复合垂直流人工湿地污染物去除特征及微生物群落多样性分析.pdf

复合垂直流人工湿地污染物去除特征及 微生物群落多样性分析 刘志伟1周美修2宋俊玲1郭志伟1 1. 郑州大学综合设计研究院， 郑州 450002; 2. 重庆大学城市建设与环境工程学院， 重庆 400045 摘要 采用复合垂直流人工湿地系统对生活污水进行处理， 研究该系统对污水中主要污染物的去除效果， 并用 PCＲ- TGGE 技术分析了湿地系统中微生物群落结构组成的多样性。结果表明 污染物浓度沿水流方向呈下降趋势， 氨氮 NH 4－N 、 总氮 TN 、 总磷 TP 和生化需氧量 COD 平均去除率分别为 59. 5、 67. 5、 75. 6、 62. 3。溶解氧 DO 沿程逐渐降低， 但在末端略有上升， pH 基本维持在 7. 72 ～8. 04， 处于略偏碱性状态， 污染物的去除效果良好; 由 于湿地系统中环境条件和营养水平的变化， 在湿地系统的不同位置微生物种群存在共同种属和各自的特异种属， 且微 生物多样性指数从 A1 池至 A3 池沿程逐渐降低， 群落结构间的相似性逐渐增大; 系统中污染物去除与微生物多样性 呈正相关关系。 关键词 人工湿地; 生活污水; 温度梯度凝胶电泳; 微生物多样性 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201406010 POLLUTANTS ＲEMOVAL CHAＲACTEＲISTICS AND ANALYSIS OF MICＲOBIAL COMMUNITY DIVEＲSITY IN INTEGＲATED VEＲTICAL- FLOW CONSTＲUCTED WETLAND Liu Zhiwei1Zhou Meixiu2Song Junling1Guo Zhiwei1 1. Zhengzhou University Multi- Functional Design and Ｒesearch Academy，Zhengzhou 450002，China; 2. Faculty of Urban Construction and Environmental Engineering，Chongqing University，Chongqing 400045，China AbstractThe technology of integrated vertical- flow constructed wetland IVCWwas used to treat sewage and studied the removal efficiency of major pollutant with the introduction of PCＲ- TGGE technology;the diversity of microbial community structure in IVCW was analyzed． The results indicated that TN， TP， COD and NH 4－N decreased along the direction of water flow in IVCW and the average removal rate was 59. 5，67. 5，75. 6 and 62. 3 respectively． The DO value also decreased，but it increased a little in the end of A3． pH maintained between 7. 72 and 8. 04 and in slightly alkaline condition and pollutant removal efficiency was good． Since environmental condition and nutrition changed in wetland systems，there existed some common species and specific species at different locations，microbial diversity index decreased along the direction of water flow from A1 to A3 in IVCW，the structure similarity gradually increased． Pollutant removal efficiency was positively correlated with the microbial community diversity． Keywordsconstructed wetland;domestic sewage;temperature gradient gel electrophoresis;diversity of bacteria community 收稿日期 2013 －09 －27 0引言 人工湿地处理技术是基于生态工程的方法， 在一 定的填料上种植特定湿地植物， 建立起人工湿地生态 系统。