SPE-RRLC-MS_MS法测定制药废水中青霉素G.pdf

SPE-RRLC-MS/MS 法测定制药废水中青霉素 G * 李再兴 1， 2 张非非 1 左剑恶 2 王勇军 3 陈平 3 周崇晖 3 余忻 2 1． 河北科技大学环境科学与工程学院， 石家庄 050018; 2． 清华大学环境学院， 北京 100084; 3． 华北制药集团有限责任公司环境保护研究所， 石家庄 050015 摘要 建立了利用固相萃取 － 高分离度快速液相色谱 － 串联质谱 SPE-RRLC-MS/MS 测定制药废水中青霉素 G 残留的 方法。水样以 30 硫酸锌 20 亚铁氰化钾作为沉淀剂沉淀蛋白质后， 上清液采用 Oasis HLB 固相萃取柱富集和净化， 以 0. 01 mol/L 乙酸铵溶液 加 0. 1 甲酸 乙腈作为流动相进行等度洗脱， 经 Agilent Plus C18柱分离后， 在串联质谱 ESI 源下进行 MRM 检测。该方法的青霉素 G 检出限 S/N 3 为 0. 02 μg/L， 目标物在 0. 0020 ～ 1. 0 mg/L 范围内线性 关系良好， 线性相关系数为 0. 9997。在 0. 20， 1. 0， 2. 0 μg/L 添加水平平均回收率为 74. 6 ～ 101. 4 ， 相对标准偏差为 4. 49 ～8. 17 。该方法灵敏度高、 重现性好、 定性定量准确， 可满足制药废水中青霉素 G 残留检测的要求。 关键词 青霉素 G; 高分离度快速液相色谱 － 串联质谱; 固相萃取; 制药废水 DOI 10. 7617 /j. issn. 1000 － 8942. 2013. 03. 035 DETERMINATION OF PENICILLIN G IN PHARMACEUTICAL WASTEWATER BY SPE- RRLC- TANDEM MS Li Zaixing1，2Zhang Feifei1Zuo Jiane2Wang Yongjun3Chen Ping3Zhou Chonghui3Yu Xin2 1． School of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018， China; 2． School of Environment，Tsinghua University，Beijing 100084， China; 3． Environmental Protection Institute of NCPC，Shijiazhuang 050015， China AbstractA based on solid phase extraction-rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry SPE- RRLC-MS/MSwas developed to determine penicillin G in pharmaceutical wastewater． Water samples were firstly purified through protein precipitation processes with 30 zinc sulfate and 20 potassium ferrocyanide，and then the penicillin G was enriched and purified with Oasis HLB SPE，separated through Agilent Plus C18RRLC using 0. 01 mol/L ammonium acetate solution 0. 1 ic acidand acetonitrile as mobile phase，and detected by mass spectrometry in positive ion mode with multiple reaction monitoring MRMusing an electrospray ionization interface． The detection limit S/N 3was 0. 02 μg/ L． The linear range was 0. 0020mg/L to 1. 0 mg/L，with a correlation coefficient of 0. 9997． The recoveries at the spiked concentration of 0. 20 μg/L， 1. 0 μg/L and 2. 0 μg/L ranged from 74. 6 to 101. 4 ，with a relative standard deviation from 4. 49 to 8. 17 ．