黄孢展齿革菌对萘胺的降解优化及其动力学研究.pdf

黄孢展齿革菌对萘胺的降解优化及其动力学研究 * 梁峙1马捷2梁骁3刘喜坤4吴伟力1仇琛1权泉1肖扬1 1. 徐州工程学院环境工程学院， 江苏 徐州 221111; 2. 中国矿业大学， 江苏 徐州 221008; 3. 上海财经大学经济学院， 上海 200433; 4. 徐州市水利局， 江苏 徐州 221111 摘要 考察了黄孢展齿革菌 Phanerochaete sp． 在不同温度、 接种量、 外源物质、 pH 值、 以及不同萘胺质量浓度等单因 素条件下对萘胺降解效率的影响， 设定了 5 因素 4 水平对菌株的降解条件进行优化， 结果表明 当温度为 35 ℃， 接种 量为 20， 外加碳源 海藻糖 浓度为 5 g/L， 萘胺为 100 mg/L， pH 为 8. 5 时， 其降解率最高， 达到 78. 14; 同时， 采用 优化方案， 建立了萘胺初始浓度为 50 mg/L 和 100 mg/L 的动力学模型。 关键词 黄孢展齿革菌; 生物降解; 萘胺; 降解优化 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201405010 ＲESEAＲCH ON OPTIMUM PＲOPOSAL AND KINETIC MODEL FOＲ PHANEＲOCHAETE SP． ON NAPHTHYLAMINE DEGＲADATION Liang Zhi1Ma Jie2Liang Xiao3Liu Xikun4Wu Weili1Qiu Chen1Quan Quan1Xiao Yang1 1. Department of Environment Engineering， Xuzhou Institute of Technology， Xuzhou 221111， China; 2. China University of Mining and Technology， Xuzhou 221008，China; 3. School of Economics， Shanghai University of Finance and Economics， Shanghai 200433， China; 4. Water Affairs Bureau of Xuzhou， Xuzhou 221111，China AbstractUsing strains of Phanerochaete sp． ， which can completely biodegrade naphthylamine，isolated from previous research， influences of the temperature， inoculum size， complex organic carbon source and pH on Phanerochaete sp． growth as well as naphthylamine biodegradation were studied． Setting five actors and abilities of four levels optimized degradation conditions of the strains，it is concluded that the strain shows best naphthylamine biodegrading ability at 35 ℃，inoculum size of 20，trehalose concentration of 5g/L，naphthylamine concentration of 100 mg/L and pH of 7. 0，and the degradation rate reaches 78. 14． The kinetic model is established at initial naphthylamine concentration of 50 mg/L and 100 mg/L under the optimized condition group． KeywordsPhanerochaete sp． ;biodegradation;naphthylamine;optimum proposal of degradation * 国家星火计划项目 2013GA690426 ; 住房和城乡建设部项目 2013- K7- 11 ; 江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目 201311998076X ; 徐 州市社会发展计划项目 XF13C057 ; 徐州国际合作项目 XM12B09 。 收稿日期 2013 －09 －09 0引言 随着纺织印染工业的快速发展， 偶氮类染料的产 品种类和用量日益增加， 偶氮类化合物污染已成为水 处理领域关注的重点。萘胺是目前最常用的偶氮类 染料之一， 因其有毒且在自然环境中难以降解而成为 研究者关注的焦点 ［1- 3 ］。在前期的研究过程中， 从江 苏徐州染化厂排污底泥中筛选出能够降解含有萘胺 废水的菌株， 经形态观察和16S rDNA 鉴定， 确定为黄 孢展齿革菌属 Phanerochaete 。