p53基因甲基化和突变与燃煤污染型砷中毒关系研究.pdf

生堡亟堕匡堂盘查 Q 生旦筮笪鲞箜i 塑垦丛 堕 丛鲤， 翌垫 坠 笪盟垒皇 p 5 3 基因甲基化和突变与燃煤污染型 砷中毒关系研究 张爱华潘雪莉夏玉洁肖骞黄晓欣 【摘要】目的探讨燃煤砷污染对人体∥基因甲基化 启动子区及第5 外显子 和突变 第 5 外显子 的影响，分析其与燃煤型砷中毒的关系。方法在贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区选择 1 1 2 例砷中毒患者，根据病情将其分为轻度中毒组 3 8 例 、中度中毒绢 4 3 例 和重度中毒组 3 1 例 ；根据有皮肤病理学诊断患者 4 3 例 的病理结果，将其分为非癌变组 2 4 例 和癌变组 1 9 例 。选择条件相似的非砷暴露村9 0 名居民作为对照组。在知情同意原则下，采集上述观察对 象的外周I I i L ，应用限制性内切酶- P C R 法检测p 5 3 基因启动子区及第5 外显子甲基化情况，应用 P C R 一单链构象多态性技术及P C R 产物克隆测序技术检测p 5 3 基因第5 外显子突变情况。结果p 5 3 基因启动子区甲摹化阳性率在轻、中、重度组分别为1 3 ．1 6 ％ 5 ／3 8 、2 7 ．9 1 ％ 1 2 ／4 3 、4 5 ．1 6 ％ 1 4 ／3 1 ，与对照组[ 1 ．“％ 1 ／9 0 ] 比较差异均有统计学意义 x 2 值分别为8 ．6 7 9 、2 3 ．6 9 0 、4 1 ．1 9 9 ， P 值均 0 ．0 1 7 ；在非癌变组和癌变组分别为2 5 ．0 0 ％ 6 ／2 4 和6 3 ．1 6 ％ 1 2 ／1 9 ，与对照组[ 1 ．1 l ％ 1 ／9 0 ] 比较差异均有统计学意义 X 2 值分别为1 8 ．7 6 2 、5 7 ．4 9 7 ，P 值均 0 ．0 2 5 。1 , 5 3 基因第5 外显 子甲基化阳性率在轻、中、重度组分别为5 5 ．2 6 ％ 2 1 ／3 8 、5 1 ．1 6 ％ 2 2 ／4 3 、4 8 ．3 9 ％ 1 5 ／3 1 ，与对照 组[ 8 8 ．8 8 ％ 8 0 ／9 0 ] 比较差异有统计学意义 0 值分别为1 8 ．1 5 1 、2 3 ．1 6 8 、2 2 ．4 2 0 ，P 值均 0 ．0 1 7 ； 在非癌变组和癌变组分别为5 4 ．1 7 ％ 1 3 ／2 4 和4 2 ．1 1 ％ 8 ／1 9 ，与对照组[ 8 8 ．8 8 ％ 8 0 ／9 0 ] 比较差 异有统计学意义 X 2 值分别为1 5 ．2 0 1 、2 2 ．0 7 5 ，P 值均 0 ．0 2 5 。p 卯基凶第5 外娘子突变率在轻、 中、重度组分别为5 ．2 6 ％ 2 ／3 8 、1 6 ．2 8 ％ 7 ／4 3 、2 5 ．8 1 ％ 8 ／3 1 ，中、重度组与对照组 0 ．0 0 ％ 比较 差异均有统计学意义 x 2 值分别为1 5 ．4 6 5 、2 4 ．8 7 0 ，P 值均 0 ．0 1 7 ；在非癌变组和癌变组分别为 1 6 ．6 7 ％ 4 ／2 4 、3 1 ．5 8 ％ 6 ／1 9 ，与对照组 0 ．0 0 ％ 比较差异均有统计学意义 X z 值分别为1 5 。5 4 5 、 3 0 ．0 7 7 ，P 值均 O ．0 2 5 。启动子区高甲基化与第5 外湿子突变相关 列联系数为0 ．2 9 4 ，P 0 ．0 5 ； 第5 外显子低甲基化与第5 外显子突变相关 列联系数为0 ．4 1 0 ，P O ．0 5 。结论燃煤砷污染可致 人体p 5 3 基因启动子区高甲基化、第5 外显子低甲基化和突变，卜述甲基化改变均与p 5 3 基因突变相 关联；p 5 3 基凶甲基化改变可能是砷致p “ 基因突变以及砷致病或致癌的重要原因之一。 【关键词】砷中毒；煤；基因，p 5 3 ；D N A 甲基化；突变 R e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em e t h y l a t l o na n dm u t a t i o no fp 5 3g e n ea n de n d e m i ca r s e mc l m s e db y c o a l - b u r n i n g Z H A N GA i h n a ’，P A ⅣX u e 一行，X I A 地施，X I A OQ i a n ，H U A N GX i a o - x i n ．