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第 48 卷 第 4 期 煤田地质与勘探 Vol. 48 No.4 2020 年 8 月 COAL GEOLOGY 2. School of Chemical Engineering and Technology, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221006, China; 3. Key Laboratory of Coal Processing and Efficient Utilization, Ministry of Education, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China Abstract The interaction process between microorganism and coal is complicated. In order to deeply analyze the function and change rule of organic matter in coal in the process of biological gas production, taking Yima lignite and methanogens preserved in laboratory as research objects, the gas production characteristics of water-soluble organic matter of lignite and its chemical composition change before and after gas production were studied. The water-soluble organic components of Yima lignite obtained by deionized water extraction at 70℃ and the extraction residue were used as substrates for biogas production. High perance liquid chromatography-mass spectrometry HPLC-MS, gas chromatographyGC and gas chromatography-mass spectrometryGC-MS were used to analyze the change of ChaoXing 第 4 期 任恒星等 褐煤高温水萃物生物产气及化学组成变化 133 gas production and the chemical composition of fermentation broth and coal methanol extract. The results showed that the gas production of raw coal, water-soluble organic matter and extraction residue were 0.46, 0.45 and 0.15 mmol/g coal respectively. At the beginning of gas production, the chemical composition of water-soluble organic compounds of which the molecular weight was mainly concentrated in 200-300 Da was complex. After biogas production, the species of compounds decreased, and the molecular weight decreased to 150-200 Da. Some oxygen-containing and nitrogen-containing compounds with phenyl rings were detected in the fermentation broth. GC-MS analysis showed that a small number of water-soluble compoundse.g., amide, acetamide and dimethyl sulfite appeared in the methanol