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焦化废水中高效 ＲhodococcusP1 菌株的降酚特性研究 * 蒙小俊张玉秀 中国矿业大学 北京化学与环境工程学院， 北京 100083 摘要 通过研究分离鉴定的 Ｒhodococcus P1 菌株的苯酚降解性能， 表明 P1 菌株 24 h 内可完全降解低于 907 mg/L 的苯 酚。苯酚羟化酶基因克隆表达和酶活测定分析表明 P1 菌株的苯酚代谢途径通过邻苯二酚 1， 2 双加氧酶催化开环降 解。除降解苯酚外，P1 菌株可利用吡啶作为唯一的碳源和能源。 关键词 苯酚; Ｒhodococcus; 降解特性; 焦化废水 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201403013 CHAＲACTEＲIZATION OF HIGH EFFICIENCY PHENOL- DEGＲADING STＲAIN ＲHODOCOCCUS P1 FOＲ COKING WASTEWATEＲ Meng XiaojunZhang Yuxiu School of Chemical and Environmental Engineering，China University of Mining ＆ Technology Beijing ，Beijing 100083，China AbstractThe phenol- degrading characteristic of Ｒhodococcus P1 was uated，it indicated that less than 907 mg/L of phenol was completely degraded by Ｒhodococcus P1 strain within 24 h． Phenol hydroxylase gene expression and enzyme activity analysis showed that the degradation of phenol was catalyzed by catechol1， 2 2dioxygenase． In addition，pyridine can be used as the sole carbon and energy source of Ｒhodococcus P1． Keywordsphenol;Ｒhodococcus;degradation characteristics;coking wastewater * 国家 “863 计划” 2009AA06Z320， 2006AA10Z407 ; 中央高校基本科 研业务费专项资金 2010YH05 ; 中国矿业大学 北京 教学建设项目 t120301 。 收稿日期 2013 －05 －23 0引言 苯酚是炼焦、 造纸、 石油、 塑料、 纺织、 制药等工业 废水中的主要污染物［1 ］， 炼焦产生的废水是一种典 型的高浓度难降解有毒工业有机废水， 苯酚类及其衍 生物是焦化废水中含量最高的有机污染物， 占焦化废 水中总有机物的质量百分比高达 60 以上 ［2 ］， 苯酚 类及其衍生物的降解是焦化废水 COD 是否达标排放 的关键。由于生物处理法具有经济、 安全、 高效和无 二次污染等显著优点， 使微生物技术处理苯酚污染物 成为当今污染治理的重要途径和研究方向［3 ］。选育 专性高效降解微生物、 优化复配菌种、 构建降解多种 有机污染物的功能菌群、 提高微生物的活性、 形成生 物强化污水处理集成技术是提高微生物降解的关 键 ［4 ］。红球菌和假单胞菌被认为是最具生物降解能 力的多功能菌株， 由于位于线型质粒和环状质粒上大 量的降解基因的存在， 使得红球菌能够适应各种各样 的底物环境， 有效的降解许多的有机污染物， 甚至是 一些具有毒性的难降解复杂有机污染物［5 ］。