抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表达水平与燃煤型砷中毒关系的研究.pdf

中国疾病预防控制中心 博士学位论文 抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表达水平与燃煤型砷 中毒关系的研究 姓名刘清 申请学位级别博士 专业劳动卫生与环境卫生学 指导教师金银龙 20070701 抑癌基因甲基化及抑癌基因和D N A 甲基化酶 表达水平与燃煤型砷中毒关系的研究 中文摘要 目的 流行病学研究证明，由于环境、职业和治疗性原因使人类长期暴露于砷及其 化合物，皮肤、膀胱及呼吸系统等部位的肿瘤发病率明显增高。燃煤型砷中毒是 由于长期使用砷含量高于l O O m g ／k g 的煤，高砷煤释放出大量的砷污染粮食、辣 椒和室内空气，通过饮食与呼吸大量的砷蓄积体内，而造成的慢性砷中毒。贵州 省燃煤型砷中毒自发现至今已2 0 多年，在当地造成严重危害，尤其是其高发的 远期致癌效应严重地威胁着病区人群的生命安全。因受限于动物模型难以复制成 功和砷的毒性作用机制尤其是分子机制不清，关于砷的致癌机理目前还不是很明 确。随着表观遗传学在肿瘤研究中的逐步深入，认为D N A 启动子区域的高甲基化 是抑癌基因失活的主要机制之一，启动子异常甲基化是肿瘤形成过程中的一个早 期、频发事件，与肿瘤的发生、发展及预后关系密切。目前研究表明，无机砷在 人体内的甲基化代谢过程可能影响D N A 甲基化，导致D N A 甲基化异常，砷对D N A 甲基化的影响与砷致癌作用的关系受到越来越多的关注。目前大多数相关研究为 动物或体外试验，人群研究资料较少。本研究在现场流行病学调查的基础上，通 过检测燃煤型砷中毒病人外周白细胞抑癌基因p 1 6 、p 1 5 、R A S S F l A 启动区的甲 基化，并对抑癌基因和D N A 甲基化酶 D N M T 的表达水平进行研究，探讨燃煤型 砷中毒对抑癌基因甲基化及抑癌基因和D N A 甲基化酶表达水平的影响，为进一步 研究砷致癌的分子机制提供依据。 方法 1 应用现场流行病学调查方法，对贵州燃煤型砷中毒病区的病人、病区对照和 病区外对照进行流行病学调查。 2 运用甲基化特异性P C R 方法 M e t h y l a t i o n s p e c i f i cP C R ，M S P ，检测外周 2 白细胞抑癌基因p 1 6 、p 1 5 、R A S S F l A 启动区的甲基化状况，分析影响抑癌基 因甲基化的相关因素。 3 运用R T P C R 方法，检测外周白细胞抑癌基因p 1 6 、p 1 5 、R A S S F l A 的R N A 转 录水平，分析影响抑癌基因转录水平的影响因素。 4 运用R T P C R 方法，检测外周白细胞D N M T l 、D N M T 3 A 、D N M T 3 B 的R N A 转录水 平，分析影响D N M T 转录水平的影响因素。 结果 第一部分燃煤型砷中毒对抑癌基因甲基化的影响 l 抑癌基因p 1 6 、p 1 5 、R A S S F l A 启动区的甲基化率病例组显著高于内、外对 照组，并呈现随砷中毒病情增加的趋势 P 0 ．0 1 。 2 经对性别、年龄、民族、居住年限、文化程度、吸烟、饮酒等进行的单因素 分析表明其不是影响抑癌基因p 1 6 、p 1 5 甲基化的因素；而年龄是影响R A S S F l A 基因甲基化的因素，R A S S F l A 基因甲基化人群与非甲基化人群平均年龄比较 有显著性差异，甲基化人群平均年龄显著大于非甲基化人群 P 0 ．0 5 年龄与p 1 5 转录水平呈正相关关系，随年龄 增大p 1 5 转录水平升高 P 0 ．0 5 ；年龄与R A S S F l A 转录水平呈负相关关系， 随年龄增大R A S S F l A 转录水平降低 P O ．0 1 。 3 多元线性回归分析结果显示，p 1 6 转录水平的主要影响因素是砷中毒程度和 文化程度，其标准回归系数 b ’ 分别是- 0 ．1 9 1 和0 ．1 4 4 ，P 值为分别为0 ．0 1 0 和0 ．0 5 0 ，随着砷中毒程度加深，p 1 6 转录水平显著降低；而文化程度高的研 究对象其p 1 6 转录水平更高，说明文化程度对砷中毒引起的p 1 6 转录水平降 低可能是一个保护因素；犀5 转录水平的主要影响因素是年龄，其标准回归 系数 b ’ 是0 ．1 5 9 ，P 值为0 ．0 3 3 ，随着年龄的增高，p 1 5 转录水平显著升 高；R A S S F l A 基因转录水平的主要影响因素是砷中毒程度和年龄，其标准回 归系数 b ’ 分别是- 0 ．3 1 3 和- 0 ．1 6 9 ，P 值为0 ．0 0 0 和0 ．0 1 7 ，随着砷中毒 程度加深和年龄增大，R A S S F l A 转录水平显著降低。 第三部分燃煤型砷中毒对D N M T 表达水平的影响 1 D N M T l 和D N M T 3 B 的转录水平外对照组、内对照组、砷中毒轻度、中度、重度 中毒组之间总体有显著性差异 P O ．0 5 。 2 经对性别、年龄、民族、居住年限、文化程度、吸烟、饮酒等进行的单因素 分析表明吸烟是影响D N M T l 转录水平的因素 P 0 ．