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CANON 工艺快速启动和运行过程中 anammox 群落变化研究 * 黄京1徐亚慧1张亮2刘新春1李娟1张树军2 1. 中国科学院大学, 北京 100049; 2. 北京市排水集团有限公司, 北京 100022 摘要 利用连续搅拌小试反应器 CSTR , 进行颗粒污泥 CANON 工艺快速启动的条件探索。对反应器启动和运行过 程中进出水水质进行连续监测, 同时利用分子生物学技术对反应器启动运行过程中的厌氧氨氧化菌 anammox 进行 了群落多样性分析及演变追踪研究。结果表明 由于溶解氧不易控制、 污泥流失, 接种颗粒污泥的 CSTR 反应器运行 过程中稳定性较差, 系统脱氮效率约为55, 微生物多样性较低, 但运行过程中厌氧氨氧化菌群落结构变化较为明显。 关键词 厌氧氨氧化; 颗粒污泥; CANON 工艺; CSTR 反应器; 群落结构 DOI 10. 13205/j. hjgc. 201412009 RESEARCH ON CHANGE IN ANOMMOX COMMUNITY DURING RAPID START- UP AND RUNNING OF CANON SYSTEM BY CSTR REACTOR Huang Jing1Xu Yahui1Zhang Liang2Liu Xinchun1Li Juan1Zhang Shujun2 1. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 2. Beijing Drainage Group Co. ,Ltd,Beijing 100022,China AbstractThe CSTR reactor was used to explore the conditions of fast start- up of CANON process of granular sludge. and output of the water quality,and operating conditions were monitored continuously. Meanwhile,molecular biotechnology was used to study the diversity and evolution of the anammox community. The research results showed that the operation process of the CSTR reactor of inoculated granular sludge had a poor stability due to difficult control of DO, and loss of sludge; the denitrification efficiency was about 55;microbial diversity maintained at a low level. In this process,the anammox community structure changed significantly. Keywordsanammox;granular sludge;CANON system;CSTR reactor;community * 国家自然科学基金 51378485, 50978250 ; 中科院知识创新工程重要 方向项目 Y225018EA2 。 收稿日期 2014 -02 -28 0引言 水体中氨氮作为水体富营养化的重要因素, 已在 十二五期间成为污染物总量控制的约束性指标。目 前, 污水处理厂中应用的传统脱氮工艺具有运行稳 定、 脱氮效率高等诸多优点, 但同时也存在明显不足, 如脱氮流程较长、 占地面积较大, 运行费用及能耗较 高等, 使得生物脱氮新工艺的探索研究仍然需要进一 步加强。 厌氧氨氧化是一个厌氧的生物脱氮过程, 能够同 时将氨氮和亚硝态氮按照式 1 转化为氮气, 并生成 部分硝酸盐氮 [1 ]。 NH 4 1. 