国内外 研究者已经分离出多株红球菌， 如从某制酒企业污水 样品 中 分 离 筛 选 到 好 氧 降 解 高 粱 白 酒 废 水 的 Ｒhodococcus LM1 菌株 ［6 ］， 从红树林底泥中分离出高 效降解对硝基苯酚与邻硝基苯酚的 Ｒhodococcus sp． Ns 菌株 ［7 ］，从腐烂的树木枯枝和污染的淤泥中分离 出降解苯酚的 Ｒhodococcus sp． SD3 菌株 ［8 ］，从农药 厂废水处理池的活性污泥中分离到 1 株能降解氟铃 脲的 Ｒhodococcus FLN21 菌株 ［9 ］，从土壤中分离得到 降解多菌灵的 Ｒhodococcus sp． 167- 4 菌株 ［10 ］， 从皮革 废水中分离的可降解苯酚的 Ｒhodococcus sp． CS1 菌 株 ［11 ］。本课题研究了从焦化废水活性污泥中分离出 的 Ｒhodococcus P1 菌株的酚降解性能， 旨在为强化生 物除酚技术和膜 － 生物反应器的设计提供技术支持， 为生物新技术基因工程构建高效降酚菌株提供菌源 35 水污染防治 Water Pollution Control 和基础理论。 1实验部分 1. 1材料和试剂 4- 氨基安替比林、 苯酚、 氨水、 氯化铵、 铁氰化钾、 KH2PO4、K2HPO4、NH4NO3、NaCl、NaOH、FeSO4 7H2O、 HCl、 NiCl26H2O、 ZnCl2、 CaCl2、 Pb NO3 2、 MgSO4、 MnSO4 H2O、 MnCl2 4H2O、 CdCl2、 CuCl2 试剂 均为分析纯 ; 气浴摇床、 台式高速冷冻离心机、 立式 压力蒸汽灭菌器、 7200 型分光光度计、 紫外可见分光 光度计、 PCＲ System 9700 Gene Amp 、PB- 10 型精密 pH 计、 细胞破碎仪、 制冰机。 无机盐培养基 KH2PO40. 5 g， K2HPO40. 5 g， NH4NO31. 0 g， MgSO40. 2 g， CaCl20. 2 g， FeSO4 7H2O 0. 01 g， MnSO4H2O 0. 01 g， 加蒸馏水定容至 1 L， 用 2 mol/L NaOH 或 0. 5 mol/L HCl 调节 pH 7. 0 ～9. 0， 121 ℃高压灭菌 20 min， 苯酚根据需要量加入。 菌株来源 本实验室从焦化废水活性污泥中分离， 经鉴定为 Ｒhodococcus sp． accession number JN984129 ， 命名为 P1。 1. 2测定项目和方法 不同酚浓度对 Ｒhodococcus P1 菌株降酚效率的 影响 将菌株从含 1 000 mg/L 苯酚的液体无机盐培 养基中按 5 的接种量接种到苯酚浓度为 600 mg/L 培养基中， 37℃、 180 r/min 振荡培养 12 h 活化菌株， 再按 5 的接种量接种到无机盐液体培养基中， 37 ℃、 180 r/min 振荡培养 12 h， 离心分离菌体， 用等 体积的无机盐洗涤两次， 重新悬浮于无机盐培养基 OD6001. 0 中。以 5 的量接种于不同初始苯酚浓 度的无机盐培养基中， 37 ℃、 180 r/min 振荡培养。 定时取样， 采用 4- 氨基安替比林法测定苯酚浓度［12 ］， 实验重复 3 次， 结果取其平均值。实验同时分别设未 加菌的灭菌培养基在同等条件下作为空白对照。 Ｒhodococcus P1 菌株苯酚羟化酶基因克隆表达 苯酚羟化酶基因扩增引物［13 ］5- CGCCAGAACCAT TTATCGATC- 3; 5- AGGCATCAAGATCACCGACTG- 3， 50 μL 反应体系 10* PCＲ Buffer 含 Mg2 5 μL; 10 mmol/L dNTPmix 0.25 μL; Primer forward 45 pmol/ μl0. 5 μL; Primer reverse 45 pmol/μl 0. 5 μL; Tap 酶 2. 5 U/μl 0. 5 μL; DNA 模板1 μL; 灭菌去离子水 42. 25 μL。PCＲ 反 应 条 件 如 下 预 变 性 95 ℃， 10 min， 变性 95 ℃， 15 s， 退火 60 ℃， 30 s， 延伸 72 ℃， 30 s， 30 个循环。 