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硝化悬浮填料塔中氨氧化细菌 群落稳定性特征分析 ＊ 王 峰 夏四清 史 妍 傅以钢 同济大学环境科学与工程学院污染控制与资源化研究国家重点实验室, 上海 200092 摘要 利用 PCR -DGGE 分析技术, 对于化学生物絮凝处理工艺中悬浮填料塔的氨氧化细菌 AOB群落进行了研究。 主要考察了曝气强度和水力停留时间 2个运行参数调整的情况下, 系统 AOB 群落结构的变化。 生物膜样品直接取自 硝化填料塔, 多维尺度 MDS 方法用于 DGGE电泳图谱的分析, 分析结果以二维图形向量的方式显示, 结果表明, 曝气 强度和水力停留时间均对AOB群落有一定的影响, 主要的 AOB 种类在运行过程中基本不变, 系统对于运行条件具有 良好的稳定性。 关键词 聚合酶链式反应 浓度梯度凝胶电泳 氨氧化菌 AOB ＊上海市曙光计划课题 03SG20和高等学校博士点基金课题 20050247016 0 引言 悬浮填料床是一种高效生物接触氧化工艺,反应 池结构与活性污泥工艺一样, 生物载体在反应池内不 需要固定和支架 , 对有机污染物和氨氮去除效果好, 运行费用低 [ 1 -4] 。该研究中将悬浮填料床与化学生物 絮凝相结合形成一个深度集成的化学生物絮凝处理 工艺, 达到高效去除废水中有机污染物和氮 、 磷的目 的,是一种适合我国大部分地区的城市污水处理的新 工艺 。 硝化过程涉及到的功能菌群主要包括氨氧化细 菌 Ammonia Oxidizing Bacteria ,AOB 和亚硝酸盐氧化 细菌 Nitrite Oxidizing Bacteria, NOB 。污水生物处理 脱氮过程涉及的 AOB 菌群主要为β 亚类变形杆菌中 的亚硝化单胞菌属 Nitrosomonas 属 [ 5,6] 。 实验中将分子生物技术用于硝化悬浮填料塔中 AOB 的群落分析 , 研究不同的工艺参数运行过程对 于系统AOB 群落稳定性的影响 。工艺试验阶段主要 调节的参数为气 水比和水力负荷, PCR-DGGE 方法 用于分析 AOB 群落结构组成, 同时还利用多维尺度 分析 Multidimensional Scaling ,MDS 技术分析不同阶 段微生物结构的相似性程度。 1 材料和方法 1. 1 实验装置运行 试验中试装置位于上海安亭污水处理厂 ,化学生 物絮凝处理工艺流程与硝化悬浮填料塔的结构分别 显示于图 1 和图 2。悬浮填料塔是一种生物膜法反 应器, 其主要作用是硝化 ,池中投加高比表面积的球 形悬浮填料 。有效水深 5 m, 设计处理水量 100 m 3 d, 水力停留时间为 1. 2 h 。池中投加的球形悬浮填料直 径为 25 mm, 填料投加量约为0. 5 m 3 m3 。 图 1 化学生物絮凝中试装置工艺流程 中试装置进水为上海安亭地区市政污水 ,在取样 的5 个运行条件下 ,进水 NH 4- N 浓度范围为 11. 5～ 16. 9 mg L ,浓度较低 ,化学生物絮凝反应池与悬浮填 料塔 出水中 平均氨 氮浓度 分别 为 10. 3 mg L 和 6. 5 mg L ,平均去除率分别为 23. 8和 51. 8。5 个 阶段运行条件显示于表 1。 图 2 悬浮填料塔结构 1. 2 取样预处理与总 DNA 提取 悬浮填料床内生物膜样品用无菌刷刷取 5 个填 料上的生物膜, 悬浮于无菌水 20 mL 中, 10 000 r min 10 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 离心后取生物膜沉淀 -30℃冰冻保存待 DNA 提取。 采用修改的总 DNA 提取方法 [ 7] 。 表 1 5个取样阶段运行条件 取样 悬浮填料床进水流量 m3h- 1 悬浮填料床 气水比 悬浮填料床水力 停留时间 h a1. 01∶ 18. 0 b1. 41∶ 15. 7 c2. 11∶ 13. 8 d2. 01. 5∶ 14. 0 e2. 02∶ 14. 0 1. 3 PCR反应 PCR扩增过程采用嵌套式 PCR Nested PCR 方 案 [ 8,9] ,第一组 PCR 反应采用 CT0189fAB 、CT0189fC 两种正向引物混合物 与 CT0653r 反向引物 ,引物 主要针对 β 亚类 AOB ; 第二组 PCR 利用第一组 PCR 反应产物作为模板 , 引物采用 P338F-gc 和 P518r, 主 要针对真细菌类的 16S rDNA V3 片段 ,终产物长度约 为240 bp 包含 GC 对 [ 8] 。 1. 4 变性梯度凝胶电泳分析 凝胶变性梯度 30～ 60。150 V, 电泳缓冲液 为1 TAE ,60 ℃,电泳时间5 h。用溴乙锭染色后 ,经 呈像系统摄像与分析 。 2 结果与讨论 2. 1 变性梯度凝胶电泳图谱 在5 个运行条件下 ,AOB 菌群的 DGGE 图谱显示 于图 3,利用软件分析图谱中分离条带的特征分布。 在所有样品分离出的可辨条带共有 13 条 图 3 ,5 个 样品中可分辨的条带分别为 8、 6、7、 8、5种 。样品 a, b ,c 显示出水力负荷对于AOB 菌群的影响, 样品 a 与 样品 b、 c 中群落结构变化显著 ,典型表现在条带2、 3、 8、 9、10 的密度变化上 。条带 3 、 10 仅在样品 a 中出 现,在水力停留时间减小后的运行条件下 ,该条带没 有被观察到 。条带 2、8 和 9 在较长的水力停留时间 条件下亮度较弱 ,随着停留时间的缩短 , 该条带的亮 度明显上升, 此外 ,在样品 c 中还出现了特征条带 4。 总的来说, 样品 b 与 c 之间变化程度小于样品 a 与样 品b 、 c 。 样品 c 、 d、 e 考察了在较大水力停留时间条件下, 系统不同的曝气强度对于AOB 群落的影响 。典型的 变化出现在条带 7 和 13的密度上 。条带 7 的亮度随 着气 水比的增强而升高 ,而条带 13则表现出相反的 变化趋势, 在样品 c 中明显可见, 在样品 d 、 e 中已变 图 3 不同工艺运行条件下填料塔中 AOB 菌群结构的 DGGE图谱 Lane a～ e 分别为样品 a～ e 得不易分辨 。同时, 在样品 c、 d 中分别出现新的条带 4 和 5。在气 水比条件变化的过程中 ,一些主要的优 势条带密度没有明显的变化 , 如条带 2、8、9, 表明由 曝气强度变化引起的 AOB 群落变化程度较弱 。 2. 2 不同样品间相似性分析 利用 DGGE 图谱经软件分析后得到特征条带出 现的数值阵列 ,其中软件可辨的条带数值为 1, 不可 分辨的为 0, 将数值矩阵输入 SPSS 统计学软件进行 多维尺度分析 MDS ,结果显示于图 4。 图 4 不同运行条件下 AOB群落结构MDS 分析结果 条件1～ 5 分别为样品 a ～ e 不同曝气强度与水力停留时间条件下,系统AOB 群落结构相似性的二维空间分布分别集中在两个区 域。