32NO- 2 0. 066HCO- 3 0. 13H→1. 02N2 0. 26NO- 3 0. 066CH2O0. 5N0. 15 2. 03H2O 1 2002 年, 荷兰 Delft 工业大学学者根据厌氧氨氧 化 ANAMMOX 提出了一体化完全自养脱氮的新型 工 艺 CANON completely autotrophic ammonium removal over nitrite 工艺 [2 ]。 由于该工艺的两种功能细菌氨氧化菌和厌氧氨 氧化菌均为化能自养菌, 且在限制溶解氧条件下可共 存, 故与传统生物脱氮工艺相比, 具有无需外加有机 碳源、 曝气量小、 节约能耗、 单一反应器节省占地面积 等突出优点, 尤其适合处理高氨氮、 低 C/N 的有机 废水。 63 环境工程 Environmental Engineering 目前有关一体化完全自养脱氮系统成功的报道, 多是以多孔塑料填料或生物转盘作为微生物富集的 载体, 如海绵、 火山岩等 [3 ], 而采用颗粒污泥作为生 物膜载体的还较少。与传统生物膜相比, 颗粒污泥构 成的生物膜体系具有结构致密、 内部和表面均有孔 隙、 比表面积大等特点, 培养良好的颗粒污泥不仅能 够增加细菌与水中污染物的接触面积, 同时内部的孔 隙也可作为基质传送和气体运输的通道[4 ], 有助于 脱氮效率的提高。细菌形成颗粒状的聚集体, 是一个 微生态系统, 不同类型的种群组成了共生或互生体 系, 有利于形成细菌生长的生理生化条件, 对减少出 水中游离细菌数目, 提高出水水质起着重要的作用。 同时, 由于颗粒污泥的密度与水接近, 可在反应器内 均匀分布。因此采用颗粒污泥为微生物膜载体, 是解 决反应器快速启动并稳定运行的有效途径之一[5 ]。 厌氧氨氧化细菌生长缓慢 倍增时间长达 11 d , 活性易受溶解氧和亚硝酸盐浓度抑制, 较难培养, 颗 粒污泥的培养所需时间更长。要建立一体化的颗粒 污泥厌氧氨氧化反应器, 必须首先解决厌氧氨氧化菌 的持留和增殖问题, 了解启动过程中菌群的动态变 化, 以便采取适当措施促进厌氧氨氧化菌的生长, 提 高反应器的效能。本文通过对颗粒污泥 CSTR 反应 器启动过程及其微生物优势种群演变过程的追踪研 究, 评估工艺条件对反应器内微生物多样性和优势种 群的影响, 为新一代厌氧氨氧化反应器的设计和运行 提供参考依据。 1实验部分 1. 1实验装置 实验所用的反应器由有机玻璃制成, 总容积为 20 L, 以黑布包裹, 其结构如图 1 所示。反应器与一 个蓄水池相连, 通过蠕动泵实现人工配水的连续进 入, 底部装有曝气装置, 曝气量由气泵控制, 曝气孔均 匀分布, 以实现反应器内物料的均匀混合。反应器内 设有污泥沉降区, 通过挡板和铁丝网与反应器主体隔 开, 以期实现对颗粒污泥的有效截留, 降低出水悬浮 物浓度的同时, 最大程度地保持反应器内的生物量。 1. 2反应器的启动与运行 CANON 工艺连续搅拌颗粒污泥反应器采用好氧 启动, 接种硝化污泥, 进水为城市污水处理厂二沉池 出水添加氨氮配制而成的人工废水, 进水总氮浓度为 480 mg/L 左右。运行至第 3 天时, 接种厌氧颗粒污 泥作为反应器内厌氧氨氧化菌的附着载体, 并逐步降 图 1 CSTR 反应器 Fig.1Schematic diagram of the CSTR reactor 低溶解氧浓度, 形成好氧厌氧微生物共同生长所需的 微好氧条件; 第 24 天时, 接种厌氧氨氧化菌种泥运行 温度维持在 30 ℃左右, pH 为 7. 8 ~8. 2, 溶解氧维持 在 0. 5 mg/L 以下。经过 70 d 的运行, 反应器的启动 探索 研 究 初 步 完 成。对 接 种 的 厌 氧 氨 氧 化 菌 anammox 种泥及反应器启动过程中的污泥进行取 样留种 见表 1 , 样品采集后在 -20 ℃下保存。 表 1 CSTR 小试反应器启动运行过程采样编号 Table 1Sample number of the CSTR reactor during start- up and operation process 时间/d 编号时间/d编号 3C133C5 10C238C6 24C358C7 29C467C8 1. 