高效脱氨除臭异养硝化菌的筛选鉴定及脱氨性能研究.pdf

高效脱氨除臭异养硝化菌的筛选鉴定及脱氨性能研究 * 田凤蓉张彬彬杨志林王开春王克云刘娟 中蓝连海设计研究院， 江苏 连云港 222004 摘要 从畜禽养殖厂土壤中分离筛选出 2 株高效异养硝化脱氨菌株， 命名为 LH- N7、 LH- N29， 通过 16S rDNA 分析鉴定 及系统发育树分析， LH- N7 属于善变副球菌 Paracoccus versutus ， LH- N29 属于枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 。在以 NH4 2SO4为唯一氮源、 葡萄糖为唯一碳源的氨氧化培养基中， 菌株 LH- N7 及菌株 LH- N29 72 h 内氨氮降解率达到 92和 93. 2， 体系中总氮降解率达到 65. 5 和 73. 3。菌株 LH- N7 降解过程中有硝酸盐积累， 但随后会同步转 化， 说明 LH- N7 同时具有好氧反硝化能力， 菌株 LH- N29 脱氨过程中几乎没有硝酸盐和亚硝酸盐积累， 说明 LH- N29 能 够同步硝化反硝化。两株菌配伍后脱氮率高于任一单菌株， 且以 V LH- N7 ∶ V LH- N291∶ 2混合去除效果最佳， 氨 氮降解率达到 99. 3。两株菌在最佳脱氨配比条件下能够使活性污泥的氨氮和总氮去除率 24 h 提高 24. 7 和 47. 1， 达到 97. 5和 84. 2。 关键词 善变副球菌; 枯草芽孢杆菌; 异养硝化; 筛选鉴定; 脱氨性能 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201405016 ISOLATION，IDENTIFICATION OF HETEＲOTＲOPHIC NITＲIFIEＲS AND OPTIMIZATION OF THEIＲ AMMONIA NITＲOGEN ＲEMOVAL EFFICIENCY Tian FengrongZhang BinbinYang ZhilinWang KaichunWang KeyunLiu Juan China Bluestar Lehigh Engineering Corporation，Lianyungang 222004，China AbstractTwo deodorization strains LH- N7 and LH- N29 were isolated from the activated sludge of a coking wastewater plant， and the strains was identified as Paracoccus versutus and Bacillus subtilis respetively，based on phylogenetic analysis of its 16S rDNA sequence． Using LH- N7 and LH- N29 in a reactor under aerobic conditions，Ammonia nitrogen loss reached 92 and 93. 5 and total nitrogen loss in the reaction system could reach 65. 5 and 73. 3 respectively in 72 h． The Ammonia nitrogen was firstly accumulated，then transed together with nitrate nitrogen when using LH- N7 to remove Ammonia nitrogen． Otherwise，there was almost no nitrite and nitrate nitrogen accumulated in the system when using LH- N29． When the two starins were combined，the best denitrification rate reached 99. 