‘D e p a r t m e n to f T o x i c o l o g y ，G u i y a n gM e d i c a lC o l l e g e ，G u i y a n g5 5 0 0 0 4 ，C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r Z H A N GA i h n a ，E m a i l a i h n a g y y a h o ac o m ．c n 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oe x p l o r et h ei n f l u e n c eo fa r s e n i cp o l l u t i o nc a u s e db yc o a l b u r n i n go n m e t h y l a t i o n p r o m o t e ra n de x o n5 a n dm u t a t i o n e x o n5 o fh u m a np s 3g e n e ，a n d t oa n a l y z et h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nm e t h y l a t i o n ，m u t a t i o na n da r s e n i s m ．M e t h o d sA c c o r d i n gt ot h ed i a g n o s t i cc r i t e r i ao f e n d e m i ca r s e n i s m ．11 2p a t i e n t sw i t ha r s e n i s m i n c l u d i n g3 8m i l dc a s e s ，4 3m o d e r a t ec a s e sa n d3 1s e v e r e c a s e s w e r es e l e c t e di nt h ea r e a sw i t he n d e m i ca m e n i s mf r o mX i n g r e n 。G u i z h o up r o v i n c e ．A m o n gt h e s u b j e c t s ，4 3c a s e sw e r ed i a g n o s e db yd e r m a t o p a t h o l o g i e a lm e t h o d s ，a n dt h e yw e r ed i v i d e di n t on o n c a n c e r o u s g r o u p 2 4c 8 8 e 8 a n dc a n c e r o u sg r o u p 19c a s e s ．9 0c o n t r o l sw e r es e l e c t e df r o mt h en o n a r s e n i cp o l l u t e d a r e a s ．U n d e rt h e p f i n c i p l eo f i n _ f o r m e dc o n s e n t ，b l o o d s a m p l e sw e mc o l l e c t e d f r o mi n d i v i d u a l s ．T h e D O I 1 0 ．3 7 6 0 ／e m a ．j ．i s s n ．0 2 5 3 - 9 6 2 4 ．2 0 1 1 ．0 5 ．0 0 3 基金项目国家自然科学基金 3 0 9 6 0 3 3 7 ，3 0 7 6 0 2 2 5 ；贵州省重大专项基金 黔科合重大专项字[ 2 0 0 s 1 6 0 1 6 作者单位5 5 0 0 0 4 贵阳医学院卫生毒理学教研室 张爱华、潘雪莉、夏玉洁、肖骞 ；解放军第四十四医院 黄晓欣 通信作者张爱华，E m a i l a i h u a g y y a h o o ．