该菌株对降解萘胺 的环境有着较高的要求， 各种复杂碳水化合物对菌株 降解萘胺的影响能力不同， 因此通过重点考察复杂外 源物质和外部环境因素对降解萘胺的影响， 研究菌株 降解特征， 优化降解条件， 建立降解模型， 为萘胺的高 效降解提供依据 ［4- 7 ］。 1试验部分 1. 1供试菌种 前期研究得到的偶氮类染料降解菌株。由徐州 市染化厂受污染土样中分离， 经鉴定为黄孢展齿革菌 04 环境工程 Environmental Engineering 属 Phanerochaete ［8- 10 ］。 1. 2培养与降解方法 将降解菌株分别接入到装有250 mL 基础培养基 的三角瓶中， 设置葡萄糖质量浓度为 10 g/L， 转速为 130 r/min， 温度为 35 ℃， pH 值为 7. 0， 在回转式恒温 调速摇瓶柜中进行培养增殖。同时以 5 接种量接 入至10 L 全自动气升式反应器中， 设置温度为 35 ℃， pH 值为7. 0， 通气量为1. 1 dm3/min， 培养代谢5 d。 1. 3分析方法 1. 3. 1菌体生物量测定［11 ］ 取一定体积发酵液在4 000 r/min 下离心 20 min， 过滤后用蒸馏水洗涤 2 次， 收集菌体于 80 ～ 90 ℃干 燥至恒量。用菌体干重来表示菌体生物量。 1. 3. 2萘胺测定 采用 HPLC 法。将降解液在 4 000 r/min 下离心 20 min， 取上清液用二氯甲烷对溶液连续萃取 3 次， 用 0. 45 μm 孔径的 HPLC 过滤器过滤萃取液。设定流动 相为甲醇/水溶液， 检测波长为 255nm， 以 HYPEＲ_ ODS2_C18 作为柱填料， 测定萘胺降解量 ［ 12- 13 ］。 1. 4降解率计算 降解率计算公式 ［14 ］如下 Ｒ q/C0 100 q C0－ C 式中 q 为降解量， mg/L; C0为萘胺加入量， mg/L; C 为检测残留量， mg/L; 2结果与讨论 2. 1温度对降解萘胺的影响 温度是影响微生物活动的重要因素， 温度对于微 生物生长代谢和一系列酶的催化反应都具有直接影 响， 同时温度还间接影响着其他因素对萘胺的降解。 选用基础培养基， 设定萘胺初始浓度为 200 mg/L、 转 速为130 r/min、 pH 值为7. 0， 分析温度对黄孢展齿革 菌降解萘胺的影响 见图 1 。 图 1温度对萘胺降解的影响 Fig．1Influence of temperature on naphthylamine degradation 由图 1 可看出 菌株在不同的温度下对萘胺降解 能力明显不同， 30 ～40 ℃是菌株降解的主要阶段， 平 均降解率为 66; 35 ℃ 时降解率达到最高点， 可达 71; 当温度高于 45 ℃或低于 20 ℃时， 黄孢展齿革 菌的降解率急剧下降， 小于 32。该结果说明温度 过低微生物生命代谢受到影响， 体内各种酶的活性降 低， 菌体降解有害物质的能力下降， 菌株活性减缓。 然而， 温度过高会导致微生物菌体结构蛋白和各种酶 系结构变形， 使微生物无法生存甚至死亡， 无法进行 相关的生物降解。 2. 2接种量对萘胺降解的影响 选用基础培养基， 设定温度为 35 ℃， 转速为 130 r/min， pH 值为7. 0， 萘胺的初始浓度为 250 mg/L， 依次设定体积分数为 1、 2、 5、 10、 20、 25、 30的接种量， 72 h 后分析黄孢展齿革菌对萘 胺的降解能力， 见图 2 所示。 图 2菌株接种量对萘胺降解的影响 Fig．2Influence of inoculum size on naphthylamine degradation 由图 2 可看出 1 和 2 的接种量在 72 h 后菌 株对萘胺的降解率分别是 20 和 41， 由于接种量 较小， 72 h 降解液中微生物菌体数量未能达到饱和状 态， 使其分解联苯的能力大大降低; 5的接种量72 h 后对萘胺的降解率接近 70， 随着接种量的增加 102 h后的降解率并没有随之增加， 而是出现平缓态 势。因此， 5 ～10的接种量最为经济科学， 增大接 种量并不能提高微生物的降解率。 2. 3不同外源物质对萘胺的降解影响 研究通过添加竹粉末、 玉米芯粉、 木屑粉、 海藻 糖、 麸皮粉和稻壳粉等外源物质， 分析碳水化合物对 黄孢展齿革菌生长的影响。设定萘胺初始浓度为 250 mg/L， 选择温度为 35 ℃， 转速为 130 r/min， pH 值为 7. 0， 研究不同外源物质对菌株降解萘胺的促进 作用， 如图 3 所示。 14 水污染防治 Water Pollution Control 图 3不同外源物质对降解萘胺的促进作用 Fig．3Influence of extra carbon source on naphthylamine degradation 由图 3 可看出 不同外源物质对菌株降解萘胺的 促进作用不同， 木屑粉、 海藻糖、 麸皮粉对菌株降解萘 胺的促进作用明显， 平均降解率高达 67; 稻壳粉、 玉米芯粉在一定程度上也有促进降解的作用， 降解率 为 56; 竹粉末促进作用不明显。 