一株造纸废水降解菌的分离、鉴定及特性研究.pdf

一株造纸废水降解菌的分离、 鉴定及特性研究 李朝霞 1 丁成 2 严金龙 2 1. 盐城工学院化学与生物工程学院，江苏 盐城 2240051; 2. 盐城工学院环境科学与工程学院，江苏 盐城 224051 摘要 将不同稀释倍数的造纸废水接种在细菌培养基上， 培养 2 d 后采用划线法分离， 然后采用琼脂块培养法， 把每一 个长满单菌落的琼脂块分别接种到选择培养基中， 选取 COD 降解能力最大的作为目标菌株， 最后从造纸废水初始浓 度、 温度、 pH 值、 接种量、 降解时间等方面讨论了该菌株对造纸综合废水的降解特性。结果表明 所筛得的目标降解菌 ZH3 菌体直径为 0. 6 ～ 0. 8μm 1. 4 ～ 2. 4μm， 杆状， 有数根鞭毛， 无芽孢， 为革兰氏阴性菌， 初步鉴定该菌属产碱 假单胞菌， 该菌降解造纸综合废水的适宜条件为废水初始 COD 浓度为500 mg/L， 温度为30 ～ 35 ℃ ， pH 为 7. 0， 接种量 为 10 ， 降解时间为48 h。 关键词 废纸造纸废水;降解菌株;分离鉴定;降解特性 ISOLATION，IDENTIFICATION AND DEGRADATION CHARACTERISTICS OF A PAPERMAKING WASTEWATER DEGRADING STRAIN Li Zhaoxia1Ding Cheng2Yan Jinlong2 1. School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China; 2. School of Environmental Science and Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China AbstractPapermaking wastewater diluted in different concentrations was inoculated and cultured at 35 ℃ in the bacterial medium for 2 days to abtain colonies by streak plate ． Using agar block ，each block of agar covered with a single colony was inoculated into the selective medium when the strains grown up． The target strain named ZH3，was selected and isolated by comparing the COD degradation rate of pulp wastewater． To discuss the degradation characteristics of the target strain on papermaking wastewater，single factor test was carried out from initial COD concentration of wastewater，temperature， pH，inoculum and degradation time． The results show that the strain cell size is 0. 6 ～ 0. 8μm 1. 4 ～ 2. 4μm，with flagella and no spore． It belongs to Pseudomonas alcaligenes． The optimum conditions of the strain are initial COD 500 mg/L， 30 ～ 35 ℃ ，pH 7. 0，10 inoculum and degradation time 48 h． Keywordspapermaking wasterwater;degrading strain;isolation and identification;degradation characteristics 我国造纸工业的污水主要来自碱法 包括硫酸 盐法 化学浆厂 ［1］。废纸造纸废水成分复杂， 其中所 含的特征污染物 ［2］如邻苯二甲酸二乙酯、 邻苯二甲 酸二异丁酯、 丁羟甲苯、 木质素和 Ca2 等导致废水中 COD 含量高、 色度差、 可生化效果不高、 废水回用和 达标排放难等问题。在造纸废水的各种生物处理工 艺中以厌氧-好氧工艺处理效果最佳， 而厌氧工艺次 之 ［3- 7］， 所涉及到的微生物有细菌、 真菌、 藻类和原生 动物 ［8- 12］等， 其中细菌是最主要的有效作用菌。本试 验从废纸造纸废水中分离到一株能够以该废水为营 养源的产碱假单胞菌 ZH3， 并对该菌株进行了初步鉴 定和降解特性研究。 1试验材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1菌种来源 本试验菌种于 2010 年 5 月采自江苏双灯集团公 司废水 输 送 水 道 中 的 废 纸 造 纸 废 水 ρ COD为 5 032 mg/L， 下称“原水” ， 采集回后于冰箱冷藏。 