extract of extraction residue after biogas production. The conclusion was that the water-soluble organic matter of lignite extracted at 70 can be utilized by methanogens for biogasification and some℃ water-insoluble or- ganic compounds were converted into water-soluble organic compounds in the process of biodegradation. This study explored the potential role of water-soluble organic compounds in the biogasification process of lignite. Keywords lignite; extraction; water-soluble organic compounds; biogas production; high temperature; Yima of Henan 生物成因煤层气是煤中有机物在微生物作用下 被降解产生有机酸、芳香烃等，然后进一步被转化 为乙酸和二氧化碳等小分子化合物并最终经产甲烷 菌合成甲烷的过程[1-5]。当前，利用微生物厌氧降解煤 中有机物产甲烷是煤层气增产领域的研究热点[6-8]。 煤 是一种含有大量芳环化合物的混合物，有机组成较 为复杂，其组分的复杂性给生物产气机理研究带来 很大困难。到目前为止，煤中具体哪种有机组分能 被微生物利用产气还不清楚。赵同谦等[9]运用紫外 和荧光光谱研究煤生物产气过程中可溶性有机物的 变化特征，认为芳香族物质参与了生物产气过程； 邵培[10]研究了中低阶煤有机地球化学特征对生物气 生成的影响，认为黄铁矿和黏土矿物对生物气产生 速率影响显著；陶明信等[11]研究淮南煤田煤中可溶 有机质的生物降解特征，认为煤中的可溶有机质是 生物成因甲烷产生的优先底物。也有学者通过溶剂萃 取的方法分析煤生物产气的底物组成。葛晓光等[12]通 过甲醇萃取研究煤有机成分与煤层水中硫酸盐还原 菌Sulfate Reducing Bacteira, SRB的代谢关系，认 为 SRB 可厌氧降解利用甲醇萃取煤中大分子有机 物；A. Furmann 等[13]用水、甲醇和二氯甲烷对烟煤 进行萃取，利用萃取物进行生物产气研究，发现高 镜质组煤的萃取物产气量高于低镜质组煤，可能是 由于镜质组中含 N、O、S 等官能团的有机物较多， 为生物降解提供了化学位点。煤中除了存在大量的 非水溶性有机物，还含有少量易溶于水的极性有机 物，在生物与煤相互作用过程中，水溶性有机物能 够快速均匀地分布于煤基质中，理论上优先被微生 物利用。但是，煤中水溶性有机物极性大，不利于 GC-MS 定性定量分析[14]。 W. H. Orem 等[15-16]利用有 机溶剂萃取结合气相色谱-质谱联用GC-MS分析， 从煤层水和煤生物产气发酵液中检测到了酚和长链 脂肪酸等多种有机物。A. Vieth 等[17]利用离子色谱 法从不同煤的水萃物中检测到了低分子量有机酸， 并认为这些物质是煤层微生物的潜在底物。尽管国 内外研究人员对煤中生物产气的有机组分开展了相 关工作，但整体上而言，其具体组成还有待进一步 研究。近年来，高效液相色谱-质谱联用HPLC-MS 技术已较为成熟，其综合了高效液相色谱的化合物 分离和电喷雾离子源四级杆飞行时间质谱的灵敏检 测，为分析极性至弱极性的热不稳定化合物提供了 方法[18]。 笔者以实验室保存的产甲烷菌群为产气微生 物，义马褐煤为产气底物，利用去离子水萃取结合 减压蒸馏浓缩的方法提取褐煤中水溶性有机组分， 并开展生物产气实验，综合利用 HPLC-MS 和 GC-MS 方法研究生物产气前后煤中水溶性有机质 的变化规律及其对产甲烷的贡献，以期为后续分析 生物产气的物质基础提供参考。 1 材料与方法 1.1 褐煤样品与产甲烷菌群 褐煤样品采自河南义马千秋矿，去除表面氧化 层后粉碎至 120 目125 μm以下，70℃烘干后保存 在充氮样品袋中备用，记为 YM。褐煤工业分析和 元素分析结果见表 1。 