0 1 ，吸烟者D N M T l 转录水 平显著高于不吸烟者；年龄与D N M T 3 B 转录水平呈正相关关系，随年龄增大， D N M T 3 B 转录水平升高 P 0 ．0 5 。 3 多元线性回归分析结果显示，砷中毒程度是影响D N M T l 和D N M T 3 B 转录水平的 主要因素，其标准回归系数 b ’ 分别是0 ．3 5 8 和0 ．3 9 0 ，P 值均为0 ．0 0 0 ， 随着砷中毒程度加深，D N M T l 和D N b l T 3 B 转录水平显著升高。按P O ．0 5 显著 水平，与D N M T 3 A 转录水平相关的影响因素无一能进入多元线性回归模型中。 第四部分研究结果的综合分析 1 抑癌基因甲基化及转录水平和D N M T 转录水平三者之间的单因素分析结果 4 抑癌基因p 1 6 、p 1 5 和R A S S F l A 甲基化人群其基因转录水平显著低于非甲基 化人群 P O ．0 5 ，抑癌基因的高甲基化可能影响基因的表达，使其转录水平降低。 抑癌基因p 1 6 、R A S S F l A 甲基化人群其D N M T 3 A 和D N M T 3 B 转录水平显著高于 非甲基化人群 P O ．0 5 ，D N M T 表达的升高可能造成抑癌基因的高甲基化。 抑癌基因p 1 6 转录水平与D N M T 3 B 转录水平之间存在负相关关系 P O ．0 5 ， 随着D N M T 3 B 水平升高，抑癌基因p 1 6 转录水平降低；抑癌基因R A S S F l A 转录水 平与D N M T l 转录水平之间存在负相关关系 P O ．0 5 ，随着D N M T l 水平升高，抑癌 基因R A S S F l A 转录水平降低。说明D N M T 活性的升高可能引起抑癌基因的高甲基 化，间接引起抑癌基因表达下降。 2 影响抑癌基因甲基化及转录水平和D N M T 转录水平三者的多因素分析 综合考虑抑癌基因甲基化及转录水平和D N M T 转录水平三者之间的联系后进 行的多元L o g i s t i c 回归分析和多元线性回归分析结果显示如下 砷中毒程度是抑癌基因p 1 6 、p 1 5 和R A S S F l A 甲基化的主要影响因素，随着 砷中毒程度的加深，抑癌基因甲基化增加；另外D N M T 3 B 转录水平也是影响p 1 6 甲基化的主要因素之一，而年龄是影响R A S S F l A 甲基化的主要因素之一。． 砷中毒程度和文化程度是p 1 6 转录水平的主要影响因素，其回归系数 b ’ 分别是一0 ．2 1 0 和0 ．1 4 9 ，说明随着砷中毒程度加深，p 1 6 转录水平逐渐降低；而 文化程度高的研究对象其口6 转录水平更高，文化程度可能对砷中毒引起的转录 水平下降是一个保护因素。 p 1 5 甲基化和D N M T 3 A 转录水平是p 1 5 转录水平的主要影响因素，其标准回 归系数 b ’ 分别是一0 ．1 9 5 和0 ．1 6 0 ，说明随着p 1 5 甲基化升高，p 1 5 转录水平 降低；而随着D N M T 3 A 转录水平增高p 1 5 转录水平也增高。 砷中毒程度和年龄是R A S S F l A 转录水平的主要影响因素，其标准回归系数 b ’ 分别是- 0 ．3 1 3 和一0 ．1 6 9 ，说明随着砷中毒程度加深和年龄增大，R A S S F I A 转录水平逐渐降低。 砷中毒程度是D N M T l 和D N M T 3 B 转录水平的主要影响因素，随着砷中毒程度 加深，D N M T l 和D N M T 3 B 转录水平升高。另外犀6 甲基化也是D N M T 3 B 转录水平的 影响因素，p 1 6 甲基化高的研究对象其D N M T 3 B 转录水平也高。 5 结论 l 燃煤型砷中毒是抑癌基因p 1 6 、p 1 5 、R A S S F l A 启动区高甲基化的主要影响 因素，并随着砷中毒程度加深，甲基化率显著升高。 2 燃煤型砷中毒是抑癌基因p 1 6 和R A S S F l A 转录水平的主要影响因素，并随 着砷中毒程度加深，转录水平显著下降；p 1 5 转录水平无显著变化。 3 燃煤型砷中毒是D N M T l 和D N M T 3 B 转录水平的主要影响因素，并随着砷中毒 程度加深，转录水平显著升高；D N M T 3 A 转录水平无显著变化。 4抑癌基因p 1 6 、p 1 5 和R A S S F l A 甲基化人群其基因转录水平显著低于非甲基 化人群，抑癌基因甲基化可能影响基因转录水平。 5 抑癌基因p 1 6 、R A S S F l A 甲基化人群的D N M T 3 A 和D N M T 3 B 转录水平显著高于 非甲基化人群，D N M T 表达升高可能是造成抑癌基因高甲基化的因素之一。 6 抑癌基因p 1 6 转录水平与D N M T 3 B 转录水平之间存在负相关关系，抑癌基因 R A S S F l A 转录水平与D N M T l 转录水平之间存在负相关关系，D N M T 转录水平 可能影响抑癌基因的转录水平。 综合上述研究结果，燃煤型砷中毒对抑癌基因的甲基化及表达、D N M T 表达 均是一个主要影响因素；抑癌基因的甲基化及表达、D N M T 表达三者之间也存在 相互联系。