添加不同的外源物质， 反应中 pH 也随之产生变 化， 添加木屑粉、 海藻糖会使 pH 下降明显， 分析原因 是由于有机酸的大量产生导致。 2. 4不同初始浓度下萘胺的降解 试验选用基础培养液， 控制溶液 pH 值为 7. 0、 转 速为130 r/min， 分别加入初始质量浓度为30， 50， 80， 100， 120， 150， 180， 200， 250， 300 mg/L 的萘胺。设定 平行样本， 每隔 12 h 取样测定降解液中萘胺的残留 质量浓度， 在 35 ℃条件下代谢 5 d， 分析黄孢展齿革 菌对不同初始浓度的萘胺降解能力， 见图 4。 图 4不同初始浓度萘胺的降解 Fig．4Effects of different initial concentrations on naphthylamine degradation 由图 4 可 看 出萘 胺 的 初 始 浓 度 为 30 ～ 100 mg/L时， 在48 h 内降解率达90， 72 h 萘胺几乎 全部降解; 当萘胺的初始浓度为 120 ～ 150 mg/L 时， 由于萘胺对降解菌的毒性作用， 降解菌在初期表现生 长缓慢， 降解酶活性较低， 36 h 后菌株适应了该浓度 下萘胺对其的毒害作用， 相应的降解酶活性增强， 大 量分解萘胺， 使溶液中萘胺的浓度迅速降低， 72 h 后 萘胺的降解率达 68， 96 小时降解率接近 90; 当 培养液中萘胺初始浓度设定为 300 mg/L 时， 超出了 黄孢展齿革菌的毒性承受范围， 菌体数量增长缓慢甚 至停止， 使得该样本中萘胺在 108 h 内难以降解， 其 降解率小于 11。 2. 5综合环境条件的影响 为了综合了解菌株的降解特性， 拟通过正交试验 得出菌株降解萘胺的最佳环境条件。选取温度、 pH、 接种量、 外加碳源、 添加萘胺为 5 因素， 根据上述试验 条件为参考依据， 设定各因素的 4 个水平， 见表 1。 表 1正交试验因素、 水平设定 Table 1Factors and levels of the orthogonal experiment 编号 ABCDE 温度/℃pH 接种量/外源物质 萘胺/ mg L－1 1358. 05海藻糖200 2307. 030竹粉末150 3407. 52玉米芯粉100 4458. 520稻壳粉50 根据设置的因素、 水平进行 16 组正交试验， 并对 相应试验结果进行直观分析， 见表 2。 表 2正交试验直观分析 L16 45 Table 2Intuitionistic analysis of the orthogonal experiment L16 45 试验号ABCDE降解率/ 135 1 8. 0 1 5 1 海藻糖 1200 175. 1 235 1 7. 0 2 30 2竹粉末 2150 268. 5 335 1 7. 5 32 3 玉米芯粉 3 100 365. 5 435 1 8. 5 4 20 4稻壳粉 450 475. 9 530 2 8. 0 15 1 玉米芯粉 350 458. 4 630 2 7. 0 2 30 2稻壳粉 4100 362. 4 730 2 7. 5 32 3 海藻糖 1150 275. 1 830 2 8. 5 4 20 4竹粉末 2200 162. 5 940 3 8. 0 15 1 稻壳粉 4150 245. 9 1040 3 7. 0 2 30 2玉米芯粉 3 200 156. 9 1140 3 7. 5 32 3 竹粉末 250 458. 4 1240 3 8. 5 4 20 4海藻糖 1100 362. 7 1345 4 8. 0 15 1 竹粉末 2100 370. 2 1445 4 7. 0 2 30 2海藻糖 150 453. 5 1545 4 7. 5 32 3 稻壳粉 4200 150. 4 1645 4 8. 5 4 20 4玉米芯粉 3 150 254. 3 K171. 250 62. 40062. 550 66. 60061. 225 K264. 600 60. 32560. 000 64. 90060. 950 K355. 975 62. 35056. 850 58. 77565. 200 K457. 100 63. 85069. 525 58. 56061. 550 极差 Ｒ15. 2753. 525 12. 675 7. 9504. 250 因素主→次 A1C4D1E3B4 24 环境工程 Environmental Engineering 表 2 显示了菌株降解萘胺的 16 组正交试验数 据， 试验以萘胺降解率为衡量指标。根据 K 值与极 差 Ｒ 计算， 其最优方案是 A1C4D1E3B4， 即温度 35 ℃， 接种量 20， 外加碳源 海藻糖 浓度为 5 g/L， 萘胺 为 100 mg/L， pH 值为 8. 5。 根据正交试验直观分析数据进行方差分析， 得到 F 临界值和显著性， 见表 3。 由表 3 可知 温度和萘胺添加量对降解率的影响 极为显著， 是影响降解效率的主要因素。 根据正交试验直观分析数据绘制该正交试验的 效应曲线图， 见图 5 所示。