人工湿地因具有管理简单、 运行费用低廉、 生态 景观相容性好等优点 ［ 1- 5 ］， 已经广泛应用于生活污水、 景观水体、 矿山废水以及富营养化水体水质净化等方 面 ［ 6- 9 ］。微生物作为人工湿地的重要组成部分， 对有机 物和氮的去除有着重要作用 ［ 10 ］。王晓丹等［ 11 ］提出， 湿 地系统中微生物数量、 细菌多样性及优势群落与有机 物、 氮和磷的去除密切相关。梁威等 ［ 12 ］发现湿地中微 生物与其净化功能之间存在显著关系。魏成等 ［ 13 ］发 现通过不同植物组合而成的湿地系统， 可提高根际微 生物群落功能多样性， 从而提高人工湿地污染物净化 83 环境工程 Environmental Engineering 的效率和稳定性。付融冰等 ［ 14 ］证实了微生物数量与 BOD5及 TN 的去除有显著关系。本试验通过构建多 级复合垂直流人工湿地， 以风车草、 美人蕉、 菖蒲为湿 地植物， 研究湿地对 COD、 氮、 磷污染物的去除效果， 并 采用 PCＲ- TGGE 法分析湿地微生物种细菌种群结构沿 程变化， 探讨多级复合垂直流湿地中微生物多样性与 污染物去除的关系， 以期在该种湿地的运行方面提供 一定的理论和技术支持。 1试验部分 1. 1试验装置 试验复合垂直流人工湿地系统如图 1 所示， 试验 装置共设置三级湿地， 每级湿地之间采用集水井连 接。湿地底部采用混凝土结构， 四周为砖混结构， 构 筑物整体采用防水水泥进行防渗处理。第一级和第 三级湿地床采用上方布水进水， 下方集水出水的方 式。第二级湿地中部设有挡水墙， 经第一级处理后的 出水下行跌落进入该级湿地， 经挡水墙底部过水孔上 行至顶部后， 由出水堰出水进入第三级。三级湿地床 尺寸、 填料装填及植物栽种情况如表 1 所示。 图 1复合垂直流人工湿地 Fig．1Integrated vertical- flow constructed wetland 表 1人工湿地各单元构筑物参数 Table 1Design size of different parts of constructed wetlands 项目第一级 A1第二级 A2第三级 A3 尺寸1. 0 m 1. 0 m 1. 2 m 1. 5 m 1. 0 m 1. 5 m 2. 0 m 1. 0 m 1. 0 m 填料陶粒陶粒钢渣 填料厚度/m0. 7 0. 90. 5 植物风车草美人蕉菖蒲 植株密度/ 株 m－2161616 1. 2微生物样品的采集和测定 本试验中多级复合垂直流人工湿地系统已经运 行近一年时间， 平均水力负荷为 0. 63 m3/ m2d 。 试验进水采用经生化池处理后的重庆大学校园污水， 进水水质见表 2。 试验期间， 对人工湿地三级 A1、 A2 和 A3 中含 表 2人工湿地进水水质 Table 2Inflow water quality of the constructed wetland system 温度/ ℃ pH ρ DO / mg L －1 ρ COD / mg L －1 ρ 氨氮 / mg L －1 ρ 总氮 / mg L －1 ρ 总磷 / mg L －1 24. 5 7. 892. 35170. 8649. 7957. 943. 76 有微生物的填料的取样， 考虑 A2 由上行池和下行池 构成， 故对 A2 池分别取样 即 A2. 1 和 A2. 2 。为保 证所取样品应该具有代表性， 试验在各级湿地床内均 匀布置 6 个取样点， 在各个取样点水面以下 10 ～ 15 cm处分别取 100 mL 填料， 混合均匀成独立样品后 装入保鲜袋， 并放置于 4 ℃环境中冷藏备用。 样品预处理 先称取样品 100 g 置于 250 mL 烧 杯中， 加入无菌超纯水， 用 100 Hz 的超声波滤池振荡 约3 h， 接着用无菌纱布滤掉沉淀物， 最后将滤液置于 50 mL 的无菌离心管中， 在 5 000 r/min 的转速下离 心 10 min， 取沉淀保存备用。 微生物 DNA 提取 将样品用 DNA 纯化试剂盒进 行纯化 上海生工生物公司所购 SK1131 的 PCＲ 产物 纯化试剂盒 ， 对纯化后的 DNA 进行电泳分析， 效果 较好的进入 PCＲ 反应。 