3 when the volume ratio of LH- N7∶ LH- N29 was 1∶ 2 in the artificial wastewater， which was higher than that of any single strain． The ammonia nitrogen and total nitrogen removal rate could reach 97. 5 and 84. 2 in 24 h when LH- N7 and LH- N29 were combined，which were 24. 7 and 47. 1 higher than those of the original activated sludge． KeywordsParacoccus versutus;Bacillus subtilis;heterotrophic nitrification;isolation identification;characteristics of denitrification * 江苏省科技厅科技公共服务平台项目 BM2011094 ; 连云港市工业 攻关项目 CG1221 。 收稿日期 2013 －07 －12 0引言 近年来， 石油化工、 合成橡胶、 炼焦以及水产加工 等工业过程排放的低浓度挥发性有机恶臭气体对一 些地区的大气环境造成了重大污染。恶臭气体根据 其组成可分为五类 含硫化合物， 含氮化合物， 卤素及 衍生物， 烃类， 含氧有机物。其中， 硫系化合物中的 H2S 以及氮系化合物中的 NH3是影响面最为广泛的 恶臭物质。传统的物理化学对氨气的脱除方法虽然 效率高， 但高成本， 二次污染使其不能得到有效发展， 而生物法硝化脱氨以其无二次污染、 成本低成为了解 决这个问题的突破口［1 ］。传统理论认为行使硝化功 46 环境工程 Environmental Engineering 能的主要是一群自养型微生物［2 ］，但是在实践中， 研 究者发现自养硝化菌在脱氨工艺中存在很多局限 性 ［3 ］， 而随着异养硝化现象的发现［4- 8 ］， 异养硝化菌 逐渐被分离筛选出来， 文献中报道的包括恶臭假单胞 菌 Pseudomonas putida ［9 ］、芽 孢 杆 菌 Bacillus sp． ［10 ］、 粪产碱菌 Alcaligenes faecalis［11 ］、 节杆菌 Arth robacter sp． ［12- 13 ］、 红球菌 Ｒhodococcus sp． ［14 ］ 和脱氮副球菌 Paracoccus denitrificans ［15 ］等。与自 养硝化菌相比， 异养硝化菌不仅生长速率快、 而且溶 解氧浓度低、 更能够耐受酸性环境。研究表明， 一些 异养硝化菌同时也是好氧反硝化菌 ［16 ］， 意味着硝化 反硝化可以在同一反应器中完成， 这一点也是自养硝 化菌无法比拟的优势。因此， 异养硝化微生物的研究 在生物脱除氨气方面具有很广阔的前景。 本研究从畜禽养殖厂土壤中分离筛选出 2 株高 效脱氨菌株， 通过 16S rDNA 分析鉴定及系统发育树 分析确定其发育地位， 同时研究 2 株菌的脱氨特性， 为异养硝化细菌在脱氨除臭方面的应用提供一定的 理论依据。 1实验部分 1. 1培养基 富集培养基 NH4SO41 g/L， NaNO31 g/L， NaCl 0. 3 g/L， FeSO40. 03 g/L， K2HPO40. 25 g/L， MgSO4 0. 03 g/L， NaCO30. 3 g/L， CH3COONa 0. 5 g/L， 蒸馏 水 1 L， pH 为 8. 0。 筛选分离培养基 NH4 2SO4 0. 5 g， C6H12O6 0. 5 g， MgSO47H2O 0. 03 g，FeSO47H2O 0. 01 g， CaCl20. 05 g，K2HPO40. 5 g， KH2PO40. 25 g， 蒸馏水 1 L， pH 为 8. 0， 固体培养基中添加 2琼脂。 LB 培养基 g/L 蛋白胨 10 g， 酵母膏 5 g， NaCl 5 g， pH 为 7. 0。 1. 2脱氨菌的驯化和分离筛选 取畜禽养殖厂土壤 1 g， 接入 1 L 装有 500 mL 富 集培养基的三角瓶中， 充分混匀， 30 ℃， 170 r/min 条 件下摇瓶培养， 以 3 d 为一个周期， 每一周期结束后， 将富集培养液以 10 的接种量转入新鲜培养基中， 持续富集， 定期检测氨氮去除情况及亚硝酸盐氮和硝 酸盐氮积累情况， 并定期取富集液接种至 LB 培养基 中检测活菌数， 当氨氮降解达到 90 以上， 活菌数 ≥2 108时可以认定驯化完成。 