但由于本研究仅是一个横断面的初步研究，对其内在机制的探讨有 待进一步的深入研究。 关键词燃煤型砷中毒；p 1 6 基因；p 1 5 基因；R A S S F l A 基因；D N A 甲基化； D N A 甲基化酶；表达；甲基化特异性P C R ；R T - P C R 6 S t u d yo nt h er e l a t i o n sa m o n g D N A m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e ，e x p r e s s i o no fD N A m e t h y l t r a n s f e r a s e sa n dc o a l 。b u r n i n ge n d e m i ca r s e n is m O b j e c t i v e A b s t r a c t T h et u m o ri n c i d e n c e s o fs k i n ，b l a d d e ra n dr e s p i r a t o r ys y s t e mw e r e e l e v a t e ds i g n i f i c a n t l yf o rt h eh u m a nw a sl o n gt i m ee x p o s e db ya r s e n i c a l s f r o me n v i r o n m e n t ，p r o f e s s i o no rt h e r a p y ．I tw a sp r o v e d b ye p i d e m i o l o g y r e s e a r c h ．C o a l b u r n i n ge n d e m i ca r s e n i s mw a sc h r o n i ca r s e n i s mf o ru s i n g t h ec o a li nw h i c ht h ec o n t e n to fa r s e n i c a lw a sh i g h e rt h a nl O O m g ／k g ，t h e f o o d ，p e p p e ra n di n d o o ra i rc o n t a m i n a t e db ya r s e n i c a lo fc o a l b u r n i n g ． C o a l b u r n i n ge n d e m i ca r s e n i s mw a st h es e r i o u sd i s e a s e s ，e s p e c i a l l yi t s c a r c i n o g e n i ce f f e c tt ot h ep e a s a n t s ，i nG u i z h o uP r o v i n e ef o rt w e n t yy e a r s ． T h em e c h a n i s mo fc a r c i n o g e n i ce f f e c tw a sn o tc e r t a i nf o rt h el a c ko fa n i m a l m o d e la n dt h ed i m n e s so ft h em e c h a n i s mo ft o x i ce f f e c t s ．W i t ht h e d e v e l o p i n go ft h es t u d yo nt u m o ri ne p i g e n e t i c s ，t h eh y p e r m e t h y l a t i o no f D N Ap r o m o t e rw a st h o u g h ta so n eo ft h ei m p o r t a n tm e c h a n is m so ft u m o r s u p p r e s s o r g e n e ’Si n a c t i v a t i o na n dt h ea b e r r a n tm e t h y l a t i o no fD N A p r o m o t e rw a sa ne a r l ya n df r e q u e n tp h e n o m e n o ni nt u m o r i g e n e s i s ．T h e m e t h y l a t i o nm e t a b o l i s mo fi n o r g a n i ca r s e n i cc o u l di n t e r f e r ew i t ht h eD N A m e t h y l a t i o na n dr e s u l t e di nD N Aa b e r r a n tm e t h y l a t i o nw h i c hw a sp r o v e d b yt h er e c e n ts t u d y ．