PCＲ 扩增 16S rDNA V3 区扩增参见文献［ 15］ ， 使用的引物为 F341- GC 与 Ｒ518。 TGGE 分 析 将 获 得 的 PCＲ 产 物 进 行 PCＲ- TGGE， 试验中 TGGE 电泳所用的胺胶浓度为 8 mg/mL 。其中， 丙烯酰胺/甲基双丙烯酰胺质量比为 37.5∶1， 温度梯度为 42 ～60 ℃， 电泳时间为 18 h ［ 16- 17 ］。 TGGE 电泳程序参见文献［ 18］ 。电泳结束后， 凝胶立 即银染。TGGE 指纹图谱采用 Quantity One 4. 6. 2 进 行分析。 1. 3PCＲ- TGGE 指纹图谱分析 微生物群落多样性指数采用 Shannon- Weaver 指 数 H 表示， 其表达式见式 1 H －∑ s i 1 ni N ln ni N 1 式中 S 为每个样品的条带数目; ni为第 i 种种群的个 体数; N 为种群中的个体总数。 用 PASW Statistics 18. 0 软 件 分 析 数 据，用 Microsoft Excel 2007 软件绘图。用 Pearson 检验方法 检验水平为 P ＜0. 05 和 P ＜0. 01 检验数据间的相 关水平。Pearson 相关系数用于表征比较对象之间的 相关关系。 93 水污染防治 Water Pollution Control 2结果与讨论 2. 1污染物质量浓度及其他理化参数的沿程变化 湿地系统中 TN、 TP、 COD 和 NH 4 －N 的沿程变化 如图 2图 5 所示。 图 2人工湿地对总氮平均去除效果 Fig． 2Average removal efficiency of TN in constructed wetland 图 3人工湿地对总磷平均去除效果 Fig．3Average removal efficiency of TP in constructed wetland 图 4人工湿地对 COD 平均去除效果 Fig． 4Average removal efficiency of COD in constructed wetland 由图2图5 可以看出 湿地系统中污染物浓度 沿程逐渐降低。当污水流经湿地时， 大部分污染物已 被去除， TN、 TP、 COD、 NH 4 －N 的平均去除率分别是 59. 5、 67. 5、 75. 6、 62. 3， 这与李秋华、 刘送平等 人在利用复合垂直流人工湿地净化城镇生活污水的研 究结果相一致 ［ 19 ］。污染物主要通过基质、 微生物和植 物的协同作用被去除。有机物通过好氧、 兼氧以及厌 图 5人工湿地对氨氮平均去除效果 Fig．5Average removal efficiency of NH 4－N in constructed wetland 氧微生物的作用被降解， COD 的去除主要在 A1 反应 池进行， 去除率高达 40. 9， 经 A2、 A3， 最终出水 COD 为41. 3 mg/L。TN 和 NH 4 －N 通过微生物脱氮、 植物 富集以及基质的吸附作用逐渐被去除。通过实验发现 A3 对 TN、 NH 4 －N 的去除效果明显， 去除率分别为 23. 11、 34. 63。TP 通过基质的吸附、 沉淀以及植物 的吸收作用， 沿程逐渐降低， 出水 TP 为1. 3 mg/L。 由图 6 可以看出 进入湿地系统中生活污水的 DO 沿程逐渐降低， 这主要是因为微生物的生理活动 如微生物异养代谢、 硝化作用等 消耗了 DO。但在 湿地系统末端 DO 略有上升， 这可能是由于污染物质 量浓度较低， 好氧降解趋缓， 而植物根系释氧作用以 及上行池表层的大气复氧作用 ［20 ］， 使得 DO 出现了 一定的回升， 这与文献［ 21］ 的研究结论相一致。 图 6各级人工湿地出水 DO 和 pH Fig． 6The effluent DO and pH in every stage of constructed wetland pH 基本保持在 7. 72 ～ 8. 04， 为偏碱性状态， 能 有效的维持微生物生活环境酸碱度的相对稳定， 适宜 多数微生物的生长。 2. 2微生物群落指纹图谱分析 湿地系统中不同位置的基质样品 TGGE 分离图 谱如图 7 所示。图谱中， 条带的位置、 亮度以及数目 各有不同， 例如 A1 有 29 条泳道， A2. 1 有 26 条泳道， A2. 2 有 24 条泳道， A3 有 30 条泳道， 这主要是由微 04 环境工程 Environmental Engineering 生物所处的营养水平和环境条件存在差异引起的。 