取富集培养液进行梯度稀释， 涂布与平板上， 长 出单菌落后， 选择有代表性的菌落划线法反复进行分 离纯化， 直到得到纯菌株。将纯化得到的菌株接种到 筛选分离培养基中， 30 ℃、 170 r/min 条件下， 培养 24 h， 检测各菌株对氨氮的利用情况， 筛选出对氨氮 利用率高的菌株。将获得高效的异养硝化菌株， 接种 于 LB 斜面上， 4 ℃冰箱保藏 ［16 ］。 1. 3脱氨菌株的鉴定及系统发育分析 筛选得到菌株的基因组 DNA 提取、 16S rDNA 的 PCＲ 扩增与测序均由生工 上海 生物工程技术股份 有限公司完成。 将测序得到的 16S rDNA 基因序列通过 NCBI 网 站， 用 Blast 软件检索， 与 GenBank 数据库中的已有的 序列进行比较， 根据比对结果， 选择与测试菌株同属 的代表菌株及部分已知的硝化菌株， 下载其序列， 并 用 CLUSTALX． 1. 8 软件进行序列匹配。用 Mega 5. 0 软件， 采用 Neighbor- joining 方法构建系统发育树［17 ］。 1. 4单菌脱氨效果研究 将分离得到的异养硝化菌株接入 LB 培养基中， 30 ℃， 170 r/min 下培养 2 d， 离心并使用无菌水冲洗 3 次后配制成菌悬液， 备用。 将各菌株的菌悬液接入装有 500 mL 培养基的 1 L锥形瓶中， 培养基中 NH4 2SO4含量为 0. 8 g/L， C/N 3∶ 1， 接种量 5， 培养液初始 pH 为 8. 0。在 30 ℃， 170 r/min 培养72 h。每隔8 h 取样测定氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮、 总氮浓度以及菌株生长量。每组 实验设置 3 个平行。 1. 52 株菌不同配比混合后脱氨效果研究 将两株菌的菌悬液按照 1∶ 1、 1∶ 2、 1∶ 3、 2∶ 1、 3∶ 1 的量混合后接入装有 500 mL 培养基的 1 L 锥形瓶 中， NH4 2SO4含量为 0. 8 g/L， C/N 3∶ 1， 接种量 5， 培养液初始 pH 为 8. 0。在 30 ℃， 170 r/min 培 养72 h。定时取样测定氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮、 总氮 浓度以及菌株生长量。每组实验设置 3 个平行。 1. 6菌株最佳配比生物强化脱氨作用 将上述实验获得的最佳脱氨效果配比菌株扩大 培养， 将培养 24 h 的菌液按 1 的接种量接入有活 性污泥的好氧曝气反应器中， 进水 NH4 2SO4为唯 一氮源， 起始氨氮浓度为 251. 5 mg/L， 定时取样测定 氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮、 总氮浓度以及菌株生长量。 并与相同接种量的活性污泥的脱氨效果进行比较。 2结果与讨论 2. 1高效脱氨菌株的分离与筛选结果 从畜禽养殖厂土壤中共分离得到 51 株具有硝化 56 大 气 污 染 防 治 Air Pollution Control 脱氨能力的单菌株， 将分离得到的单菌接种到筛选分 离培养基中， 根据其对氨氮的降解情况， 筛选得到 2 株生长旺盛， 脱氨效率高的单菌， 命名为 LH- N7、 LH- N29。 2. 2高效脱氨菌株的鉴定结果 菌株 LH- N7、 LH- N29 的 16S rDNA DNA 序列长 度分别为 1386bp 和 1447bp， 经 BLAST 同源性检索， 将测序结果与 GenBank 上已登录的基因序列进行比 对， 发 现 菌 株 LH- N7 与 善 变 副 球 菌 Paracoccus versutus 同源性达到 99; 菌株 LH- N29 与枯草芽孢 杆菌 Bacillus subtilis 的同源性达到 99。利用 MEGA 5. 0 软件， 将分离菌株与部分参考菌株基于 16S rDNA 序列构建系统发育树， 得到系统进化发育 树的 结 构 如 图 1 所 示，LH- N7 与 善 变 副 球 菌 Paracoccus versutus 同源性的置信度为 100， LH- N29 与枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 同源性的置信 度为 99。