The procedure provides a rapid，reliable and sensitive for determination of penicillin G in pharmaceutical wastewater． Keywordspenicillin G; rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry RRLC-MS/MS ; solid phase extraction SPE ; pharmaceutical wastewater * “十一五” 国家水体污染控制与治理科技重大专项 2008ZX07529- 006 ; 河北省重大技术创新项目 12276703Z 。 0引言 青霉素 G penicillin G 属 β-内酰胺类抗生素， 是 发现最早也是应用最为广泛的抗感染药物， 同时它还 是生产头孢菌素类抗生素的重要中间体和原料 ［1］。 近年来青霉素 G 的生产和使用量逐年增大， 由此产 生的环境问题越来越受到重视 ［2］。在青霉素 G 生产 过程中会产生大量的发酵废水， 如果处理不彻底， 容 易导致药 物 残留， 排 放入 环 境 产 生 潜 在 的 环 境 风 险 ［3］。为实现废水的安全排放， 加强对制药废水中 青霉素 G 残留的检测变得非常重要。 青霉素 G 的检测方法主要有微生物法、 酶联免 531 环境工程 2013 年 6 月第 31 卷第 3 期 疫法、 液相色谱 － 紫外法、 液相色谱 － 荧光法、 液相色 谱 － 串联质谱法等 ［4］。微生物法、 酶联免疫法和液 相色谱 － 紫外法均不适合低浓度青霉素 G 的检测; 液相色谱 － 荧光法虽然灵敏度高， 但测定过程中需要 进行衍生， 步骤繁琐且重现性较差; 而液相色谱 － 串 联质谱法因其较高灵敏度和特异性受到广泛应用。 近年来液相色谱 － 串联质谱法与固相萃取技术联用 使得前处理更加简单， 检出限更低， 在牛奶 ［5- 7］、 蜂 蜜 ［8］和动物组织［9- 11］等食品中青霉素 G 残留检测的 报道较多。青霉素 G 是通过生物发酵过程制得， 其 生产废水含有大量的有机污染物 如培养基剩余物、 结构类似物和代谢中间产物等 ， 组成复杂且干扰测 定。本试验拟建立一种利用固相萃取 － 高分离度快 速液相色谱 － 串联质谱 SPE-RRLC-MS/MS 测定制 药废水中青霉素 G 残留的方法。 1试验部分 1. 1仪器与试剂 Agilent 1200 － 6410LCMS/MS 高分离度快速液 相色谱三重四级杆串 联质 谱仪 美 国 Agilent 公 司 ; 固相萃取装置 美国 Agilent 公司 ， Oasis HLB 固相萃取柱 6cc/500 mg， 美国 Waters 公司 ; 旋涡混 合器 德国 IKA 公司 。 青霉素 G 标准品 德国 Dr． Ehrenstorfer 公司 ; 甲醇和乙腈为色谱纯 美国 Thermo Fisher 公司 ， 其 余试剂为分析纯; 试验用水为 Mili-Q 纯水器 美国 Millipore 公司 制得。 1. 2仪器条件 色谱 柱 Agilent Plus C18 150 mm 2. 1 mm， 3. 5 μm 。流动相 A 相为 0. 01mol/L 乙酸铵 溶液 加 0. 1 甲 酸 ， B 相 为 乙 腈。等 度 洗 脱 30 B 相 70 A 相， 流速 0. 3 mL/min， 进样量为 10 μL。 柱温为 35 ℃ 。 电离模式 电喷雾离子源正离子模式 ESI ; 监测方式 多反应监测 MRM ; 干燥气温度 350 ℃ ; 干燥气流速 12 L/min; 毛细管电压 4 000 V; EMV 电 压 600 V。 1. 3试验方法 水样采集于 1 L 棕色瓶中， 置于 4℃ 冰箱密封保 存， 采样后 48 h 内完成测定。取 500 mL 制药废水加 入适 当 的 蛋 白 沉 淀 剂 混 匀， 10 000 r/min 下 离 心 5 min， 取上清液转移到经 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化 的 Oasis HLB 固相萃取柱， 控制流速 5 mL/min， 萃取 结束后用 5 mL 纯水淋洗萃取柱， 负压下抽干 10 min， 再用 5 mL 乙腈洗脱， 洗脱液在 35 ℃ 下经氮气吹至近 干， 残余物用乙腈溶解定容至 1. 0 mL， 经 0. 22 μm 滤 膜过滤后， 供 RRLC-MS/MS 测定。 2结果与讨论 2. 1质谱条件选择 据文献报道采用液相色谱 － 串联质谱法测定青 霉素 G 时离子源多用 ESI 源 ［12］， 因此本文亦选 用 ESI 源作为离子源。青霉素 G 在质谱中主要 的离子加合峰有［M Na］和［M H］两种方式， 而［ M Na］方式的离子化效率会随着离子源洁净 程度等因素发生很大变化， 因此对复杂基质样品的青 霉素 G 测定不适宜采用这种方式。试验选择［M H］离子为母离子并在流动相中加入 0. 01 mol/L 乙 酸铵抑制［ M Na］的出现。将青霉素 G 的标准工 作液直接进样， 进行全扫描， 找出准确的［M H］的 分子离子峰， 然后对其进行轰击以获得二次碎裂产生 的子离子。