实验条件下 ,与梯度曝气强度相比 , 不同的水力 停留时间形成的菌群结构特异性分布更加分散,显示 出在实验范围内, 水力停留时间的调整造成的 AOB 群落结构差异比曝气调整的结果更加明显。在 5 种 运行条件下 ,样品 a 的相似性程度最差, 与其他样品 在空间分布的距离最远 。样品 c 、 d 、 e 相似性的空间 分布相对集中, 表明曝气强度的变化对于菌群结构的 影响较小。除样品 a 外的4 种样品的相似性分布较为 接近,说明在大部分的运行条件下,悬浮填料塔中AOB 群落结构变化不大,对于水力停留时间和曝气强度的 调整适应性较好,群落结构具有良好的稳定性。 11 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 3 结论 实验中利用特异性引物针对 AOB 菌群进行分 析。电泳中共分离到 AOB 类 的 16SrDNA 片段约 13 条,水力停留时间与曝气强度的改变对于菌群结 构具有不同程度的影响 。不同工艺参数对于菌群影 响程度存在差别 ,利用 MDS 方法评估不同样品间的 相似性程度 ,结果表明 , 水力停留时间能够造成菌群 更大的改变 。作为硝化过程中的主要功能菌群,AOB 类在系统运行过程中基本保持了稳定, 主要的优势细 菌种类没有太大变化 。此外, 实验中进水氨氮浓度在 一定程度上存在波动 ,水力停留时间的调整同时也意 味着处理负荷的变化 ,说明系统在不同的负荷冲击下 具有很好的适应性。 利用 PCR-DGGE 方法可以避免传统培养过程所 受到的微生物培养性的限制, 一方面可利用多样性指 数、 聚类分析、 MDS 分析等方法分析特定微生物群落 的结构特征,另一方面也可通过分离过程取得的特定 微生物核酸片段 ,进行目标菌种的分类学鉴定 ,获得 系统微生物组成信息 。目前在环境科学领域 ,该项技 术已经得到了一定的应用 。这项技术的更好运用也 有赖于特定微生物群落知识的积累与特异性引物的 设计 。 参考文献 [ 1] 夏四清, 徐斌, 高廷耀, 刘新超. 悬浮填料床生物预处理黄浦江 原水中试研究. 同济大学学报, 2003, 31 8 977 -981. 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[ 5] 夏北成. 环境污染物生物降解. 北京 化学工业出版社, 2002 320 -323. 作者通讯处 王丽坤 300222 天津市河西区大沽南路 1038 号 天 津科技大学海洋科学与工程学院 168信箱 E -mail wlkun24sohu. com 2005- 07-15 收稿 12 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 ISOLATION AND NUTRIENT BALANCE OF PREDOMINANT BACTERIA FOR DEGRADING PETROLEUM OF CONTAMINATED SOILHuang Tinglin Chai Beibei Ning Yaping7 Abstract In order to restore the soil contaminated by petroleum more effectively, a strain of highly efficient petroleum degrading bacteria, which hasbeen differentiated as Zoogloea sp. ,was enriched and isolatedfrom the contaminated soil by using the oil as the only source of carbon. Whose nutrient balance conditions were studied initially. The experimental results indicated that ammonium nitrate NH4NO3was the predominant nitrogen source and the nutrient balance between N and P ratio for this strain kept at N∶ P4∶ 1. Keywords soil lightly contaminated by oil, predominant bacteria to degrade oil, screening isolating and nutrient balance STABILITY ANALYSIS OF AOB COMMUNITY IN NITRIFYING SUSPENSION FILLER TOWER Wang Feng Xia Siqing Shi Yan et al 10 Abstract It was studied that ammonia -oxidizing bacteria AOBcommunity in a nitrifying suspension tower for biochemical flocculation process, using PCR -DGGE technique. The change in systematic AOB community structure was examined under the regulation of aeration strength and hydraulic residence time RHT. The biofilm sampleswere takendirectly from a nitrifying filler tower. MDS was used for the analysisof DGGE electrophoretogram, and the results were displayed by 2 -D pattern. The results show that the aeration strength and RHT have a certaineffect on AOB community. The main AOB strains remain unchanged in the process of running. Keywords polyase chain reaction, concentration gradient of gel electrophoresis and AOB THE FUNCTION OF PROTOZOA SARCODINA AS NITRIFICATION INDICATOR IN THE PROCESS OF SEQUENCING BATCH