由图 5 可以看出 温度、 pH、 接种量已取得最佳值， 而萘胺添加量和外源添加 物可进一步研究。 表 3方差分析 Table 3Variance analysis on the orthogonal experiment 因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性 温度609. 67731. 8554. 760＊ ＊ pH25. 16730. 0774. 760 接种量348. 94731. 0624. 760 外源物质203. 91730. 6204. 760 萘胺47. 72730. 1454. 760* 误差657. 406 根据所得最优方案进行验证试验， 所得结果萘胺 降解率为 78. 14， 此数值均比正交试验中任一组要 高， 说明正交试验所得结果是正确的。 对效应曲线图进行分析， 温度和萘胺添加量两因 素有交互作用， 对降解率的影响见表 4。 图 5正交试验效应曲线 Fig．5Effect curve of the orthogonal experiment 表 4温度与萘胺交互作用 Table 4Interaction of temperature and naphthylamine 萘胺质量浓度/ mg L －1 温度/℃ 35304045 20075. 10053. 50075. 10062. 700 15070. 20068. 50058. 40062. 500 10058. 40056. 90065. 50054. 300 5045. 90062. 40075. 90050. 400 由表 4 可知 当温度为 40 ℃、 萘胺添加量为 50 mg/L时交互作用明显。 2. 6降解动力学模型建立 在反应器中添加外加碳源 海藻糖 浓度 5 g/L， 温度为 35 ℃， 接种量为 20， pH 值为 8. 5， 分别设定 萘胺浓度为 50 mg/L 和 100 mg/L， 测定不同初始浓 度下降解后残余的萘胺浓度， 对残留浓度取对数， 作 出萘胺剩余浓度对降解时间的函数， 绘制 lnc － t 曲线 如图 6 所示。 对图6 进行线性回归分析， 萘胺初始浓度为50 mg/ L 时， 降解动力学方程为lnc 3. 84654 －0. 0339t， 相 关系数 Ｒ20. 9796， 降解速率常数为 0. 0339; 萘胺初 图 6不同初始萘胺浓度对时间 lnc － t 曲线 Fig．6The curve of Inc － t with different naphthylamine concentrations 始浓度为 100 mg/L 时， 降解动力学方程为 lnc 5. 2178 －0. 0239t， 相关系数 Ｒ20. 9301， 降解速率常 数为 0. 0239。 分析结果表明， 试验中用一级反应动力学模型能 够很好的反映黄孢展齿革菌对萘胺的降解， 在试验设 定范围内， 菌株对萘胺的降解保持较高的生物降解活 性， 对萘胺的毒性具有一定的抗毒物冲击性。 3结论 1 温度是影响降解菌生长代谢和酶促反应的重 34 水污染防治 Water Pollution Control 要因素， 35 ℃是降解的最佳温度， 降解率达到 71。 2 5 ～10的接种量是最为经济、 科学的， 其72 h 后对萘胺的降解率接近 80。增大接种量， 无法提 高黄孢展齿革菌对萘胺的降解。 3 不同外源物质对萘胺降解有着显著影响， 木 屑粉、 海藻糖、 麸皮粉对菌株降解萘胺的促进作用明 显， 降解率平均达 67; 稻壳粉、 玉米芯粉在一定程 度上也有促进降解的作用， 降解率为 56; 竹粉末促 进作用不明显。 4 不同初始浓度萘胺影响着菌株对其的降解 率。当初始浓度为 30 ～100 mg/L 时， 在 48 h 内其降 解率达到 90， 72 h 几乎将剩余的萘胺全部降解; 当 初始浓度为 300 mg/L 时， 底物中萘胺毒性超出了其 所能够承受的范围， 菌体生长停止， 108 h 后其降解率 小于 11。 5 通过正交试验对菌株降解萘胺进行优化， 当 温度为 35 ℃， 接种量为 20， 外加碳源 海藻糖 浓 度为 5 g/L， 萘胺为 100 mg/L， pH 值为 8. 5 时， 其降 解率最高可达 78. 14。 6 采用优化方案， 建立了萘胺初始浓度为50 mg/L 的动力学模型 lnc 3.84654 －0.0339t; 以及萘胺初始浓 度100 mg/L 的动力学模型 lnc 5.2178 －0.0239t。 参考文献 ［1］PeiZongping， HanBaoping， LiuHanhu， etal．Tracer experimental study of the main conveying conduits of CCl4pollutant in the qiligou water supply resource［J］ ． Journal of China University of Mining and Technology， 2007， 17 2 184- 187. ［2］Chen Hongwei， Zhu Yunlane，Su Xianyan，et al．