表 1 义马褐煤工业分析和元素分析 Table 1 Proximate and ultimate analysis of Yima lignite 工业分析 ω/ 元素分析 ω/ 发热量/MJkg-1 样品 Mad Aad Vad Cdaf Hdaf Ndaf Qb,ad Qdaf 褐煤 9.87 17.81 31.89 75.21 5.5 1.39 32.89 16.44 煤的萃取过程如下取褐煤YM30 g 于烧杯中，加入 450 mL 去离子水，70℃萃取 48 h 后用普 ChaoXing 134 煤田地质与勘探 第 48 卷 通定性滤纸过滤[19]， 将滤液减压蒸馏浓缩 30 倍， 得 到水溶物 W1。将滤渣于 70℃烘干至恒重，得到水 萃余煤记为 W2。褐煤的萃取率计算公式如下 YMW2 YM 100 mm p m - 1 式中p 为萃取率，；mYM为萃取前褐煤质量，g； mW2为萃余物质量，g。 采用实验室前期保存的产甲烷菌群作为菌 源[20]，接种时每毫升菌源的总菌数为 1.7107个。 产甲烷菌群培养所用培养基为 2.9 g K2HPO4， 1.5 g KH2PO4，1.8 g NH4Cl，0.4 g MgCl2，0.2 g 酵母萃取 物，0.5 g L-半胱氨酸盐酸盐，去离子水 1 000 mL。 1.2 褐煤生物产气实验 生物产气实验分 4 组，每组设 3 组平行样，组 别设置见表 2。取 250 mL 厌氧瓶作为反应容器，加 入培养基 120 mL，分别以水溶物W1、萃余煤W2 和原煤YM作为底物，并以去离子水做空白对照。 底物添加完成后封口灭菌，然后冷却至室温，每瓶 接种 5 mL 菌液，接种完成后放入 30℃培养箱恒温 培养进行生物产气实验，实验启动当天记作 0 d，产 气实验周期为 45 d。各组的每克煤产甲烷量计算公 式为 （） EE00 22.4qQQmφφ- 2 式中QE为实验组产气量，mL；φE为实验组甲烷 体积分数，；Q0为对照组产气量，mL；φ0为对照 组甲烷体积分数，；m 为实验组换算原煤添加量， g；q 为每克煤产甲烷量，mmol/g；22.4 为气体摩尔 体积常数，mL/mmol。 采用 GC-MSAgilent，7890分析生物产气过程 中的气体成分，色谱柱为 Carbonplot60 m320 μm 1.5 μm， TCD 检测器， 气密针进样， 进样量 0.5 mL。 进样口温度 150℃，柱温箱温度 30℃，检测器温度 200℃。 表 2 生物产气实验设置 Table 2 Experimental setup for biogas production 底物类型及编号 底物添加量 换算原煤添加量/ g 去离子水 W0 5 mL 0 水溶物 W1 5 mL 10.0* 萃余煤 W2 2 g 2.1** 原煤 YM 2 g 2.0 注*计算公式为 1 W1W1 mT mm V ′ 式中 W1 m′ 为 5 mL W1 对应的原煤 YM 的质量，g；m1 为萃取时添加的原煤 YM 质量，g；T 为浓缩倍数；V 为 萃取时添加的去离子水体积，mL；mW1为 W1 底物添加 量 5 mL。 **计算公式 W2 W2 1 m m - p ′ 式中 W2 m′ 为 2 g W2 对应的原煤 YM 的质量，g；mW2 为 W2 底物添加量，g；p 为义马褐煤萃取率 4.1。 1.3 水溶性有机物的 HPLC-MS 分析 水溶性有机物的 HPLC-MS 分析步骤如下 ① 分 别取 W0、W1、W2、YM 实验组第 0 天和第 45 天 的发酵液各 10 mL，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤收集； ② 用 HPLC-QTOF液相色谱仪 Agilent 1290，配备 电喷雾离子源 6530 QTOF进行液体有机组分分析， 色谱柱为安捷伦 Zorbax C81.8 μm4.6 mm50 mm， 流动相为甲醇和 0.1甲酸，流速 0.5 mL/min，柱温 25℃，进样量 10 μL。质谱采集模式为正离子模式， Fragmentor 电压 130 V，毛细管电压 3 500 V，质荷 比扫描范围 50～450。 ③ 采用 Agilent MassHunter 工作站分别对各样品总离子流色谱图进行化合物分 子特征提取，用 Agilent Mass Profiler Professional 软件对生成的化合物进行空白扣除、筛选，选择在 3 组平行样中同时出现的化合物用于分析。 1.4 甲醇萃取物的 GC-MS 分析 为了考察生物作用后煤中极性有机物的生成情 况，基于甲醇沸点低、易挥发特性，根据相似相溶 原理，选取甲醇对褐煤进行萃取，便于萃取物样品 的 GC-MS 分析。GC-MS 分析步骤如下① 使用定 性滤纸过滤收集 W2 组产气实验后煤样，用 150 mL 去离子水清洗煤样 3 次后，在 70℃烘干至恒质量。 ② 分别取 1 g 实验前后的 W2 组煤样，加入 15 mL 甲醇，65℃浸泡萃取 72 h。