不同样品泳道有一些共同的条带， 例如 A1、 A2、 A3 都 含有泳道 1、 9、 13， 表明这些样品中含有一些共同细 菌类型; 同时不同样品泳道条带数目、 位置也存在不 同， 例如 A2. 1 和 A2. 2 二者存在 18 个条带不相同， 差异显著， 表明这些样品含有不同细菌类型; 同一位 置， 有些条带变弱甚至消失， 表明这些细菌类型因环 境变化数量减少或者消亡， 相反， 有些条带亮度增强， 表明这些细菌随环境变化数量增多， 生存能力变强。 总之， 人工湿地填料样品的 TGGE 图谱中均含有较多 的共同条带和不同条带， 人工湿地系统内细菌种群丰 富。但每一级湿地又因为营养水平和环境条件的差 异使得每一级存在差异。 图 7各级湿地填料样品 TGGE 指纹图谱 Fig．7TGGE fingerprints of carrier samples in every constructed wetland 由表 3 得出 沿水流方向， 因环境条件和营养水 平差异越来越大， 各样品间的相似性也越来越低， 如 A1 和 A2 的相似性明显大于 A1 和 A3 的相似性。 A2. 2 跟 A3 的相似性大于 A2. 1 跟 A3 的相似性， 原 因可能是当水流经 A2 上行池到 A3 池时， 污染物质 量浓度已经较低， 污染物浓度、 DO 以及 pH 的变化较 为平缓， 微生物所处的环境条件比较接近， 导致细菌 种群结构变化不大。A2. 1 与 A2. 2 的相似性不高， 原 因可能是下行池消耗了大量的 DO， 致使上行池中 DO 一直较低， 导致下行池中有氧细菌数远多于上行 池中有氧细菌数。同时， 两者营养物质浓度的差异也 可能导致其二者细菌种群发生变化， 菌群结构呈现多 样性。 2. 3微生物群落多样性指数分析 由式 1 计算得到的基质样品 H如图 8 所示。 由图 8 可知 在湿地系统中， 微生物的多样性沿程出 表 3各级湿地样品 TGGE 相似系数 Table 3Similarity coefficient of TGGE samples in every constructed wetland 基质样品A1A2. 1A2. 2A3 A1100 A2. 161. 3100 A2. 260. 346. 3100 A358. 255. 259. 8100 现较为明显的变化， 具体表现为 由 A1 池到 A2 池， 微生物多样性变化显著， A1 的 H 3. 36 最高， 随着 水力停留时间的延长， 至 A2 下行池时 H降为 3. 24; A2 上行池至A3 池， H变化不明显， H从3.17 变为3.15。 图 8各级湿地样品 Shannon 指数 Fig．8Shannon index of samples in every constructed wetland 根据相关性分析， COD、 氨氮、 TN 和 TP 的去除效 果与湿地内细菌多样性指数正相关 P ＞0. 05 ， 相关 系数 Ｒ 分别为 0. 298， 0. 563， 0. 904， 0. 652。湿地内 细菌越丰富， 污染物的去除效果越好。 3结论 1在复合垂直流人工湿地中， 污染物、 pH 和 DO 沿程逐渐降低， 但 DO 在末端略有回升。 2在湿地系统中的不同位置， 既存在着共同的 微生物种属， 也存在着各自独特的微生物种属。 3湿地系统中污染物的去除效果和细菌多样性 成正相关。 参考文献 ［1］Inamori Ｒ，Gui P，Dass P，et al． Investigating CH4and N2O emissions from eco- engineering wastewater treatment processes using constructed wetland microcosms［J］ ． Process Biochemistry， 2007， 42 3 363- 373. ［2］Wu H，Zhang J，Li P，et al． Nutrient removal in constructed microcosm wetlands for treating polluted river water in northern china［ J］． Ecological Engineering， 2011， 37 4 560- 568. ［3］Ｒagusa S，Mcnevin D，Qasem S，et al．Indicators of biofilm development 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