1. 1. 2仪器设备 7202-B 型可见分光光度计 Unico 公司 ， SW-CJ- 2FD 型双人单面净化工作台 苏州净化 ， Cs101- 2 鼓 风干燥箱 重庆万达仪器公司 、 XS- 212- 201 显微镜 济南胜利科学器材有限公司 、 LRH- 250A 型生化培 养箱 广东省医疗器械厂 、 BCD- 130HTB 冰箱 青岛 421 环境工程 2011 年 12 月第 29 卷第 6 期 海尔电器集团公司 。 1. 1. 3培养基 细菌培养基 ［13］ 牛肉膏3 g， 蛋白胨10 g， NaCl 5 g， 琼脂15 g， 蒸馏水1 000 mL， 调节 pH 为 7. 0 ～7. 2。 选择培养基 水样 1 000 mL。 两种培养基均需121 ℃ 灭菌25 min。 1. 2方法 1. 2. 1目标菌株生长的测定 平板菌落计数法和光密度法 ［13］。 1. 2. 2废水中 COD 的测定 重铬酸钾法 ［14］和紫外分光光度法［15- 16］ 1. 2. 3目标菌株的分离与筛选 向 5 个无菌培养皿中倒入细菌培养基， 分别接入 1 mL 不同稀释度 1、 1 /2、 1 /4、 1 /5 和 1 /10 的原水， 置入35 ℃ 恒温培养箱中培养 2 d。待菌株长出后， 采 用琼脂块培养法 ［17］， 在单人双面净化工作台中用打 孔器打孔培养， 用打孔器一一取出长有单菌落的琼脂 小块， 并分别将其整齐地移入灭过菌的空培养皿中， 在35 ℃ 恒温培养箱中继续培养 4 ～ 5 d， 然后把每一 长满单菌落的琼脂块分别接种到选择培养基中， 于 35 ℃ 下培养 2 d， 选择培养基的 COD 值降解最大者 为目标菌株。 1. 2. 4目标菌株的形态观察与生理生化鉴定 参照菌种保藏手册 ［18］ 和伯杰细菌鉴定手 册 ［19］，对菌株进行形态观察与生理生化鉴定。 1. 2. 5目标菌株降解特性试验 试验考察了废水初始 COD 浓度、 温度、 pH 值、 接 种量、 降解时间等因素对目标菌株生长量及废水降解 率的影响。具体条件如下 1按 10 接种量向梯度 初 始COD浓 度 100，250，500，1 000，2 500， 5 000 mg/L 废水中接入目标菌株， 于 pH7. 0， 35 ℃ 下150 r/min振荡培养48 h; 2按 10 接种量向 COD 500 mg/L废水中接入目标菌株， 在梯度温度 20， 25， 30， 35， 40 ℃ 下， 于 pH 7. 0、 150 r/min振荡培养48 h; 3按 10 接种量向 COD 500 mg/L废水中接入目标 菌株， 在不同 pH 分别为 6. 0、 7. 0、 8. 0、 9. 0、 10. 0 下， 于 35 ℃ 、 150 r/min 振 荡 培 养 48 h; 4 向 COD 500 mg/L废水中接入不同接种量 1 、 5 、 10 、 15 、 20 的目标菌株， 于 pH7. 0， 35 ℃ 下150 r/min 振荡培养48 h; 5按 10 接种量向 COD 500 mg/L废 水中接入目标菌株， 于 pH7. 0， 35 ℃ 下150 r/min振荡 培养 不同时间 0， 2， 4， 6， 8， 12， 16， 24， 32， 40， 44， 48 h 。分别测定各试验条件下菌体的生长量和废水 COD 降解率。 2结果与讨论 2. 1废水 COD 浓度-吸光度标准曲线 用重铬酸钾法测定原水中的 COD 值， 用紫外光 度法测定原水梯度稀释液的吸光度， 绘制吸光度与 COD 的标准曲线方程为 y 0. 0032x 0. 0853 其中 y 为 A254值; x 为废水 COD 浓度， mg/L ， 相关系数 R2 0. 9989。可见， 废水 COD 浓度在 5 ～ 250 mg/L范围内 的吸光度与 COD 浓度成良好的线性关系。 2. 2目标降解菌株的筛选与鉴定 按 1. 2. 3 方法筛选到 ZH3、 ZH7、 ZH11 三株菌株 优势降解菌株， 测定菌株 ZH7 的吸光度为 0. 694; 菌 株 ZH11 的吸光度为 0. 874; 菌株 ZH3 的吸光度为 0. 945。所以菌株 ZH3 为本试验筛出的目标菌。 目标菌株的菌落中等， 形态为乳白色， 圆形， 边缘 不整齐， 湿润， 半透明， 易挑起． 细胞大小为 0. 6 ～ 0. 8μm 1. 4 ～ 2. 4μm， 呈杆状， 无芽孢， 长单根端 生鞭毛， 革兰氏阴性。能利用柠檬酸盐并使明胶液化， 淀 粉水解， V． P 试验阴性， 初步鉴定为产碱假单胞菌。 2. 3目标菌株的细胞数量 － OD 值标准曲线的绘制 2. 3. 1目标菌株最大吸收波长的测定 对于细菌来说， 在波长 400 ～ 700 nm 的可见光 区， 不同波长下测得的菌液 OD 值如图 1 所示。由图 1 可知 在 400 ～ 700 nm 范围内， OD 值先增大后减 小。当波长为 580 nm 时， 该菌的 OD 值最大。因此 该菌的最大吸收波长为 580 nm。 图 1目标菌株吸收波长与 OD 值的关系 2. 3. 