细菌的重复 利用性能远远高于游离菌体， 随着降解次数的增加， 游离菌体降酚能力急剧下降， 而固定化细菌的重复利 用降酚效率较好， 第 6 次效果与第 1 次相比， 苯酚降 图 5接种量对苯酚降解性能的影响 Fig．5The influence of inoculation amount on the phenol degradation perance 解率仅降低了 14. 3， 为 85. 2。在循环降解过程 中， 固定化小球外观没有显著变化， 表明固定化细胞 可重复利用的优点， 具有实际应用的潜力。 图 6重复利用性能 Fig． 6Ｒepeat ability of immobilized cells and free cells 2. 3固定化与游离态菌的降酚性能比较 将游离菌体和固定化细胞分别接种于不同浓度 苯酚培养基中 pH 7. 5， 32 ℃， 150 r/min 培养 42 h， 结 果 见 图 7。固 定 化 细 菌 在 苯 酚 浓 度 为 1 200 mg/L的培养基中仍能保持 63. 3 的苯酚降解 率， 而游离细菌在此浓度下降酚能力已经受到严重抑 制， 其苯酚降解率较低， 仅为 48. 1。表明 与游离 细胞相比， 固定化后降酚效率及耐受能力均明显增 强， 这可能是由于在固定化系统中， 苯酚需扩散进入 固定化载体内部， 才能被包埋在载体内的微生物细胞 降解 ［7 ］; 且扩散作用使苯酚浓度从载体外部到内部 由高到低， 形成浓度梯度， 减轻了苯酚对载体内降酚 菌的毒性 ［15 ］; 而处于载体内的微生物有较强的生物 活性， 新陈代谢旺盛， 这就加强了其对苯酚的降解能 力 ［16 ］。同时由图 7 可看出 随着苯酚浓度的增加， 游 93 水污染防治 Water Pollution Control 离细菌降解率比固定化细胞降低的速度要快， 这可能 是因为载体对其内部的微生物起到保护作用， 使细菌 处在相对简单的生存环境中， 而载体中的孔隙为微生 物所需的营养物质的传递提供了条件， 这样使得微生 物更快的降解苯酚等有毒物质［17 ］。 图 7苯酚耐受能力比较 Fig．7Comparison of the phenol degrading concentration of immobilized cells and free cells 3结论 通过以苯酚降解率为指标的正交化试验确定 Corynebacterium sp． JY03 的最优固定化方案 PVA 含 量为6， 包埋浓缩菌量/PVA 水溶液为16 mL/30 mL， 氯化钙含量为 2. 0， 钙化时间为 8 h。该方案固定 化操作简单、 交联速度快、 聚合放热温度低、 对细胞的 毒性和损害小、 抗水解能力强、 且得到的凝胶细胞具 有机械强度好、 有弹性、 可多次重复利用等优点。 Corynebacterium sp． JY03 固定化后， 在试验过程中， 有较高的降酚和耐酚能力， 且对初始苯酚浓度、 pH 值、 温度等因素干扰能力均有明显增强。另外， 固定 化微生物重复使用 6 次， 对底物降解率保持在 85. 2以上， 效果稳定。表明该固定化菌株在处理含 酚废水方面具有广阔应用价值。 参考文献 ［1］孙艳，李京，谭立扬． 一种耐酚菌种及其固定化细胞降解含酚 废水性能的比较研究［ J］ ． 环境科学研究， 1999， 12 1 1- 4． ［2］Pai S L，Hsu Y L，Chong N M，et al． Continuous degradation of phenol by Ｒ． hodoccus sp．immobilized on granular activeated carbon and in caccium alginate［J］． Bioresource Technol，1995， 51 37- 42． ［3］Anselmo A M． Degradation of phenol by immobilized mycelium of Fusarium in continuous culture［J］． Wat Sci Tech， 1992， 25 1 161- 168． ［4］周定，王建龙，侯文华，等． 固定化细胞在废水处理中的应用 及前景［J］． 环境科学， 1993， 14 5 51- 55． ［5］李启彬． 生物反应器填埋场稳定技术［J］． 城市环境与城市生 态， 2003， 16 4 7- 9． ［6］李峰，吕锡武，严伟． 聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究 ［J］． 中国给水排水， 2000， 16 12 14- 17． ［7］蒋宇红，黄霞，俞毓馨． 几种固定化细胞载体的比较［J］． 环 境科学， 2001， 14 2 11- 15． ［8］熊振湖，孙翠珍，刘青春． 不同载体固定化藻菌共生系统的脱 氮除磷效果［J］． 环境科学与技术， 2005， 28 1 82- 84． ［9］刘江红，潘洋，徐瑞丹． 微生物固定法降解含聚废水的最佳条 件［J］． 湖南大学学报， 2012， 39 3 62- 65． ［ 10］陈朝琼，廖银章，李旭东． 固定化高效 PVA 降解菌处理 PVA 废水的研究［J］． 水处理技术， 2011， 37 2 77- 80． ［ 11］蔡昌风，孙菲． 新型固定化生物小球的研制及其处理模拟焦 化废水的脱氮特性［J］． 水处理技术， 2010， 36 7 74- 78． ［ 12］熊丽，陈红，谢浩． 聚乙烯醇对生物酶的固定化研究进展［J］． 材料报道， 2010， 24 6 77- 80． ［ 13］袁利娟，姜立春，彭正松，等． 高效降酚菌 Bacillus sp． JY01 的固定化及降解特性研究［J］． 环境科学与技术，2010， 33 4 49- 52． ［ 14］水和废水监测分析方法编委会． 水和废水监测分析方法［M］． 北京中国环境科学出版社， 1997 408- 410． ［ 15］方芳，姜和，曾虹燕，等． 固定化高效复合菌群 JHD 降解苯酚 特性及其动力学研究［J］． 水处理技术， 2011， 37 12 51- 53． ［ 16］Shreve G S， Vogel T M． Comparison of substrate utilization and growth kinetics between immobilized and suspended Pseudomonas cells ［ J］ ． Biotechnology ＆ Bioengineering， 1993， 41 3 370- 379． ［ 17］刘姗姗，刘永军，黎兵． 固定化活细胞苯酚生物降解特性研究 ［J］． 水处理技术， 2012， 38 9 30- 33． 第一作者 姜立春 1977 － ， 男， 硕士， 讲师， 主要从事应用微生物学与 分子生物学研究。 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 jiang_lichen126． com 上接第 35 页 ［5］宁桂兴， 王凯， 吴迪， 等． AS- S/MBＲ 工艺处理垃圾渗滤液试验 研究［J］． 环境工程学报， 2010， 4 10 2263- 2266． ［6］宋灿辉， 肖波， 胡智泉， 等． UUASB/SBＲ/MBＲ 工艺处理生活垃 圾焚烧厂渗滤液［ J］ ． 中国给水排水， 2009， 25 2 62- 64． ［7］程昶． 膜生物反应器 － 纳滤工艺在垃圾渗滤液处理中的应用 ［J］． 工业用水与废水， 2009， 40 5 85- 87． 第一作者 陈威 1974 － ， 男， 副教授， 博士， 主要从事水处理新工艺研 究。495842678 qq． com 04 环境工程 Environmental Engineering