因此可以初步判定菌株 LH- N7 是一株善 变副球菌 Paracoccus versutus ， 菌株 LH- N29 是一株 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 。 图 1菌株 LH- N7/LH- N29 16S rDNA 序列与参考 菌株构建的系统发育树 Fig．1Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strains LH- N7 /LH- N29 and sequences of reference strains 2. 3单菌脱氨效果 菌株 LH- N7 及菌株 LH- N29 在以 NH4 2SO4为 唯一氮源、 葡萄糖为唯一碳源的氨氧化培养基中生长 情况及脱氨特性如图 2、 图 3 所示。 由图 2 可知 菌株 LH- N7 在 16 h 进入对数生长 期， 48 h 后进入稳定生长期， 菌株在进入对数生长期 后快速转化氨氮， 氨氮最终去除率达到 92。氨氮 在微生物的作用一部分被微生物同化为自身生长代 谢所需的有机态氮， 即生物质氮， 另一部分异化作用 脱除。总氮所反映的为生物质氮和异化作用后残余 图 2菌株 LH- N7 的氨氮降解特征及生长曲线 Fig．2Degradation characteristics to ammonia nitrogen and the growth curve of strain LH- N7 图 3菌株 LH- N29 的氨氮降解特性及生长曲线 Fig．3Degradation characteristics to ammonia nitrogen and the growth curve of strain LH- N29 氮量。由图 2 可知， 总氮起始值为 173. 2 mg/L， 开始 下降平稳， 32 h 后快速下降， 72 h 降解率为 65. 5。 同时体系中硝态氮不断积累， 32 h 后， 硝态氮和体系 中的总氮含量同时下降， 所以可以认为被脱除的总氮 是由菌株 LH- N7 在好氧条件下反硝化脱除的。初步 判断该 LH- N7 在高效脱氨的同时也具有反硝化能 力， 这与樊杰 ［18 ］研究的一株脱氨除臭菌 JN- 4 氮代谢 途径相似。 由图 3 可以看出 菌株 LH- N29 在16 h 进入对数 生长期， 48 h 后进入稳定生长期， 菌株在进入对数生 长期后快速转化氨氮， 氨氮最终去除率达到 93. 2。 总氮起始值为 173. 2 mg/L， 开始下降平稳， 24 h 后快 速下降， 72 h 降解率为 73. 3。在氨氮氧化过程中， 培养基中几乎无硝酸盐和亚硝酸盐的积累， 说明 LH- N29 兼具反硝化功能， 能同步硝化反硝化， 不同于樊 杰 ［18 ］筛选的枯草芽孢杆菌 JN- 4 氮代谢特征， 但与司 66 环境工程 Environmental Engineering 文攻 ［19 ］筛选的假单胞菌 N- 4 的氮代谢特性相似。 2. 42 株菌不同比例混合后脱氨效果 微生物与微生物之间存在着互生、 共生、 协同、 拮 抗等多种复杂的关系 ［20 ］， 为了研究两株菌混合后的 脱氨效果， 使筛选出的高效脱氨菌株达到最大利用 率， 将两株菌的菌悬液以不同比例混合， 以考察两株 高效脱氨菌的不同配比下的脱氨效果， 为脱氨除臭菌 混合应用提供一定理论依据。 由图 4 可知， 菌株 LH- N7 及菌株 LH- N29 以五种 比例混合后对起始浓度为 169. 5 mg/L 的氨氮去除率 均达到 95以上， 高于任一单菌株对氨氮的去除率， 且以 V LH- N7 ∶ V LH- N29 1∶ 2混合去除效果最 佳， 达到 99. 3， 可见菌株之间的协同作用是需要一 定的比例组合才能达到最大的发挥。另外， 在实验中 发现， V LH- N7 ∶ V LH- N29 分别为 1∶ 1、 1∶ 2、 1∶ 3的 组合脱氨过程中， 全程几乎没有硝酸盐和亚硝酸盐的 积累， 这与 LH- N29 单独脱氨的结果一致， 说明菌株 LH- N29 同步硝化反硝化起了主要作用; 而在 V LH- N7 ∶ V LH- N29 分别为 2∶ 1、 3∶ 1的组合脱氨过程中， 硝酸盐略有积累， 最高为 12. 