T h er e l a t i o n so fe f f e c tc a u s eb ya r s e n i ct oD N A m e t h y l a t i o na n dc a r c i n o g e n i ce f f e c tb ya r s e n i cw a sc o n c e r n e db ym o r e s c h o l a r s ．T h em o s to fr e c e n ts t u d i e sw e r ea n i m a lt e s t sa n di nv i t r ot e s t s ， t h es t u d ya b o u th u m a nw a sf e w ．T h es t u d yw a so nt h eb a s i so fe p i d e m i o l o g y 7 i n V e s t i g a t i o n ．T h em e t h y l a t i o no f t u m o rs u p p r e s s o rg e n e ’ Sp r o m o t e r a n dt h eD N A e x p r e s s i o n s o ft u m o r s u p p r e s s o rg e n e a n dD N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s D N M T S w e r ed e t e c t e d ．T h ee f f e c t so fm e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n ea n de x p r e s s i o no fD N A m e t h y l t r a n s f e r a s e sc a u s e db yc o a l b u r n i n ge n d e m i ca r s e n i s mw e r e d i s c u s s e da n da st h eb a s i so fs t u d yo nt h ec a r c i n o g e n i cm e c h a n i s mo f ● ’ a r S e n l C ． M e t h o d s 1Af i e l de p i d e m i o l o g yi n v e s t i g a t i o no nt h ec o a l b u r n i n ga r s e n i s m ， i n n e rc o n t r o la n do u t e rc o n t r o li nG u i z h o up r o v i n c e ． 2T od e t e c tt h em e t h y l a ti o no ft h ep e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e s ’t u m o r s u p p r e s s o rg e n ep 1 6 ，p 1 5a n d R A S S F l A b ym e t h y l a ti o n s p e c if i c p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n M S P a n da n a l y z et h ei n f l u e n c ef a c t o r st o t h em e t h y l a ti o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e s ． 3T od e t e c tt h ee x p r e s s i o n so ft h ep e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e s ’t u m o r s u p p r e s s o rg e n ep 1 6 ，p 1 5a n d R A S S F l A b y r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n R T P C R a n da n a l y z et h ei n f l u e n c ef a c t o r s t ot h ee x p r e s s i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e s ． 