将母离子和两个信号强度适宜的子离子 组成监测离子对， 以 MRM 模式进行检测， 在此基础 上重点优化了对灵敏度影响较大的裂解电压和碰撞 能， 使选定的母离子和子离子组成的特征离子的丰度 和比例达到最佳， 优化后的质谱参数见表 1。 表 1青霉素 G 质谱优化参数 药物 名称 定性离子 对 m/z 定量离子 对 m/z 裂解电 压 /V 碰撞 能 /V 青霉素 G 335 /176 335 /160 335 /160100 10 15 2. 2色谱条件选择 文献［ 13］表明， 流动相中甲酸的添加对青霉素 G 的分析有着重要的作用。试验设计了 0. 01 mol/L 乙酸 铵 溶 液 甲 醇、 0. 01 mol/L 乙 酸 铵 溶 液 加 0. 1 甲 酸 甲 醇、 0. 01 mol/L 乙 酸 铵 溶 液 加 0. 1 甲酸 乙腈 3 种有代表性的流动相组合。采 用浓度为 500 μg/L 的标准物质， 进样量 10 μL， 进行 3 次平行试验， 比较 3 种流动相组合的分离效果， 试 验结果见图 1。结果表明 若流动相中不添加甲酸， 青霉素 G 的色谱峰出现严重的拖尾现象， 而添加一 定量甲酸后， 色谱峰的峰型得到显著改善。本试验选 用具有较高的响应值的 0. 01 mol/L 乙酸铵溶液 加 0. 1 甲酸 乙腈为流动相。 2. 3样品前处理条件选择 青霉素 G 生产废水中含有一定的蛋白质， 容易 631 环境工程 2013 年 6 月第 31 卷第 3 期 图 1500 μg/L 青霉素 G 标准物质的总离子流 造成固相萃取柱阻塞， 干扰试验结果， 测定前需对其 进行净化。在阴性样品加标 5. 0 μg/L 水平下， 进行 3 次平行试验， 考察了 30 硫酸锌 20 亚铁氰化钾 溶液、 10 三氯乙酸溶液和 10 醋酸铅溶液 3 种蛋 白沉淀剂的净化效果。结果表明 添加 3 种蛋白沉淀 剂后， 青霉素 G 平均回收率分别为 89. 3 、 77. 3 和 62. 5 ， 最终选择 30 硫酸锌 20 亚铁氰化钾作 为蛋白沉淀剂。 制药废水基质复杂， 需要进行富集和净化。试验 研究 了 Oasis HLB 柱 6cc/500mg 、 Sep-Pak C18柱 6cc/500mg和 Cleanert PEP 柱 6cc/500mg三 种 SPE 净化柱对其净化和富集效果。阴性样品中青霉 素 G 添加水平为 5. 0 μg/L， 经固相萃取柱富集和净 化后供液相色谱串联质谱仪测定， 进行 3 次平行试 验， 结果表明， 3 种固相萃取柱对青霉素 G 的平均回 收率 分 别 为 91. 9 、 48. 4 和 78. 9 ， 最 终 选 择 Oasis HLB 固相萃取柱进行青霉素 G 的富集和净化。 以 Oasis HLB 为固相萃取柱， 比较了乙腈、 乙酸 乙酯和丙酮 3 种常用的洗脱溶剂对青霉素 G 的洗脱 效果。阴性样品中青霉素 G 添加水平为 5. 0 μg/L， 洗脱剂体积均为 5 mL， 进行 3 次平行试验。结果表 明， 乙腈、 乙酸乙酯和丙酮对青霉素 G 的平均回收率 分别为 93. 4 、 76. 5 和 69. 0 ， 故选用乙腈作为洗 脱剂。洗脱体积的大小直接影响洗脱液氮吹至近干 的时间长短， 因此试验还考察了采用不同体积的乙腈 洗脱对回收率的影响， 结果表明 5 mL 乙腈就可以将 青霉素 G 完全洗脱。 当试样中添加水平低于 1. 0 μg/L 时， 回收率明 显下降， 考虑在低浓度时青霉素 G 可能在水中呈现 的离子态不利于 Oasis HLB 吸附， 因此通过调节 pH 值使青霉素 G 处于分子状态。试验在阴性样品加标 1. 0 μg/L 水平下， 考察了 pH 值对回收率的影响， 结 果表明 pH 8. 50 时， 青霉素 G 回收率可达 90 以 上。为保证试样 pH 值能稳定保持在该水平， 加入缓 冲盐磷酸二氢钠 1. 80 g/100 mL ， 并用盐酸或氢氧 化钠调节 pH 至 8. 50 0. 05。 2. 4方法学验证 采用在阴性样品中添加目标化合物的方法， 得到 本方法的青霉素 G 检出限 S/N 3 为 0. 02 μg/L， 线性范 围 为 0. 0020 ～ 1. 0 mg/L， 线 性 相 关 系 数 为 0. 9997， 详见表 2。 表 2线性方程、 相关系数、 检出限、 回收率和精密度 n 7 线性方程 线性相关 系数 R2 检出限 / μgL －1 回收率 相对标准偏差 / 0. 20 μg/L 1. 0 μg/L2. 0 μg/L y 461. 742x0. 99970. 0274.6 8.17 98.5 5.86 101.4 4.49 用阴性样品做添加回收和精密度试验， 样品中添 加 0. 20， 1. 0， 2. 0 μg/L 3 个浓度水平后， 按上述方法 测定， 进行 7 次平行试验， 结果表明 青霉素 G 平均回 收率为 74. 6 ～ 101. 4 ， 相对标准偏差为 4. 49 ～ 8. 17 ， 说明方法定性定量准确， 重现性好。方法的 添加回收率和精密度详见表 2。 2. 