c 0 札c n 3 9 3 ．论著． 万方数据 主堡亟随医堂盘查垫 堡i 旦箜箜鲞星 翅g 堕 』￡堡 丛型丛骂垫 笪塑些墨 m e t h y l a t i o no fp 5 3g e n ei np r o m o t e rr e g i o na n de x o n5w e r ed e t e c t e db ye x t i n c t i o ne n z y m e - P C R ，t h em u t a t i o n o fp 5 3g e n e e x o n5 w a sd e t e c t e db yP C R - S S C P ，P C Rp r o d u c t sc l o n i n ga n d s e q u e n c i n gt e c h n o l o g y ．R e s u l t s T h ep o s i t i v er a t e so fm e t h y l a t i o no fp 5 3g e n ei np r o m o t e rr e g i o nw e r e1 3 ．1 6 ％ 5 ／3 8 ，2 7 ．9 1 ％ 1 2 ／4 3 a n d4 5 ．1 6 ％ 1 4 ／3 1 r e s p e c t i v e l ya m o n gm i l d ，m o d e r a t ea n ds e v e r ea r s e n i s mg r o u p ，w h i c hw e r eo b v i o u s l y h i g h e rt h a n t h er a t e si nt h ec o n t r o lg r o u p 1 ．1 l ％ 1 ／9 0 ，x 2v a l u e sw e r e8 ．6 7 9 ，2 3 ．6 9 0 ，4 1 ．1 9 9 ， r e s p e c t i v e l y ，b o t hPV a J U e 8 0 ．0 17 ．r n I ep o s i t i v er a t e s o fm e t h y l a t i o no fp 5 3g e n ew e r e2 5 ．o o ％ 6 ／2 4 a n d6 3 ．1 6 ％ 1 2 ／1 9 i nn o n - c a n c e r o u sa n dc a n c e r o u sg r o u pr e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r eo b v i o u s l yh i s h e rt h a n t h o s ei nt h ec o n t r o lg r o u p 1 ．％ 1 ／9 0 ，x 。v a l u e sw e r e1 8 ．7 6 2 ，5 7 ．4 9 7 ，r e s p e c t i v e l y ，b o t hPv a l u e s 0 ．0 2 5 ．1 l l ep o s i t i v er a t e so fm e t h y l a t i o no f p 5 3g e n e e x o n5 w e r e5 5 ．2 6 ％ 2 1 ／3 8 ，5 1 ．1 6 ％ 2 2 ／4 3 a n d4 8 ．3 9 ％ 1 5 ／31 r e s p e c t i v e l ya m o n gm i l d ，m o d e r a t ea n ds e v e r ea r s e n i s mg r o u p ，w h i c hw e r eo b v i o u s l y l o w e rt h a nt h er a t e si nt h ec o n t r o lg r o u p 8 8 ．8 8 ％ 8 0 ／9 0 ，x 2v a l u e sw e r e 1 8 ．1 5 1 。2 3 ．1 6 8 ，2 2 ．