3水质监测与微生物群落结构分析方法 1. 3. 1反应器进出水水质 本实验中水质监测的参数及方法见表 2。 表 2CSTR 小试反应器进出水水质监测的参数及方法[6 ] Table 2Parameters and s of and output water quality of CSTR reactor 监测参数方法监测参数方法 氨氮纳氏试剂分光光度法溶解氧 DO 测定仪 德国 亚硝酸盐 N- 1- 萘基 - 乙二胺分 光光度法 温度pH 计探头 德国WTW 硝酸盐酚二磺酸分光光度法混合液悬浮 固体浓度 重量法 1. 3. 2基于 T- RFLP 方法的微生物多样性检测 将污泥样品按照 Fast DNA 提取试剂盒 MP Biomedicals, 美国 的说明提取总 DNA, 使用 PCR 仪 Bio- Rad, 美国 进行目的片段扩增, 扩增所用的反应 体系为 50 μL 10 buffer 缓冲液 5 μL, dNTPs 4 μL, 73 水污染防治 Water Pollution Control 前引物 1 μL, 后引物 1 μL, Taq 酶 0. 25 μL, BSA 0. 25 μL, 模板DNA 2 μL, 灭菌水加至50 μL 。引物为 27 f、 1 492 r, 并在前引物27 f 的5’ 端添加 FAM 荧光标 记。PCR 反应条件如下 [ 7 ] 94 ℃ 4 min→94 ℃ 30 s; 58 ℃ 45 s; 72 ℃ 1 min 30 s; 35 个循环→72 ℃ 10 min。 利用纯化试剂盒对 PCR 产物进行提纯, 选择 Rsal 限制性内切酶 [8 ]进行酶切, 混匀于 37 ℃下避光 酶切 7 h, 到达时间后 -20 ℃冷冻以停止酶切反应, 并交予生物公司进行测定 北京擎科公司 。 1. 3. 3克隆文库构建 使用引物 Amx 368 和 Amx 820 对样品 DNA 进行 扩增, 扩增条件94 ℃ 4 min→94 ℃ 1 min; 55 ℃ 45 s; 72 ℃ 1 min 30 s; 35 个循环→72 ℃ 10 min [9 ]。 使用纯化试剂盒 MBI Fementas, 加拿大 对 PCR 产物进行提纯, 将纯化后的产物连接到 PGEM- T Easy 载体 Promega, 荷兰 上, 4 ℃连接过夜。过夜后将连 接产物插入到感受态大肠杆菌, 通过蓝白斑筛选, 获 得重组质粒的菌株, 交由公司进行测序分析 北京美 吉生物技术公司 。 1. 3. 4qPCR 定量 本研究通过在反应体系中添加荧光染料, 在 PCR 退火和延伸阶段产生荧光物质, 根据对这些荧光物质 的特异性波长检测, 以实现对整个 PCR 进程的实时监 测, 最后通过标准曲线对未知浓度的模板 DNA 进行定 量分析。qPCR 的反应条件为 95 ℃ 30 s→95 ℃ 10 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 40 个循环→95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s。反应体系为 25 μL 2xSYBR Green Mixture 12. 5 μL; Amx 368 1 μL; Amx 820 1 μL; BSA 0. 5 μL; 模板 DNA 2 μL; 灭菌水8 μL 。 2结果与讨论 2. 1CANON 反应器启动 反应器进水为城市污水处理厂二沉池出水投加 氨氮配制而成的人工合成废水, 进水总氮在 480 mg/L 左右。污泥驯化过程可分为两个阶段 首先厌氧颗粒 污泥作为接种物和附着载体, 通过逐渐降低溶解氧进 行驯化; 其次在第 24 天, 再次接种 1. 25 L 厌氧氨氧 化颗粒污泥 [10 ]。较低浓度的溶解氧条件下启动, 亚 硝酸盐氧化菌的耐受性不如氨氧化菌, 氨氧化菌 AOB 活性较高, 反应器内的亚硝酸盐迅速积累, 而 厌氧颗粒污泥中的 anammox 由于氧浓度抑制和自身 生长缓慢等原因, 该时期反应器内厌氧氨氧化现象不 明显, 脱氮效率较低, 维持在 10左右。 