5实际样品测定 利用建立的检测方法对某制药企业青霉素 G 生 产废水处理站的各处理单元水样中青霉素 G 残留量 进行了检测， 结果见表 3。 表 3实际制药废水样品中青霉素 G 残留检测结果 μg/L 处理单元综合废水 缺氧池出水 一级好氧池 出水 二级好氧池 出水 深度处理 出水 水样 139742. 500 10569. 700 3996. 815149. 2261. 501 水样 245613. 500 10389. 200 2473. 900139. 3351. 387 水样 335663. 6009643. 210 2365. 821126. 5251. 016 从表 3 可以看出 生产废水中青霉素 G 残留量 受车间排水状况影响较大， 与企业排水实际情况基本 相符; 生产废水采用“缺氧 一级好氧 二级好氧 深度处理” 工艺处理后， 废水中残留的青霉素 G 得到 了有效去除， 各处理单元出水青霉素 G 残留与处理 工艺具有良好的一致性， 说明建立的方法可实现对制 药废水中青霉素 G 残留的有效检测。但深度处理出 水中尚有少量青霉素 G 残留， 排入环境存在潜在的 环境风险， 需要加强废水深度处理力度。 3结论 建立了利用固相萃取 － 高分离度快速液相色 谱 － 串联质谱 SPE-RRLC-MS/MS 测定制药废水中 青霉素 G 残留的方法。样品经沉淀蛋白质后， 利用 Oasis HLB 固相萃取柱富集和净化， 通过 Agilent Plus 731 环境工程 2013 年 6 月第 31 卷第 3 期 C18柱进行 RRLC 分离， 采用电喷雾离子源正离子模 式， 以［M H］离 子为母离子， 进行多 反 应 监 测 MRM 。通过实际水样测定， 该方法灵敏度高、 重现 性好、 定性定量准确、 加标回收率高， 可满足制药废水 中青霉素 G 残留检测的要求。 参考文献 ［1］Elander R P． Industrial production of β-lactam antibiotics ［J］． Applied Microbiology Biotechnology，2003，61 56 385- 392． ［2］Klaus K．Antibiotics in the aquatic environment-a review-part I ［J］． Chemosphere，2009，75 4 417- 434． ［3］Joakim Larsson D G，Ceciliade D P，Nicklas P． Effluent from drug manufactures contains extremely high levels of pharmaceuticals ［J］． Journal of Hazardous Materials，2007，148 3 751- 755． ［4］Francisco J L，Monsalud O，Carmen C B，et al． Advances in the determination of β-lactam antibiotics by liquid chromatography ［J］． Trends in Analytical Chemistry，2012，3852- 66． ［5］Lina K，Marinella F，Dami B． Analytical ologies for the detection of β-lactam antibiotics in milk and feed samples ［J］． Trends in Analytical Chemistry，2009，28 6 729- 744． ［6］Junza A，Amatya R，Barrn D，et al． Comparative study of the LC-MS/MS and UPLC-MS/MS for the multi-residue analysis of quinolones，penicillins andcephalosporins incowmilk， and validation according to the regulation 2002 /657 /EC ［J］． Journal of Chromatography B，2011，879 25 2601- 2610． ［7］Kantiani L，Farr M，Sibum M． Fully automated analysis of β- lactams in bovine milk by online solid phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandemmassspectrometry［ J］． Analytical Chemistry，2009，81 11 4285- 4295． ［8］Yves-Alexis H，Rayane M，Eric G． Multi-screening approach to monitor and quantify 42 antibiotic residues in honey by liquid chromatography-tandemmassspectrometry ［J］．