Ｒhodococcus P1 菌株降酚酶活测定 将菌株接入 以 600 mg/L 苯酚为唯一碳源的液体培养基中， 37 ℃、 180 r/min振荡培养达到对数生长期， 培养液在 4 ℃下 12 000 r/min 离心 10 min， 回收菌体。菌体以 50 mmol/L 的 Tris- HCI 缓冲溶液 pH 8. 0 洗涤 3 次， 然后用该缓冲液重悬， 置于 0 ℃的冰 － 水混合水 浴中， 用超声波破碎仪破碎细胞。破碎条件如下 破 碎功率为400 W， 破碎 3 次， 每次破碎 10 s， 中间间隔 10 s。破碎后的液体经 4 ℃、 12 000 r/min 离心 10 min， 上清液作为粗酶液用于胞内酶活的测定。酶 活力 U 的单位定义为反应条件下每分钟催化生成 1 μmol 产物所需的酶量。邻苯二酚 1， 2 双加氧酶 Catechol 1， 2- dioxygenase， C12O 的活力以在单位时 间内反应产物粘康酸在 260 nm 处吸光度表示。邻苯 二酚2， 3 双加氧酶 Catechol 2， 3- dioxygenase， C23O 活 力以单位时间反应生成的2- 羟基粘康酸半醛在375 nm 处的光吸收值表示 ［ 14 ］。粘康酸的摩尔消光系数 ε 16/ mmol cm ， 2- 羟基己二烯半醛酸的摩尔消光系数 ε 12/ mmol cm 。蛋白浓度测定采用 Bradford 法 ［ 15 ］。 Ｒhodococcus P1 菌株对其他芳香族化合物的降 解 吡啶、 苯胺、 喹啉或邻甲酚等是焦化废水中的难降 解有机物， 为探索 P1 菌株对不同有机污染物的降解 能力， 将 菌 株 以 5 的 接 种 量 分 别 接 种 于 含 有 200 mg/L的吡啶、 喹啉、 苯胺或邻甲酚等的无机盐培 养基中， 180 r/min、 37 ℃ 震荡培养， 定时取样， 分析 OD600和有机物降解情况。 2结果与分析 2. 1苯酚浓度对 Ｒhodococcus P1 菌株降酚效率的影响 为了研究不同初始苯酚浓度对 P1 菌株苯酚降解 效率的影响， 设置 270 ～1 160 mg/L 苯酚初始浓度梯 度， 由图 1 分析表明 随着苯酚浓度 275 ～1 162 mg/L 的提高， P1 菌株降解苯酚所需时间不同， 除 1 162 mg/ L 苯酚初始浓度外， 低于 907 mg/L 苯酚浓度 24 h 内 均被完全降解， 不大于 575 mg/L 苯酚浓度 16 h 内均 被完全降解， 然而完全降解 1 162 mg/L 苯酚浓度需 要 58 h。低浓度苯酚可以促进 P1 菌株的苯酚降解， 而高 浓 度 的 苯 酚 则 抑 制 其 苯 酚 降 解 能 力。 Gulosibacter sp． 完全降解 800 mg/L 苯酚需要 28 h， 但 76 h 内可完全降解 2 000 mg/L 苯酚 ［16 ］， 而洋葱伯克 霍尔德菌 PW3 和铜绿假单胞菌 AT2 在 1 000 mg/L 苯酚延滞期达 5 d 以上 ［17 ］， Ｒhodococcus sp． SD3 菌株 在 72 h 内可将浓度为 1. 0 g/L 的苯酚完全降解 ［8 ］， 45 环境工程 Environmental Engineering Ｒhodococcus sp． JFJ2 菌完全降解初始浓度 800 mg/L 的苯酚需要 72 h ［18 ］， 布鲁氏芽孢杆菌 GXY- 1 降解初 始浓度为 600 mg/L 的苯酚需要 60 h［19 ］， Ｒhodococcus sp． P1 菌株的耐酚能力不及 Gulosibacter sp． ， 但降酚 效率均高于洋葱伯克霍尔德菌 PW3、 铜绿假单胞菌 AT2， Ｒhodococcus sp． SD3、 Ｒhodococcus sp． JFJ2 和布 鲁氏芽孢杆菌 GXY- 1。 图 1不同初始苯酚浓度对 P1 菌株苯酚降解的影响 Fig．1Biodegradation of phenol of the strain P1 with different phenol concentrations 2. 