反应器内溶解氧浓度的降低, 亚硝酸盐的积累, 均为 anammox 提供了较为理想的生存环境。在反应 器运行到第 24 天时接种少量来自稳定运行的厌氧氨 氧化颗粒污泥, 该污泥呈红色颗粒状, 含有丰富的 anammox。接种后部分原有灰色污泥表面变红, 呈现 出厌氧氨氧化污泥的特征, 驯化污泥快速转化脱氮性 能提高, 反应器很快便出现厌氧氨氧化的现象, 出水 氨氮和亚硝酸盐浓度显著降低, 产气明显。经过10 d 左右的运行, 反应器内总氮负荷在1. 04 kg/ m3d 时, 脱氮效率达 55。但随着反应器运行, DO 缺乏 有效的实时监控手段, 最终由于亚硝酸盐氧化菌的活 性增强, 与 anammox 竞争; 同时, 颗粒污泥沉降性能 下降, 污泥随出水大量流出, anammox 活性下降, 反应 器脱氮效率降到 34, 运行效果明显降低。 2. 2微生物多样性分析 利用 T- RFLP 技术对 CANON 连续流反应器启动 过程所取得 8 个污泥样品中微生物的种群多样性进 行了分析。将反应器启动及运行过程分为 3 个阶段 启动初期并投加颗粒污泥 阶段一 , 相对稳定阶段 阶段二 以及污泥流失阶段 阶段三 。 反应器启动过程中微生物演变剧烈, 各个阶段反 应器内微生物多样性变化较大。反应器启动初期即 第一阶段, 末端限制性片段为 11 个, 此时反应器内由 于正在形成厌氧氨氧化的环境, 微生物种类比较丰 富。但是随着氧浓度的降低、 亚硝酸盐的积累, 新加 入的 anammox 颗粒种泥在合适的环境下, 与驯化颗 粒污泥共同发挥作用。反应器启动过程逐渐趋于稳 定, 种群结构发生了变化, 厌氧氨氧化菌和氨氧化菌 逐渐成为优势菌种, 微生物多样性明显下降, 末端片 段数为 3 个。反应器内污泥流失阶段, 大量微生物随 污泥流出, 使微生物多样性维持在较低水平。通过以 上比较分析, T- RFLP 技术可以反映出反应器内微生 物多样性的变化趋势与反应器的运行状况有很大关 系, 微生物的演变对反应器的脱氮效率会产生明显的 影响。 2. 3anammox 种群系统发育分析 取反应器运行到第 24 天接种厌氧氨氧化颗粒污 泥后的样品 C3、 第 33 天脱氮效率较高阶段样品 C5 和第 8 天污泥流失严重阶段的样品 C8 共 3 个样品, 以 Amx368 和 Amx820 一对引物进行 PCR- 克隆, 建立 厌氧氨氧化菌基因克隆文库。在克隆文库中随机选 取 151 个阳性克隆子测序, 以系统发育树上处于同一 83 环境工程 Environmental Engineering 分支序列的 99 为临界点, 分别统计 3 个文库的分 类单元数、 香农指数和种群丰度等物种多样性指数, 统计结果见表 3。 表 3CSTR 反应器三个不同阶段 ANAMMOX 细菌 克隆文库的多样性指数 Table 3The diversity index of anammox in three different stages in CSTR reactor 样品描述 文库 名称 克隆子 数目 分类单 元数 种群 丰度 香农 指数 覆盖率/ 接种厌氧氨氧化颗粒污泥后样品C350220. 28100 稳定运行阶段污泥样品C550791. 2392 污泥流失阶段样品C851450. 2994. 1 根据表 3 CSTR 反应器接种颗粒污泥后的厌氧 氨氧化菌的香农指数为 0. 28, 其丰度很低, 多样性较 少, 直接反映为脱氮效率低。随着厌氧氨氧化条件趋 于成熟, 反应器稳定运行, 厌氧氨氧化菌的丰度有了 较大的升高。反应器的运行使厌氧氨氧化菌在种群 结构上变得更加丰富, 有助于增加反应器的稳定性。 当反应器中颗粒污泥流失时, 香农指数由稳定阶段的 1. 23 降为 0. 29, 说明持留住的厌氧氨氧化菌丰度降 低, 多样性减小, 群落结构重又回到了比较单一的 状态。 利用 MEGA5 程序对三组厌氧氨氧化细菌 16S rDNA 序列进行了系统发育进化和同源性分析, 并绘 制系统发育树, 如图 2 所示。 