4 2 0 ， r e s p e c t i v e l y ，b o t hPv a l u e s 0 ．0 1 7 ．1 1 1 ep o s i t i v er a t e so fm e t h y l a t i o no f ∥g e n e e x o n5 w e r e5 4 ．17 ％ 1 3 ／2 4 a n d4 2 ．1 l ％ 8 ／1 9 i nn o n ．c a n c e r o u sa n dc a n c e r o u sg r o u pr e s p e c t i v e l y 。w h i c hw e r eo b v i o u s l y l o w e rt h a nt h o s ei nt h ec o n t r o lg r o u p 8 8 ．8 8 ％ 8 0 ／9 0 ，X 2v a l u e sw e r e1 5 ．2 0 1 ，2 2 ．0 7 5 ，r e s p e c t i v e l y ，b o t h Pv a l u e s 0 ．0 2 5 ．n em u t a t i o nr a t e so fp 5 3g e n e e x o n5 w e r er e s p e c t i v e l y5 ．2 6 ％ 2 ／3 8 ，1 6 ．2 8 ％ 7 ／4 3 a n d2 5 ．8l ％ 8 ／31 a m o n gm i l d ，m o d e r a t ea n ds e v e r ea r s e n i s mg r o u p ；w h i l et h er e s u l t si nm o d c r a t e a n ds e v e r ea r s e n i s mg r o u pw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p 0 ．0 0 ％，x 2v a l u e sw e r e1 5 ．4 6 5 ， 2 4 ．8 7 0 ，r e s p e c t i v e l y ，b o t hP v a l u e s 0 ．0 17 ．1 ．I l ep o s i t i v er a t eo fm u t a t i o no f ∥g e n e e x o n5 w e r e r e s p e c t i v e l yl6 ．6 7 ％ 4 ／2 4 a n d31 ．5 8 ％ 6 ／1 9 i nn o n c a n c e r o u sa n dc a n c e r o u sg r o u p ，w h i c hw e r e o b v i o u s l yh i g h e rt h a ni ti nt h ec o n t r o lg r o u p 0 ．0 0 ％，x 2V a l u e sw e r e1 5 ．5 4 5 ，3 0 ．0 7 7 ，b o t hPv a l u e s 0 ．0 2 5 、．T h eh y p e r m e t h y l a t i o no fp 5 3g e n ei np r o m o t e rr e g i o nw a sr e l a t e dw i t ht h em u t a t i o no f ．5 3g e n e e x o n5 c o e f f i c i e n to fa s s o c i a t i o nw a s0 ．2 9 4 ，Pv a l u e 0 ．0 5 ；a n dt h eh y p o m e t h y l a t i o no fp 5 3g e n e e x o n5 w a sr e l a t e dw i t ht h ei t sm u t a t i o n c o e f f i c i e n to fa s s o c i a t i o nw a s0 ．4 1 0 ，Pv a l u e 0 ．