4T od e t e c tt h ee x p r e s s i o no ft h ep e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e s ’D N M T S b yR T P C Ra n da n a l y z et h ei n f l u e n c ef a c t o r s t ot h ee x p r e s s i o no f D N M T S ． R e s u l t s P a r t1As t u d yo nt h em e t h y l a t i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e sc a u s e d b y c o a l b u r n i n ge n d e m i ca r s e n i s m 8 1T h em e t h y l a t i o np o s i t i v er a t e so fp 1 6 ，p 1 5a n dR A S S F l Ai nc a s eg r o u p w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni n t e rc o n t r o lg r o u pa n do u t e rc o n t r o l g r o u pa n dt h em e t h y l a t i o np o s i t i v er a t e sw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s i n g a c c o r d i n gt ot h es e v e r i t yo fa r s e n i s m P O ．0 1 ． ● 2 T h e yw e r en o tt h ei n f l u e n c ef a c t o r st ot h em e t h y l a t i o no fp 1 6 ，p 1 5b y s e p a r a t e l ya n a l y z i n gt h ee f f e c t so fg e n d e r ，a g e ，n a t i o n ，r e s i d e n t i a l t i m e ，e d u c a t i o nd e g r e e ，s m o k i n g ，d r i n k i n g ．A g ew a st h ei n f l u e n c ef a c t o r t ot h e m e t h y l a t i o no fR A S S F l A ．A v e r a g ea g e o ft h e mw h o s et u m o r s u p p r e s s o rg e n eR A S S F l Aw a sh y p e r m e t h y l a ti o nw a so l d e rt h a n t h e m w h o s et u m o r s u p p r e s s o r g e n e R A S S F I Aw a s n ’t h y p e r m e t h y l a t i o n P O ．0 5 ．A g ew a sp o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t he x p r e s s i o no fp 1 5g e n e P O ．0 5 a n dn e g a t i v e l y c o r r e l a t e dw it he x p r e s s i o no fR A S S F l Ag e n e P O ．0 5 ． 3S e v e r i t yl e v e lo fa r s e n i s ma n de d u c a t i o nd e g r e ew e r ei n f l u e n c e f a c t o r st ot h ee x p r e s s i o no fp 1 6b ym u l t i v a r i a t e1i n e a rr e g r e s s i o n a n a l y s i s ，s t a n d a r dr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t s b ’ w e r e 一0 ．1 9 1a n d 0 ．1 4 4 r e s p e c t i v e l ya n dPv a l u e sw e r e0 ．0 1 0a n d0 ．0 5 0r e s p e c t i v e l y ． T h ee x p r e s s i o no fp 1 6w a sd e c r e a s i n gw i t ht h es e v e r it yl e v e lo f a r s e n i s ma n di n c r e a s i n gw i t he d u c a t i o nd e g r e e ．A g ew a si n f l u e n c e f a c t o rt ot h ee x p r e s s i o no fp 1 5b ym u l t i v a r i a t el i n e a r r e g r e s s i o n a n a 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