使用旋转蒸发仪将甲醇 萃取液浓缩至 2 mL。 ③ 采用 GC-MSAgilent7890A/ 5795C进行组分分析，色谱柱为 VF-WAXms30 m 250 μm0.25 μm， 后运行温度为 280℃， 保持 5 min， 不分流进样，进样口温度为 250℃，进样量 0.8 μL， 吹扫速率 15 mL/min，吹扫时间 0.2 min，载气为高 纯度的氦气，柱流速 1.0 mL/min，初始温度 60℃， 保持 2 min，以 10/min ℃的速率升温至 250℃，保 持 20 min。 2 结果与讨论 2.1 产气量分析 义马褐煤的水溶物W1、水萃余煤W2和原 煤YM的生物产气结果为W2 和 YM 的产甲烷量 基本相等，分别为 0.45 mmol/g 和 0.46 mmol/g，而 W1 的 CH4产量为 0.15 mmol/g。若将 YM 和 W2 产 甲烷量的差作为 YM 中水溶性有机物的产甲烷量， ChaoXing 第 4 期 任恒星等 褐煤高温水萃物生物产气及化学组成变化 135 则 YM 中水溶性有机物产甲烷量为 0.01 mmol/g， 远 低 于水溶 物W1的 产甲烷量 0.15 mmol/g。 A. Furmann 等[13]研究发现烟煤在室温条件下用水萃取 24 h 得到的萃取物经生物作用不能产生甲烷，且水 萃物中未检测到有机物，认为在该萃取条件下水并 不是从煤中萃取有机物的有效溶剂。而本研究中萃 取温度为 70℃，从 W1 产气效果来看，该温度下使 用水作为萃取剂可以将煤中水溶性物质萃取出来并 被产甲烷菌群利用产生甲烷。另外，本研究中生物 产气实验所用的培养温度为 30℃，与 A. Furmann 等[13]使用的萃取温度相近，从 W2 和 YM 组产气结 果可以判断，在 30℃条件下 YM 中水溶性有机物同 样很难释放到发酵液中，因此，YM 和 W2 产甲烷 量基本相等，这也充分说明 30℃条件下 YM 中水溶 性有机物对产气几乎没有贡献，而 70℃萃取物中也 基本包含了 YM 的大量水溶性化合物。 2.2 义马褐煤水溶性有机物的化学组成 义马褐煤的 W1、 W2 和 YM 生物产气前后发酵 液质谱如图 1 所示。生物产气前，W1 组发酵液中 检测到 190 种化合物，化合物种类和丰度远超 W2 组及 YM 组，其种类上基本包含了 W2 和 YM 组的 化合物，表明实验所用萃取方法能有效提取义马原 煤中的水溶性有机物。W2 组和 YM 组在化合物种 类上基本相同，总共检测到 41 种化合物，其种类仅 占 W1 中检测到的化合物的 21左右。 生物产气后， 在 W1 组实验前发酵液检测到的 190 种化合物中， 有 139 种化合物在发酵液中消失，这些化合物应该 是微生物降解利用的底物。同时，在 W1 组发酵液 中新检测到 23 种化合物， 这些化合物应为水溶性有 机物降解后形成的产物。YM 组和 W2 组实验前发 酵液中检测到的 41 种化合物在实验后的丰度变化 与 W1 组基本相同。YM 组和 W2 组实验后的发酵 液中共新检测到 7 种化合物，其中 3 种化合物为 W2 组、YM 组、W1 组所共有，剩余 4 种为 W1 组 实验后的发酵液中未检测到的化合物，这 4 种化合 物应为煤中非水溶性有机物降解后的产物。结合气 体产量数据综合分析，W1 组中含有丰富的水溶性 有机物，且产气实验表明这些物质能被生物利用并 产生甲烷。在 W2 组煤中水溶性有机物被大部分去 除的情况下，其产甲烷代谢过程主要利用非水溶性 有机物，而根据 W2 组和 YM 组代谢产物和气体产 量相似性， 虽然 YM 组煤中含有丰富水溶性有机物， 但非水溶有机物仍然是甲烷的主要来源。 W1 产气前后发酵液的底物和产物分子量分布 如图 2 所示。从图中可以看出，底物分子量主要分 布于 200～300 Da， 且分子量大于 300 Da 的化合物较 多；而产物的分子量主要分布在 150～200 Da，且不 含分子量大于 300 Da 的化合物， 说明经生物产气后 分子量减小。在数量上，底物化合物的数量显著大 于产物化合物数量，说明经生物作用后化合物数量 明显减少。对 W1 组、W2 组和 YM 组的产物做分 子式推测，误差小于 3 mDa 的计算结果见表 3。可 以看出，这些化合物大多为含氧和氮化合物。