2Ｒhodococcus P1 菌株苯酚羟化酶基因克隆表达 采用苯酚羟化酶扩增引物对菌株 P1 总 DNA 进 行 PCＲ 扩增， 结果发现引物有明显的扩增产物， 对扩 增的苯酚羟化酶基因片段测序， 结果如下 P1 菌株苯酚羟化酶基因片段测序 GGACAAGTG GGAAGACCCGTTCCGCCTGACCATGGACGCCTACTGG AAGTACCAGGCCGAAAAAGAGAAGAAGCTGTACGCC ATCTTCGATGCCTTCGCCCAGAACAACGGCCACCAGA ACATCTCTGACGCCCGCTACGTGAACGCCCTGAAACT GTTCCTGAGCGGCGTCACCCCGCTGGAGTACCAGGCC TACCAGGGCTTCGCCCGTGTCGGCCGGCACTTTGGTGG CGCCGGCGCACGGGTGGCCTGCCAGATGCAGGCCATC GACGAGTTGCGCCACGTGCAGACCCAGGTGCACGCCA TGAGCCACTACAACAAGCACTTCAACGGCCTGCATGA CTTCGCCCACATGCACGATCGGGTGTGGTTCCTGTCGG CGCCCAAGTCGTTCTTCGAAGATGCGCGCACAGCCGG CCCGTTCGAGTTCCTCACCGCAATTTCGTTCTCGTTCG AGTACGTGCTGACCAACCTGTTGTTCGTGCCGTTCAT GTCGGGTGCCGCGTTCAGCGGTGACATGGCCACGGT CACCTTCGGCTTCTCGGCGCAGTCCGACGAAGCCCG GCACATGACCCTGGGCCTGGAGGTGATCAAGTTCCT GCTGGAGCAACACGAGGACAACGTGCCCATCGTGCA GCGCTG。 2. 3Ｒhodococcus P1 菌株降酚酶活测定 在有氧情况下， 苯酚首先被苯酚羟化酶转化为邻 苯二酚， 再由邻苯二酚2， 3- 双加氧酶或1， 2- 双加氧酶 开环裂解， 裂解产物进入三羧酸循环 ［20 ］。P1 菌株 C12O 酶活为 0. 343 表 1 ， 未检测到 C23O 酶活， 说 明 P1 的苯酚代谢途径为 1， 2- 双加氧酶开环裂解。 表 1 P1 菌株酶活 Table 1P1 strain enzyme activityU/mg 编号260 nm375 nm P10. 3430 2. 4Ｒhodococcus P1 菌株对其他芳香族化合物的降解 吡啶、 苯胺、 喹啉或邻甲酚等是焦化废水中所含 的难降解有机物， 为探索 P1 菌株对不同有机污染物 的降解能力， 将菌株分别接入到含有 200 mg/L 的吡 啶、 苯胺、 喹啉或邻甲酚等的无机盐培养基中， 试验结 果如表 2 所示。结果表明 红球菌 P1 菌株可降解吡 啶， 而不能以邻甲酚、 苯胺或喹啉为唯一的碳源和能 源 “ ” 表示肯定 ， “－ ” 表示否定 。深入研究 P1 菌株对难降解有机物的降解作用， 可为 P1 菌株处理 焦化废水提供更全面和更深入的技术支持。 表 2P1 菌株在其他芳香族化合物中的生长及其降解情况 Table 2Biodegradation of aromatic compounds and growth of strain P1 化合物/ 200 mgL －1 生长降解 吡啶 苯胺－－ 喹啉－－ 邻甲酚－－ 3结论 1Ｒhodococcus P1 在 20 h 内可完全降解 600 ～ 800 mg/L 苯酚， 24 h 内可完全降解 907 mg/L 苯酚， 58 h 完全降解 1 162 mg/L 苯酚， 表明 Ｒhodococcus P1 是一株高效降酚菌株， 具有处理焦化废水的潜力。 2利用引物对 Ｒhodococcus P1 菌株进行苯酚羟 化酶基因克隆表达， 得到明显的扩增产物。检测到 P1 菌株具有 C12O 酶活， 未检测到 C23O 酶活， 说明 P1 菌株降解苯酚的代谢途径先在苯酚羟化酶的作用 下将苯酚转化成邻苯二酚， 然后在邻苯二酚 1， 2 加氧 酶 C12O 途径 的作用下将邻苯二酚开环裂解。 参考文献 ［1］Ｒamos A F， Gmez M A， Hontoria 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