0 5 ． C o n c l u s i o nA r s e n i cp o l l u t i o nc a u s e db yc o a l b u r n i n ge a Rc a u s et h eh y p e r m e t h y l a t i o no fp 5 3g e n ei n p r o m o t e rr e g i o u ，h y p o m e t h y l a t i o na n dm u t a t i o no fp 5 3g e n e e x o n5 ，a n dt h ec h a n g e so fm e t h 7 l a t i o no fp 5 3 g e n ea r er e l a t e dw i t hi t sm u t a t i o na n dm i g h tb eo n eo ft h ei m p o r t a n te t i o l o g i c a lf a c t o r so fa r s e n i cp a t h o g e n i c i t y o rc a r c i n o g e n e s i s ． 【K e yw o r d s 】A r s e n i cp o i s o n i n g ；C o a l ；G e n e s ，p 5 3 ；D N Am e t h y l a t i o n ；M u t a t i o n 地方性砷中毒是我国政府高度重视的公共卫生 问题，包括饮水型和燃煤污染型。燃煤污染型地方 性砷中毒 简称燃煤型砷中毒 是惟一流行在中国 并首先在贵州发现且至今危害极大的地方病。2 0 0 3 年在陕西确认了第2 个该型砷中毒病区，现该病型 病区人口达1 2 1 万，诊断患者1 ．6 万，患者总数超过 饮水型砷中毒，防治任务艰巨。地方性砷中毒不仅 对人体皮肤、肝、肾、神经系统造成损害，更严重的是 远期效应所致的癌症高发，严重危害人群健康，皮肤 癌和肝硬化腹水是其主要死因。地方性砷中毒致病 和致癌机制不明且无特效药一直是制约其防治取得 突破性进展的瓶颈问题⋯。 随着肿瘤研究的深入，人们逐渐认识到，环境致 癌物不仅可通过突变等遗传学机制改变基因的表 达，也可通过表观遗传学机制改变基因功能，导致肿 瘤发生。D N A 甲基化是目前表观遗传学研究中相 对最为清楚，也是最重要的现象。针对砷存环境和 生物体内均有甲基化代谢的转换过程，推测此过程 可能会导致肿瘤相关基因D N A 甲基化模式的改变， 进而促进肿瘤发生。笔者选择与人类肿瘤相关性最 高的抑癌基因p 5 3 基因旧J ，探讨其启动子区甲基化 与燃煤型砷中毒的关系；同时，在既往初筛燃煤型砷 中毒患者外周血D N A 中印基因5 、6 、7 、8 外显子 突变基础上【4 | ，检测主要突变点第5 外显子甲 基化和突变情况，并分析声3 基因启动子区和第 5 外显子甲基化与突变的关系，从p 5 3 基因甲基化 和突变角度探讨燃煤砷污染的致病和致癌机制。 对象与方法 1 ．对象与分组在贵州省兴r 县交乐乡燃煤型 砷中毒病区，依据地方性砷中毒诊断标准 W S ／T 2 1 1 - 2 0 0 1 选择1 1 2 例砷中毒患者，其中男性 6 7 例，女性4 5 例，平均年龄 5 2 ．3 7 1 2 ．2 1 岁。根 据病情将其分为轻度中毒组 3 8 例 、中度中毒组 4 3 例 和重度中毒组 3 1 例 ；根据有皮肤病理学 诊断患者 4 3 例 的病理结果，将其分为非癌变组 包括表皮增生、过度角化、角化不全，2 4 例 和癌变 组 包括不典型增生、皮角、溃疡、B o w e n 病、基底细 胞癌和鳞癌，1 9 例 。在距病区约1 3k m 的非砷暴 露村，选择有相似生活习惯、无燃用高砷煤史、无遗 传及肿瘤等家族史、体检合格、年龄性别与病例组配 比均衡的9 0 名居民作为对照组，其中男性5 4 名，女 性3 6 名，平均年龄 4 4 ．5 6 9 ．3 8 岁。 2 ．主要试剂及仪器 1 限制性内切酶M S PI 、 万方数据 史堡亟堕医堂盘查垫 堡旦筮箜鲞复 塑鱼婪 』旦塑丛鲤监垫 丛笪盟垒墨 H p a U 购自英国N E B 公司；p M D1 8 - TV e c t o r 、T a q D N A 聚合酶、d N T P 、D N AM a r k e r 、琼脂糖购自日本 T a K a R a 公司；P C R 引物购自上海S a n g o n 公司；质粒 D N A 提取试剂盒购自美国O m e g a 公司；大肠杆菌 D I J Sc x 来源于贵阳医学院分子生物实验室。 