结合 注m/z表示质量m与电荷z之比，即质荷比 图 1 实验前后发酵液质谱图 Fig.1 Mass spectra of fermentation broth before and after experiment 图 2 W1 组底物与产物的分子量分布 Fig.2 Molecular weight distribution of substrates and products of W1 group ChaoXing 136 煤田地质与勘探 第 48 卷 表 3 萃取物组、萃余物组和原煤组产物分子式计算结果 Table 3 The molecular ula calculation results for products of extract group, residue group and raw coal group 化合物序号 分子量/Da 保留时间/min 分子式 不饱和度* 分子量误差绝对值/mDa 实验组 1 161.0857 7.447 C10H11NO 6 1.61 W1 2 177.0808 5.863 C10H11NO2 6 1.79 W1 3 188.0835 7.576 C12H12O2 7 0.20 W1 4 246.0826 9.712 C13H14N2OS 8 0.08 W1 5 258.1254 10.079 C16H18O3 8 0.19 W1 6 147.0339 6.165 C8H5NO2 7 1.88 W1 7 103.0469 1.425 C4H9NS 1 1.31 W1 8 133.0543 7.073 C5H11NOS 1 1.79 W1 9 131.0417 1.426 C5H9NOS 2 1.21 W1 10 101.0852 4.634 C5H11NO 1 1.68 YM/W2 11 196.1479 10.266 C12H20O2 3 2.12 YM 12 222.0923 9.708 C10H14N4S 6 1.07 YM 注*表示不饱和度，计算公式为 11 HN22 DBE1- C nn n，其中nC、nH、nN分别为碳、氢和氮原子数。 元素分析数据，原煤中含氮量为 1.39，含氧量为 16.44。较高的杂原子含量为微生物降解提供了潜 在位点[21]， 生成了含氮和氧的产物。 除化合物 711 外， 其他化合物含 8～13 个碳原子， 且不饱和度大于 6， 而苯的不饱和度为 4，表明分子结构中存在 1 个以上 的苯环结构，但具体的分子结构还需进一步鉴定。 2.3 义马褐煤甲醇萃取物的化学组成 义马褐煤水萃余煤W2经甲醇萃取后的 GC- MS 结果如图 3 所示。W2 组实验前后煤样的甲醇萃 取物中均检测到了种类丰富酯类、烃类等非水溶性 化合物，但是这些化合物实验前后的丰度无显著变 化，说明这类物质很难被微生物降解利用。值得注 意的是，在实验后甲醇萃取物中出现了实验前煤样 甲醇萃取物中未检测到的甲酰胺、乙酰胺、亚硫酸 二甲酯三种化合物，并且在 W2 组实验后的发酵液 中 3 种物质的分子离子峰也不存在。这 3 种化合物 较其他酯类、烃类化合物水溶性高，且都含有杂原 子。李文军等[22]研究了甲醇萃取对大雁褐煤孔隙结 构的影响，认为甲醇能萃取游离或镶嵌于煤的大分 子结构中的化合物。因此，推测这些物质可能是由 微生物分解煤中非水溶性化合物后所产生，虽然这 些化合物是水溶性的，但由于其游离或镶嵌于煤大 分子结构中，其并未释放到培养液中，需要在甲醇 萃取作用下才能释放出来。 3 结 论 a. 70℃条件下，利用去离子水萃取结合减压蒸 馏浓缩的方法能有效提取义马褐煤中的水溶性有机 质，这些有机质能被微生物利用并产生甲烷，甲烷 产量为 0.15 mmol/g。 b. 义马褐煤的水萃取物中共检测到190种有机 图 3 W2 组实验前后煤样甲醇萃取组分 GC-MS 分析 Fig.3 GC-MS analysis of methanol extracts of W2 group before and after experiment 化合物，其分子量主要集中在 200～300 Da。经生物 产气后水溶物中化合物的分子量降至 150～200 Da， 化合物数量显著减少，分子量显著降低，形成的产 物多为含苯环和杂原子的化合物。 c. 水溶性有机物从褐煤释放到水中是一个缓 慢的过程，在微生物降解煤产甲烷相互过程中，非 水溶性有机物是甲烷产生的重要来源。产甲烷微生 物能降解利用煤中非水溶性有机物并产生部分水溶 性有机物，如甲酰胺、乙酰胺、亚硫酸二甲酯。 d. 研究证实，高温条件下褐煤中水溶性有机质 具有产气潜力，如果能通过某些温和的方法促进煤 中水溶性有机物的释放进而被微生物转化成甲烷， 将能够促进煤的生物产气过程。 请听作者语音介绍创新技术成果 等信息，欢迎与作者进行交流 参考文献References OSID 码 [1] WANG A K，SHAO P，LAN F J，et al. 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