Studies on degradation characteristicoflashing- resistancestrain ［J］ ． Agricultural Science ＆ Technology， 2007， 8 3/4 33- 37. ［3］LiangZhi， HanBaoping， ZhangKai．Investigationon physicochemical conditions affecting the growth of mycelial pellet of white- rot fungus Phanerochaete chrysosporium［J］ ．Journal of Pure and Applied Microbiology， 2008， 2 4 73- 80． ［4］魏俊飞， 吴家强， 焦文娟． 多环芳烃的毒性及其治理技术研究 ［J］． 污染防治技术， 2008， 21 3 65- 69. ［5］Scott A N，NGuessan A L，Nyman M C． Effective treatment of PAH contaminated superfund site soil with the peroxy- acid process ［J］． Journal of Hazardousmaterials， 2007， 146 3 652- 660. ［6］张利红， 李培军， 巩宗强． 土壤条件对 PAHs 紫外光降解影响及 动力学研究［ J］ ． 辽宁工程技术大学学报． 自然科学版， 2007， 26 1 132- 135. ［7］史玉玲， 梁峙， 肖扬． 处理偶氮类染料废水的研究现状及其进展 ［J］． 广东化工， 2012， 239 15 140- 141. ［8］梁峙， 韩宝平， 张旭． 白腐真菌对四氯化碳的生物降解特性研究 ［J］． 武汉理工大学学报， 2008， 30 5 74- 78. ［9］Liang Zhi，Han Baoping． White- rot fungus growth conditions and its metabolic kinetic models ［J］ ．Agricultural Science and Technology， 2008， 9 6 1- 9. ［ 10］梁峙， 张凯． 白腐真菌菌丝球形成的物化条件研究［J］ ． 河南信 阳师范学院学报， 2009， 22 1 66- 70. ［ 11］梁峙， 韩宝平， 陈波． 四氯化碳优势降解细菌筛选及降解特性研 究［ J］ ． 中国矿业大学学报， 2008， 37 1 134- 138. ［ 12］Yuan T，Marshall W D．Optimizing a washing procedure to mobilize polycyclic aromatic hydrocarbons PAHsfrom a field- contaminatedsoil ［J］．Industrial＆EngineeringChemistry Ｒesearch， 2007， 46 13 4626- 4632. ［ 13］梁峙， 李勇， 裴宗平． 生物絮凝剂在处理洗煤废水中的应用 ［J］． 徐州工程学院学报． 自然科学版， 2009， 24 1 42- 50. ［ 14］Liang Zhi，Han Baoping， Liu Hong． Optimum conditions to treat high- concentration microparticle slime water with bioflocculants ［J］． Mining Science and Technology， 2010， 20 3 478- 484. 第一作者 梁峙 1961 － ， 男， 博士， 教授， 主要从事高渗压污水生物降 解及其功能基因研究。 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 xuzhouliangzhi163． com 上接第 9 页 ［ 13］邢丽贞． 固定化藻类去除污水中氮磷及其机理的研究［D］． 西 安 西安建筑科技大学， 2005. ［ 14］魏群， 刘明升， 蔡元妃． 藻类膜对富营养化湖泊水处理效果实 验［J］ ． 环境工程， 2011， 29 2 10- 12. ［ 15］Jing Shi， Bjrn Podola，Michael Melkonian． Ｒemoval of nitrogen and phosphorus from wastewater using microalgae immobilized on twin layersan experimental study ［J］ ．Journal of Applied Phycology， 2007， 19 5 417- 423. 第一作者 孙红云 1987 － ， 女， 研究生， 主要研究方向为环境污染控 制工程。 通讯作者 魏群 1971 － ， 男， 副教授， 博士， 研究方向为环境污染控制 工程、 藻类生物技术。hustweiqun163． com 44 环境工程 Environmental Engineering