2 核 酸蛋白分析仪 美国A m e r s h a m 公司 ，P C R 扩增仪 德国E p p e n d o f 公司 ，电泳仪 北京六一仪器厂 ， 凝胶成像系统 美国B i o R a d 公司 。 3 ．p 5 3 基因甲基化检测在知情同意原则下采 集观察对象外周血约2m l ，常规酚氯仿法提取基因 组D N A 。采用甲基化敏感的限制性内切酶H p aI I 进行D N A 酶切，不加内切酶体系 无菌双蒸水代替 内切酶 作阳性对照，M S PI 限制性内切酶体系作阴 性对照。酶切体系为1 0 N E B 缓冲液2 斗l ，基因组 D N A2 0 0n g ，H p aI I 内切酶1 0U M S PI 内切酶 1 出 ，无菌双蒸水至2 0 山。3 7 ℃消化过夜 ≤1 6h ，6 5 ℃灭活2 0m i n 。参照文献[ 5 - 6 ] 设计 引物，分别扩增p 5 3 基因启动子区和第5 外显子，引 物序列及反应条件见表l 。2 5 仙lP C R 反应体系为 1 0 P C R 缓冲液2 ．5 斗l ，M g c l 21 ．5 山，2 ．5m m o l ／L d N T P2 一，1 0w m o l ／L 上下游引物各0 ．5 山，酶切后 D N A 5 山，5U ／p , lT a qD N A 聚合酶0 ．5 恤l ，无菌双 蒸水至2 5I x l 。1 ．5 ％琼脂糖凝胶电泳鉴定P C R 产 物。若经H p aI I 酶切后D N A 能扩增出目的片段， M S PI 酶切后D N A 不能扩增出目的片段，则判定为 甲基化；如果H p a l I 及M S PI 酶切后D N A 均不能扩 增出目的片段，而不加内切酶的阳性对照能扩增出 目的片段，则判定为非甲基化。 4 ．p 5 3 基因突变检测样本采集及D N A 提取同 上。采用P C R 一单链构象多态性技术 p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n s i n g l es t r a n dc o n f o m m f i o np o l y m o r p h i s m ， P C R S S C P 检测p 5 3 基因突变。p 5 3 基因第5 外显 子参见文献[ 7 ] 设计引物，引物序列及反应条件见 表1 。P C R 反应体系为2 5 山，其中1 0 P C R 缓冲液 2 ．5 l ，M g C l 21 ．5 出，2 ．5 m m o i ／Ld N T P2 “， 1 0w m o l ／L 上下游引物各1w l ，基因组D N A2 0 0r i g ， 5u ／I z lT a qD N A 聚合酶0 ．5 山，无菌双蒸水至 2 5 一。取5 一P C R 产物，加入5 山S S C P 上样缓冲 液混匀，变性，上样于8 ％非变性聚丙烯酰胺凝胶， 1 5 0V 电压，4 ℃条件下电泳3h ，硝酸银染色。比较 样本D N A 与正常D N A 的S S C P 条带，出现条带增 多、减少或位置改变即视为异常条带，可能有突变存 在。将有异常条带的P C R 纯化产物4 山，p M D1 8 - T V e c t o r1 I - d ，L i g a t i o ns o l u t i o nI5 出，1 6 ℃连接过夜， 连接液转化至大肠杆菌D H 5 e t 感受态细胞中，通过 L B 平板 含A m p1 0 0m s ／L 筛选及质粒D N A 提取， 将该含有目的片段的质粒送大连T a K a R a 公司 测序。 5 ．统计学分析采用S P S S1 3 ．0 统计软件对实 验数据进行分析，甲基化、突变数据多组间比较采用 X 2 检验，进一步两两比较采用x 2 分割法；甲基化与 突变相关分析采用列联系数法。以P 0 ．0 5 为差 异有统计学意义。 结果 1 ．砷中毒患者p 5 3 基因甲基化检测结果砷中 毒患者按病情分组发现，轻、中、重度组患者p 5 3 基 因启动子区及第5 外显子甲基化阳性率与对照组比 较，差异均有统计学意义，且p 5 3 基因启动子区甲基 化阳性率随砷中毒患者病情加重而升高 x 2 3 9 ．