图 2三个阶段厌氧氨氧化细菌系统发育树 Fig. 2Phylogenetic tree of anammox bacteria 16S rRNA gene in three stages 利用 mothur 软件, 将相似度大于 97 的分为一 个 OTU。C3 文库共得到 2 个 OUT, 通过 BLAST 在线 序列比对, 该文库中 92 的 anammox OTU1与 Candidatus Brocadia sp. HM769652. 1 的相似度达到 99, 属于 Brocadia 菌属。C5 中约占文库 60 的 anammox 序 列 OTU1 和 OTU7 与 Candidatus Anammoxoglobus propionicus 序列的相似度达到 99, 占文库34的 anammox OTU2 和 OTU3 与 Candidatus Brocadia sp. 相似, 其余的 6 则没有在 BLAST 里比 对到具有较高相似度的标准菌株。由此可以看出, 在 反应器启动过程相对稳定的阶段, 反应器内的 anammox 主要是 Anammoxoglobus propionicus 菌属和 Brocadia 菌属。C8 样品建立的文库得到 4 个 OTU。 其中占文库 98 的序列 OTU1、 OTU3 和 OTU4 与 Candidatus Brocadia sp. 相似度为 99, 其余的与 Candidatus Anammoxoglobus propionicus 相似。由此, 反应 器 污 泥 流 失 阶 段 的 anammox 优 势 菌 种 与 Candidatus Brocadia sp. 同源, 属于 Brocadia 菌属。 对三个阶段反应器内样品分别分析后, 进行 3 个 文库之间相似度的比较 见图 3 , 该图验证了前面的 分析结果, 反应器接种污泥阶段和污泥大量流失阶段 反应器内厌氧氨氧化细菌具有较高相似性, 而反应器 稳定运行阶段, anammox 群落与二者相比具有较大 差异。 图 3 CSTR 三个阶段克隆文库间相似度比较 Fig.3Comparison of calculated similarities in all the branches of CSTR in three stages 93 水污染防治 Water Pollution Control 反应器内接种污泥几乎都为 Brocadia 属厌氧氨 氧化菌, 其在反应器整个启动过程中均起着重要的作 用。随着反应器的启动进入稳定阶段, 环境有所变 化, 反应器内的优势菌种从 Brocadia 属厌氧氨氧化菌 演替为 Anammoxoglobus propionicus 属厌氧氨氧化菌。 研究发现在有氨氮、 亚硝酸盐和硝酸盐存在的情况 下, Anammoxoglobus propionicus 氧化能力大于其他厌 氧氨氧化细菌或者是异养的反硝化菌 [11 ], 这与小试 实验结果相一致。同时 Kartal 等人还发现该种细菌 更容易在颗粒团聚体中检测到, 而在絮体污泥中几乎 没有。而本研究过程同样发现在 CSTR 反应器启动 过程的稳定阶段, Anammoxoglobus propionicus 属的厌 氧氨氧化细菌大量富集, 活性很高, 并参与厌氧氨氧 化反应生成大量氮气。颗粒内部产生的气泡不能及 时释放到液相中, 或者产生较小气泡附着在颗粒表面 均易导致颗粒污泥上浮并流失[12 ]。该种细菌由于颗 粒污 泥 流 失, 浓 度 降 低 而 失 去 竞 争 优 势, 使 得 Brocadia sp. 细菌重新成为厌氧氨氧化菌的优势种。 在 CSTR 反应器启动和运行过程中分阶段采集 污泥样品, 对其中的主要功能细菌进行定量分析, 监 测其在反应器启动过程中的动态变化, 解析反应器的 脱氮效果与微生物优势种群的相互关系, 并为一体化 反应器的优化提供数据支持。 实验采用实时定量 PCR 技术, 分别对氨氧化菌、 厌氧氨氧化菌、 亚硝酸盐氧化菌和全细菌进行定量分 析。结果如图 4 所示。 图 4反应器启动过程中功能细菌变化趋势 Fig.4The number variation tendency of the function bacterial in the reactor during start- up process 反应器启动初期, 系统内 AOB 的数量为 2. 