2目标菌株细胞数量与 OD 值之间的相关性 采用稀释平板法测定到初始菌悬液浓度 C0为 6. 6 106cfu/L， 将初始菌悬液分别稀释 1 倍、 2 倍、 3 倍、 4 倍和 5 倍， 测定的不同菌悬液 OD580 nm值与目标 菌株细胞数量满足 y 1. 5763x 0. 0251 其中， y 为 菌悬液OD值; x 为菌体浓度， 106cfu/mL 。在一定范 521 环境工程 2011 年 12 月第 29 卷第 6 期 围内， 目标菌株的细胞数量与 OD580 nm值具有良好的 线性关系 R2 0. 9989 ， 因此可用 OD580 nm值间接表 示目标菌株的细胞数量。 2. 4目标菌株降解特性研究 按 1. 2. 5 方法进行目标菌株的废水降解单因素 试验， 结果如图 2图 6 所示。 图 2废水初始 COD 浓度与降解菌降解率和生长数量关系 图 3温度对降解菌降解率和生长数量关系 图 4pH 对降解菌降解率和生长数量关系 图 5接种量对降解菌降解率和生长数量关系 图 2 表明 在一定条件下， 该菌株的生长和初始 COD 浓度所对应的降解率呈正线性关系。当初始 图 6降解时间对降解菌降解和生长数量关系 COD 浓度在100 ～ 500 mg/L的范围内时， 降解率随菌 体浓度的增加而上升， 在 500 mg/L时达到最大， 其降 解率最高， 当初始 COD 浓度大于 500 mg/L时， 菌体 浓度和降解率开始下降。说明该菌在 COD 浓度为 500 mg/L时生长最好， 并能达到很好的降解效果。 图 3 表明 该菌在20 ℃ 和40 ℃ 均能生长， 且其 生长量和 COD 降解率均随温度的增加而先增加后降 低。在35 ℃ 时， COD 的降解率和菌体的生长量均达 到最大， 30 ℃ 时次之。故 30 ～ 35 ℃ 是其适宜温度。 图 4 表明 在一定条件下， 该菌株的生长和初始 pH 所对应的 COD 降解率呈正相关。目标菌株在中 性或碱性环境时都有较高的活性， 而在酸性环境中生 长不好。而 pH 为 7. 0 时， 菌株对 COD 的降解率和菌 株的细胞生长均最好。因此选 7. 0 作为适宜 pH 值。 图 5 表明 接种量在 1 ～ 20 的范围内， 菌体 生长量逐渐增大， 而 COD 的降解率先增加后下降。 该菌生长和降解 COD 的适宜接种量范围为 5 ～ 15 ， 在 10 时其降解率达到最高， 因此 10 的接种 量为合适的接种量。 图 6 表明 在一定条件下， 随着菌体的不断增长， COD 的降解率不断增大， 呈正相关。菌体在 44 h 时 菌体的生长量较高， 其光密度 OD 值最大。在48 h后 菌体浓度开始趋向稳定，COD 浓度保持稳定。 3结论与建议 1 本试验采用平板划线法和琼脂块培养法成功 地从高浓度污染造纸综合废水中分离到一株高效降 解菌， 对该菌的生理生化试验鉴定结果表明， 该菌属 产碱假单胞菌属。 2 用该菌降解废水的单因素试验表明， 该菌株 能够在不同浓度的废水中进行生长代谢， 废水初始 COD 为 500 mg/L左右， pH 值为 7. 0 左右， 温度为 30 ～ 35 ℃ 、 接种量为 10 左右及降解时间为48 h是 该菌适宜的降解条件。 621 环境工程 2011 年 12 月第 29 卷第 6 期 3 本试验对获得的目标菌株从主要的环境因素 方面进行了单因素研究， 其他影响该菌株降解的条 件， 如培养基的选择与配方等还有待进一步的研究。 同时， 对其降解部位、 降解过程等降解机理还需更深 入探索。另外， 在实际的生物降解过程中， 常常存在 多种微生物对 COD 的协同作用， 这也可作为工作重 点之一。 参考文献 ［1］林乔元． 我国造纸工业碱法制浆水污染的防治［J］． 中国造 纸，2003，12 9 62- 68． ［2］颜高锋， 史惠祥，万先凯，等． 废纸造纸废水特征污染物筛选 及其迁移转化规律［J］． 环境科学研究， 2010， 23 4 504- 509． ［3］丁以俊， 金辉． 造纸废水的治理［J］． 江苏环境科技， 2008， 21 S1 35- 36． ［4］张坷． 造纸工业蒸煮废液的综合利用与防治技术［M］． 北京 中国轻工业出版社，1992． ［5］易封萍． 臭氧一混凝法处理造纸废水［J］． 工业水处理，2007， 21 1 34- 36． ［6］蒋佩霞， 黄江丽， 张晓杰． AAB 式生物处理高浓度造纸 废水 ［J］． 环境工程，2004， 12 1 11- 13． ［7］Pixxichini M，Russo C，Meoc D． Purification of pulp and paper wastewater， with membrane technology，for water reuse in a closed loop［J］． Desalination，2005，178 12 3512- 3591． ［8］胡明，张为灿，卢雪梅，等． 黄孢原毛平革菌产生的具有氧化 性活力低分子肽类物质的分离纯化与性质鉴定［J］． 中国科学 C 辑，2006，36 1 43- 50． ［9］Michad AP，RosaR，etal. 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