1 2 3 ，J P O ．0 5 ，第5 外显子甲基化阳性率随砷 中毒患者病情加重而降低 x 2 2 6 ．2 8 1 ，P 0 ．0 5 。 见表2 ，图1 ，2 。 砷中毒患者按皮肤病理诊断分组发现，非癌变 组和癌变组患者p 5 3 基因启动子区及第5 外显子甲 基化阳性率与对照组比较，差异均有统计学意义，且 p 5 3 基因启动子区甲基化阳性率随砷巾毒患者皮肤 病理损害程度的加重而升高 x 2 5 0 ．9 6 1 ，P 0 ．0 5 ，第5 外显子甲基化阳性率随砷中毒患者皮肤 病理损害程度的加霞而降低 x 2 2 4 ．9 8 2 ，P 0 ．0 5 。见表3 。 2 ．砷中毒患者P 5 3 基肉突变检测结果对 表1p 5 3 基因甲基化及突变检测的P C R 引物序列及扩增条件 万方数据 虫堡亟陵医堂盘圭 Q 堡 旦翌笪鲞筮 麴g 堕翌』堕 丛鲤丛型垫 Y 丛箜t 型 表2 不同程度砷中毒患者p 5 3 基因甲基化及突变结果 组别 A 数 g ．- t C l 丽案筹蒜蔺案嚣淼菊杂蒜赫 一●●_ - ●_ _ _ ●_ _ _ _ ●_ - - - _ _ _ - _ - _ _ ●_ I - ●_ _ ●_ _ - ●_ I _ - _ _ _ - - _ _ ●_ - - _ _ _ _ _ ●_ _ - ●●- _ _ - _ _ _ ●●_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ●- ●_ - _ I _ _ _ _ - ●- _ _ _ _ _ _ _ - _ _ ●●_ _ ●_ - _ _ _ _ _ - _ ●- _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ ●- _ _ _ _ - _ - _ ●_ _ - _ _ - - ●_ _ - - ●_ _ - _ _ _ ●_ ●_ _ _ _ _ _ - - ●_ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。。●_ _ 一 对照组 9 011 ．1 1 8 08 8 ．8 800 ．0 0 轻度中毒组 中度中毒组 3 8 4 3 5 1 2 1 3 ．1 6 8 2 7 ．9 1 b 2 1 2 2 5 5 ．2 6 d 5 1 ．1 6 。 2 7 5 ．2 6 1 6 ．2 8 5 重鏖主耋塑 兰箜 鱼 塑 箜 一 注数据采用x 2 分割法．a 凋整为0 ．0 1 7 。与对照组比较，8x 2 8 ．6 7 9 、“x 2 2 3 ．6 9 0 、。x 2 4 1 ．1 9 9 、4x 2 1 8 ．1 5 1 、。x 2 2 3 ．1 6 8 、‘x 2 2 2 ．4 2 0 、5x 2 1 5 ．4 6 5 、hX 2 2 4 ．8 7 0 ，P 值均 o ．0 1 7 表3不同皮肤病变组砷中毒患者p 5 3 基因甲基化及突变结果 组别人数c 名或例，面硅灭芸害彗主蔷≠‰面硅灭曩毒美翥翥{ ‰奏夏灭主等蚤篓翥≠薪 注数据采用x 2 分割法，a 凋整为0 ．0 2 5 。与对照组比较，1x 2 1 8 ．7 6 2 、6x 2 5 7 ．4 9 7 、。x 2 1 5 ．2 0 1 、dx 2 2 2 ．0 7 5 、。x 2 1 5 ．5 4 5 、fx 2 3 0 ．0 7 7 ，P 值均 O ．0 2 5 M D N AM a r k e r ；l 阳性对照 不加内切酶 ；2 阴性对照 M s p I 酶切后扩增 ；3 、5 、6 甲基化阳性样本 H p a Ⅱ酶切 后扩增 ；4 甲基化阴性样本 H p a Ⅱ酶切后扩增 图1p ”基因启动子区甲基化检测P C R 产物琼脂糖凝胶 电泳图 M D N AM a r k e r ；1 、2 、4 甲摹化阳性样本 H p a Ⅱ酶切后扩 增 ；3 甲基化阴性样奉 H p a I I 酶切J j 扩增 ；5 阴惟对照 M s pI 酶切后扩增 ；6 阳性对照 不加内切酶 图2 彬基因第5 外显子甲基化检测P C R 产物琼脂糖凝 胶电泳图 P c R S S C P 筛选出来有异常电泳条带的P C R 产物，经 壳隆测序验证主要为G C _ A T 的转换，见图3 、4 。 