Journalof Chromatography A，2008，1177 14 58- 76． ［9］KaterinaM， AlanRL．Streamliningologyforthe multiresidue analysis of β-lactam antibiotics in bovine kidney using liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2008，1202 2 118- 123． ［ 10］GranelliK， BranzellC．Rapidmulti-residuescreeningof antibiotics inmuscleandkidneybyliquidchromatography- electrospray ionization-tandem mass spectrometry ［J］．Analytica Chimica Acta，2007，586 12 289- 295． ［ 11］Granelli K，Elgerud C，Ohlsson A，et al．Rapid multi-residue analysis of antibiotics in muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］． Analytica Chimica Acta， 2009， 637 12 87- 91． ［ 12］Petrovic M， Hernando M D， Diaz-Cruz M S， et al．Liquid chromatography-tandemmassspectrometryfortheanalysisof pharmaceutical residues in environmental samples-a review ［J］． Journal of Chromatography A，2005，1067 12 1- 14． ［ 13］Sara C，Renzo B，Davide C，et al．A multiresidue analytical usingsolid-phaseextractionandhigh-pressureliquid chromatographytandemmassspectrometrytomeasure pharmaceuticalsofdifferenttherapeuticclassesinurban wastewaters［J］． Journal of Chromatography A，2005，1092 2 206- 215． 作者通信处李再兴050018河北科技大学环境科学与工程学院 石家庄市裕华东路 70 号 E- mailli_zaixing 163． com 2012 － 08 － 27 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 收稿 上接第 112 页 生物反应器， 其主要特点为 在工艺上符合好氧发酵 的条件， 在功用上满足处理生活垃圾使资源回收利用 的要求; 生活垃圾经由进料斗进入螺旋进料装置进而 通过螺带的导向进入筒体内进行好氧发酵; 筒体内抄 板的设计有助于垃圾充分混合并增强垃圾与空气的 接触， 使好氧微生物大量繁殖， 促进发酵。该装置已 加工完成， 实际效果有待现场试验验证。 参考文献 ［1］刘文海， 李秀金． 粉煤灰、 炉渣提高生物反应器垃圾处理性能研 究 ［J］． 环境工程， 2011， 29 5 113- 116． ［2］李东风． 大连城镇生活垃圾调查及生物预处理特性研究［D］． 大连 大连理工大学， 2008． ［3］罗金华． 卧式螺旋式污泥好氧动态堆肥装置试验研究［D］． 重 庆 重庆大学， 2004． ［4］刘文海， 李秀金． 粉煤灰、 炉渣提高生物反应器垃圾处理性能研 究［J］． 环境工程， 2011， 29 5 113- 116． ［5］Zhu Baoning ， Li Xiujin． uation of the rotary drum reactor process asmunicipalsolidwastepretreatmenttechnologyfor biomass utilization ［C］/ /International Conference on Biomass Energy Technologies，Guangzhou， 2008 3- 5． ［6］HG /T 205662011 化工回转窑设计规定［S］． 作者通信处王奎升100029北京市北三环东路 15 号北京化工大 学机电学院 电话 010 64418684 E- mailkuishengw 163． com 2012 － 08 － 02 收稿 831 环境工程 2013 年 6 月第 31 卷第 3 期