13 107copies/g, anammox 的数量为 1. 28 106copies/g, 在温度维持 30 ℃, 溶解氧浓度逐渐降低的情况下运 行 10 d 后, 两种细菌的数量均有所增加。其中, anammox 数量增加到 2. 97 107copies/g, 但此时, 由 于系统处于接种污泥适应期, 两种脱氮细菌均处于适 应和富集阶段, 不能明显表现出厌氧氨氧化作用, 产 气量也不明显, 该阶段总氮去除率非常低, 仅在 10 左右。 反应器启动后接种富含厌氧氨氧化细菌的颗粒 污泥, 经过短暂的适应后 第 24 ~ 29 天为适应期 , 反应器内存在的厌氧颗粒污泥表面变红, 表现出了厌 氧氨氧化污泥的特性, 实现了反应器内厌氧颗粒污泥 的转化, anammox 由2. 97 107copies/g 增加到了 3. 93 108copies/g。在启动阶段溶解氧浓度降低, 由于亚 硝酸盐氧化菌对氧的亲和能力比 AOB 要低, 亚硝酸 盐氧 化 菌 活 性 受 抑 制 [13 ],亚 硝 酸 盐 积 累 并 被 anammox 所用, 有明显的厌氧氨氧化现象, 反应器的 脱氮效率在启动第 29 天之后提高到 60左右。 继续运行至30 天时, 亚硝酸盐浓度升高 111.3 mg/ L , 抑制了 AOB 的增长和氧化活性 [14 ], AOB 的数量 有所降低。反应器在运行到第 35 ~55 天过程中, 随 着 anammox 的厌氧氨氧化作用不断加强, 亚硝酸盐 消耗量大于生成量。亚硝酸盐被消耗, 其抑制作用减 弱, AOB 和 anammox 的数量进一步升高, 反应器稳定 运行, 脱氮效率有所回升, 平均在 50左右。 反应器运行到第 58 天时, 该阶段反应器中由于 溶解氧浓度控制出现问题, 亚硝酸盐氧化菌的数量逐 渐增多; 同时颗粒污泥膨胀, 沉降性能下降, 开始出现 流失现象。期间调整反应器的曝气方式为搅拌, 增加 沉淀池, 打碎膨胀的颗粒污泥并将其回流等, 每次采 取措施后, 只能暂时使脱氮效率有所提高, 但未能从 根本上解决污泥流失的问题, 如何解决颗粒污泥的有 效持留, 还需进一步的研究实践。 以上实验结果表明氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的 数量变化与总氮去除率的变化趋势有着非常紧密的 关系, 说明此反应器所表现出来的氨氮的去除确实是 由这两种功能细菌共同作用的结果。 3结论 以驯化的硝化污泥和厌氧颗粒污泥为 CANON 工艺的接种污泥与载体, 进行了 CSTR 小试反应器的 快速启动。开始阶段, 通过较低溶解氧浓度启动反应 器可以实现亚硝酸盐的快速积累, 继续降低溶解氧浓 度, 并接种厌氧氨氧化菌能够使反应器内原有污泥迅 04 环境工程 Environmental Engineering 速转化, 表现出厌氧氨氧化特性及活性, 反应器脱氮 效率显著提高。接种颗粒污泥的反应器启动过程中 的微生物群落结构变化明显, 由 Candidatus Brocadia sp. 优势菌种转变为 Anammoxoglobus propionicus 优势 菌种, 但随着污泥上浮流失, Anammoxoglobus propionicus 流失严重, 反应器内 Candidatus Brocadia sp. 重新成 为优势菌种。同时, 反应器内亚硝酸盐浓度变化对功 能细菌的影响较大, 过度积累会降低反应器的脱氮效 率。厌氧氨氧化反应产生的氮气附着在颗粒污泥表 面或颗粒内部, 不易释放, 使污泥沉降性能下降, 上浮 流失, 导致反应器失稳。因此, 在运行 CSTR 工艺时, 有效控制亚硝酸盐浓度和溶解氧浓度, 并寻找切实有 效的方法改善颗粒污泥的沉降性能, 防止污泥的流 失, 是实现反应器稳定运行的关键所在。 参考文献 [1]Strous M,VanGerven E, Zheng P, et al. 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