对砷中毒患者按病情分组发现，中、重度组患者p 5 3 基因第5 外显子突变率与对照组比较，差异有统计学 意义，且突变率随砷中毒患者病情加重而升高 x 2 2 3 ．8 4 0 ，P O ．0 5 ，见表2 ；对砷中毒患者按皮肤病理 诊断分组发现，非癌病变组和癌变组患者p 5 3 基因第 5 外显子突变率与对照组比较，差异均有统计学意 义，且突变率随砷中毒患者皮肤病理损害程度的加重 而升高 X 2 2 5 ．8 0 9 ，P O ．0 5 ，见表3 。 图3 序列来自p 5 3 基冈非编码链，图中C A C - * C A T 。对应1 4 3 位密码子由C T G G T A ；图4 序列来自p 5 3 基因编码链，图 中1 5 2 位密码子由C C C - * T C C ；图中箭头所示为突变位点 图3 - 4p 5 3 基因突变克隆测序图 3 ．砷中毒患者p 5 3 基因甲基化与突变关系分 析将观察对象按p 5 3 基因启动子区及第5 外显子 万方数据 生堡亟堕医堂盘查 Q 生 旦．笠箜鲞筮 塑堡 鱼』￡唑丛鲤丛盟垫 些笪 丛{ 甲基化结果分别进行分组。1 , 5 3 基因启动子区甲基 化组中t , 5 3 基因突变率为2 8 ．1 3 ％ 9 ／3 2 ，非甲基 化组中其突变率为4 ．7 l ％ 8 ／1 7 0 ，差异有统计学 意义 X 2 1 9 ．1 6 3 ，P 0 ．0 5 ；1 , 5 3 基因启动子区甲 基化与第5 外显子突变相关 列联系数为0 ．2 9 4 ， P 0 ．0 5 。p 5 3 基因第5 外显子甲基化组中p 5 3 基 因突变率为0 ．6 8 ％ 1 ／1 4 6 ，非甲基化组中其突变 率为2 8 ．5 7 ％ 1 6 ／5 6 ，差异有统计学意义 X 2 4 0 ．8 3 8 ，P 0 ．0 5 ；p 5 3 基因第5 外显子低甲基化与 第5 外显子突变相关 列联系数为0 ．4 1 0 ，P 0 ．0 5 。 讨论 砷是国际癌症机构确认的人类致癌物，也是至 今未成功在动物身上获得致癌模型的极少数致癌物 之一。因此，充分利用我国独特人群病型及样本资 源进行相关研究，具有重要的科学意义和实际价值。 如前所述，皮肤是砷中毒的重要靶器官之一，采用皮 肤标本进行研究无疑对了解砷致皮肤病损尤其是皮 肤癌的作用机制更直接、客观，但由于人群研究皮肤 标本获取难度大，加之砷中毒为多脏器损害、多发内 脏癌的复杂疾病，故笔者以外周血作为生物样本，探 讨p 5 3 基因甲基化和突变与燃煤污染型砷中毒关 系，其结果对推论砷的致病或致癌机制具有重要参 考价值。 研究表明，在肿瘤的发生发展中存在D N A 甲基 化水平和模式的紊乱。D N A 甲基化是由S ．腺苷甲 硫氨酸提供甲基基团，在D N A 甲基转移酶的作用 下。将C p G 二核苷酸的胞嘧啶甲基化为5 一甲基胞嘧 啶。D N A 甲基化町调控基因的差异表达，在维持细 胞正常功能、胚胎发育、X 染色体失活和基因印记等 正常生理过程中起着至关重要的作用；同时D N A 甲 基化状态的改变亦是致癌的关键因素之一，通过影 响基因突变、基因表达调控、基因组稳定性等在肿瘤 的发生和演进过程中扮演着重要角色，并与人类多 种肿瘤的早期诊断、治疗及预后密切相关旧圳。与 D N A 甲基化过程相似，无机砷进人体内，在甲基转 移酶作用下，以S 一腺苷甲硫氨酸为甲基供体，经过 两次氧化还原后分别生成单甲基胂酸和二甲基胂 酸。无机砷特殊的甲基化代谢途径，使人们更有理 由把目光聚焦于砷暴露后细胞中肿瘤相关基因甲基 化状态的改变。 研究显示【10 。，发生甲基化的C p G 二核苷酸有 2 种分布形式，一种分布于C p G 岛，即结构基因5 ’端 调控区 启动子区 ，另一种散在分布于非转录调控 区。基因启动子区C p G 岛D N A 在正常状态下一般 为非甲基化状态，当其发生甲基化后，可通过干扰特 异转录因子 如A P - 2 、C ．M y e ／M y n 、E ，F 等 与相应 启动子的识别位置结合直接影响基因转录，或通过 被甲基C p G 结合蛋白家族所识别，间接影响基因转 录，导致一些重要的基因如抑癌基因、D N A 修复基 因等功能丧失，促进肿瘤形成1 | 。关于砷