1 mg/L 和 15. 2 mg/L， 均低于 LH- N7 单独脱氨时的硝酸盐积累量， 说明两 株菌混合作用后， 菌株 LH- N29 在脱氨过程中为起主 导作用的优势菌。 图 4菌株 LH- N7 与菌株 LH- N29 不同比例混合后脱氨效果 Fig 4Effect of volume ratio strains LH- N7 and LH- N29 combination on ammonia- nitrogen removal ability 2. 5菌株最佳比例混合的生物强化脱氨作用 研究表明， 人工能够分离培养的菌株一般只占自 然界存在菌株总量的 1 左右 ［21 ］， 而筛选菌株的目 的是人为的提高某些有特殊降解能力菌株的数量， 使 其在系统中占优势， 与自然界原始菌株相互作用， 来 强化并提高原系统的污染物降解能力。本实验以筛 选到高效降解氨氮的优势菌株为研究对象， 考察在其 最佳脱氨配比 V LH- N7 ∶ V LH- N29 2∶ 1条件下 的生物强化脱氨作用， 结果如表 1 所示。起始氨氮浓 度为 251. 5 mg/L， 总氮浓度为 253. 9 mg/L。 表 1添加配伍菌株与不加对氨氮降解的影响 Table 1Effect of adding combined strains on ammonia- nitrogen removal abilitymg/L 项目 活性污泥活性污泥 配伍菌株 12 h24 h12 h24 h ρ 氨氮124. 5 68. 490. 96. 4 ρ NO － 3－N 38. 969. 40. 590. 24 ρ NO － 2－N 0. 981. 020. 210. 1 ρ TN179. 5 159. 7125. 440. 2 由表 1 可以看出 在好氧曝气反应器中， 活性污 泥 24 h 的氨氮降解率为 72. 8， 在氨氮氧化过程中， 硝酸盐不断积累， 并且由于硝酸盐的积累， 总氮 24 h 的去除率为 37. 1。而将配伍菌株接入活性污泥的 反应器中， 氨氮 72 h 的降解率达到 97. 5， 在氨氮氧 化过程中， 硝酸盐和亚硝酸盐几乎没有积累， 总氮的 去除率达到 84. 2。由此可知， 添加配伍菌株对氨 氮的降解效果明显优于活性污泥， 而且可以同步去除 总氮， 氨氮和总氮的去除率分别提高了 24. 7 和 47. 1。说明菌株 LH- N7 和 LH- N29 作为生物强化 脱氨菌株有较强适用价值。下一步可考虑制成混合 微生态制剂进一步应用。 3结论 1从畜禽养殖厂土壤中分离筛选出两株高效异 养硝 化 脱 氨 菌 株， 命 名 为 LH- N7、 LH- N29， 通 过 16S rDNA分析鉴定及系统发育树分析， LH- N7 属于 善变副球菌 Paracoccus versutus ， LH- N29 属于枯草 芽孢杆菌 Bacillus subtilis 。 2在以 NH4 2SO4为唯一氮源、 葡萄糖为唯一 碳源的氨氧化培养基中， 菌株 LH- N7 及菌株 LH- N29 长势良好， 72 h 内氨氮降解率达到 92和 93. 2， 总 氮降解率达到65. 5和73. 3。菌株 LH- N7 不仅具 有异养硝化能力， 同时能够好氧反硝化， 菌株 LH- N29 则是一株能够进行同步硝化反硝化的菌株。 3菌株 LH- N7 及菌株 LH- N29 配伍后脱氮率高 于任一单菌株， 且以 V LH- N7 ∶ V LH- N291∶2混合 去除效果最佳， 氨氮降解率达到 99. 3。两株菌在最 佳脱氨配比条件下能够使活性污泥的氨氮和总氮去除 率24 h 提高24. 7和47. 1， 达到97. 5和84. 2。 76 大 气 污 染 防 治 Air Pollution Control 参考文献 ［1］Ausubel F M．Manual of Molecular Biology Experiment［M］ ． BeijingScience Press， 2005 1457- 1574. ［2］温东辉， 唐孝炎． 异养硝化及其在污水脱氮中的作用［J］ ． 环境 污染与防治， 2003， 25 1 283- 285. ［3］马放， 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