REACTORDing Guoji Li Jun 13 Abstract The analysis of relationship between the density of Sarcodina and the nitrification ratio in the process of sequencing batch reactor SBR under the control of aeration showed that Arcella gibbosa, Arcella vulgaris and Pyxidicula operculata were good nitrification indicator. However, A. gibbosa and A. vulgaris were better than P. operculata as the nitrification indicator considering the relativity with nitrification ratio and the convenience of observation. Keywords SBR process, Sarcodina, nitrification and indicator PRIMARY STUDY ON PHYTOREMEDY OF CONTAMINATED WATERWITH PCOPs Wan Dajuan Chen Xian Jia Xiaoshan 16 Abstract Phytoremediation of contaminated water with PCOPs 1, 2, 4-TCB and pp ′ -DDTwere studied by the of water -culture medium. Results showed that ryegrass could absorb and degrade 1, 2, 4 -TCB and pp′ -DDT, reduce the content of PCOPs in water. The growth of ryegrass was affected by the variety and concentration of PCOPs. The absorption capability of ryegrass inwater was lower than in soil. Keywords plant, absorb, degrade, water and PCOPs EFFECTS OF PLANT SELECTIONON THE NITROBACTERIA DENSITY IN RHIZOSPHERE AND NITROGEN REMOVAL IN CONSTRUCTED WETLANDS Zhou Wei Huang Minsheng Nian Yuegang 18 Abstract Effects of plant selection on the nitrobacteria density in rhizosphere and nitrogen removal in constructed wetlands had been presented. Experimental results showed that there were very high density of nitrobacteria in the rhizospheres of wetlands planted with Zizania caduciflora, Scirpus validus, Iris pseudacorus under appropriate DO and pH conditions. Nitrobacteria density in the rhizosphere is always higher than that in the substrate of the wetlands which is due to the difference of DO levels. And the nitrogen removal efficiencies are related positively to the nitrobacteria density and water temperature, which indicates nitration of microbes and assimilation of the plants played important roles in the nitrogen removal of wetlands. Keywords constructed wetlands, rhizosphere, ntrobacteria, nitrogen removal and experimentation DEGRADATIONOFORGANOCHLORINEPESTICIDESINAMERICANGINSENGBY BIOLOGICAL WAYWang Likun Pang Jinzhao Liu Wenzhi et al 21 Abstract The bacterial strain which can degrade organochlorine pesticideswith high effect was isolatedfrom soil planted American ginseng. The solid preparation made by the strain applies to field experiments via three -year -old ginseng in one year, indicating the degradation rate of the strain for total amount of BHC up to 36. 27～ 49. 90, the degradation rate of the strain for total amount of DDT up to 25. 19～ 35. 61. Keywords organochlorine pesticides, degrading bacterium and American ginseng EXPERIMENT ON THE COUPLING BIOREACTOR FOR THE DOMESTIC WASTEWATER TREATMENT OF LOW C N RATIO IN DIFFERENT OPERATING MODES Li Jun Zhang Ning Yang Haiyan et al 23 2 ENVIRONMENTAL ENGINEERING Vol. 24,No. 3, Jun. , 2006