贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤的研究.pdf

遵义医学院 硕士学位论文 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤的研究 姓名王琪 申请学位级别硕士 专业生物化学与分子生物学 指导教师黄厚今;李达圣 20070526 贵州地区燃攥型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 主要英文缩写 c o p p e r ／z i n cs u p e ro x i d ed i s m u t a s e ，C u ／Z n - S O D 铜，锌超氧化物歧化酶 c a t a l a s e ，C A T 过氧化氢酶 g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，G S H P x 谷胱甘肽过氧化物酶 m a l o n d i a l d e h y d e ，M D A 丙二醛 r 目c c r s et r a n s f o r m a t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T - P C R 逆转录聚合酶链反应 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R 聚合酶链反应 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S 活性氧簇 l i p i dp e r o x i d a t i o n ，L P O 脂质过氧化物 c o p p e r , C u 铜 z i n c 。Z n 锌 m e s s e n g e rR N A r i b o n u c l e i ca c i d ，m R N A 信使核糖核酸 a t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o p h o t o m c t e ，A A S 原子吸收分光光度计 h i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y , H P L C 高效液相色谱 贵州地区燃媒型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤的研究 ‘中文摘要 目的探讨氧化损伤在燃煤型地方性氟中毒发生发展中的作用，为贵州地区地方 性氟中毒防治提供一定的理论支持。 方法按照历史资料和国家标准，对贵州省毕节地区历史氟病区进行流行病学调 查，并从织金县、金沙县获得氟中毒轻重病例共计1 2 1 例，从毕节市周边农村获 得正常对照2 3 例，搜集上述样本的血清和E D T A ．K 2 抗凝全血。玉米和辣椒氟含 量检测参照食品中氟的测定方法 G B ／T 5 0 0 9 ．1 8 1 9 9 6 ；饮水氟含量检测参照 地方性氟中毒病区饮水氟化物的测定方法 W S ／T 1 0 6 1 9 9 9 ；煤及土壤中总氟 测定参照燃烧水解一离子选择电极法 W S ／T 8 8 1 9 9 6 ；空气氟含量检测参照环 境空气氟化物质量浓度的测定滤膜一氟离子选择电极法 G B ／1 “ 1 5 4 3 4 1 9 9 5 尿氟含量检测参照尿中氟化物测定一离子选择电极法标准 W S ／T8 9 1 9 9 6 ； 采用氧化指标专用测试试剂盒检测血液中的抗氧化物酶铜／锌超氧化物歧化酶 C l l ，Z | 1 一S o D ，谷胱甘肽过氧化物酶 G S H ．P x ，过氧化氢酶 C A T 的活性 以及血清中氧化损伤产物丙二醛 M D A 的含量；采用原子吸收分光光度计 A A S 检测血清中与抗氧化物酶相关的微量元素C u ，Z n 的含量；采用高效液 相色谱法 H P L C 测定血清维生索E 和维生素C 的含量；采用逆转录P C R R T ．P c R 与凝胶电泳分析法检测样品C u ／Z n - S O D 的m R N A 相对表达情况。 结果1 、患者血液中的抗氧化物酶C u ／Z n ．S O D 、G S H ．P x 、C A T 的活性与正常 人比较均下降。其中血液中G S H ．P X 的活性，与正常组之间比较，在金沙、织 金两地的氟中毒患者中下降明显 P O ．0 1 ，两地区的重病组也比轻病组下降明显 P o ．0 1 ，在金沙、织金两地轻病组之间比较，织金地区轻病组酶活性低于盒沙 地区，差异有统计学意义 P 0 ．0 5 ，在两地重病组之间比较，差异没有统计学 意义。各患病组血清中C u ／Z n ．S O D 的活性均低于正常组 P o ．0 1 ，织金地区重 病组血清中C u ／Z n ．S O D 的活性低于当地轻病组 P O ．0 1 ，会沙地区重病组血清 中C u ／Z n S O D 的活性高于织会地区重病组 P o ．0 1 ，盒沙地区重病组血清中 C u ／Z n ．S O D 的活性低于当地轻病组 P o ．0 5 ，但在两地轻病组问比较，差异没 有统计学意义。织金，金沙两地重病组红细胞中C u ／Z n ．S O D 的活性低于正常组 P 0 ．0 5 。但在织金，金沙两地的轻、重病组以及同地区轻、重病组之间比较， 贵，{ f 地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤研究 遵义医学院 差异没有统计学意义。C A T 在血清中的活性各患病组与正常组间比较下降明显 P O ．0 5 。2 、各患病组血清中脂质过氧化产物M D A 的含量比『F 常组显著增加 P o ．0 1 ，金沙、织金地区重病组M D A 含量分别高于当地轻病组 P O ．0 5 ，但是各患病组与正常组相比，血清 中锌元素锌含量显著降低 P o ．0 1 。与正常组比较，血清锌铜比值在金沙、织 金两地的重病组中升高 P O ．0 5 ，与正常组问比较，两地的各患病组中维生素E 含量下降 P 0 ．0 5 。血 清中维生素c 的含量各患病组均显著低于正常组 P 0 ．0 1 ，金沙地区轻、重病 组血清维生素c 的含量分别高于织金地区相同病情组 P o ．0 5 。4 、地氟病患者 血液中，C u ，z n ．S O D 的基因表达下降。两地轻、重病组同正常组问比较降低明 显 P 0 ．0 5 ，金沙地区重病组C u ／Z n - S O D 的基因表达量与轻病组比较降低明显 P 0 ．0 5 。 结论l 、本实验通过对慢性燃煤型地方性氟中毒患者机体内与抗氧化能力相关 的酶活性、微量元素含量指标进行检测，同时结合流行病学调查资料，证实了燃 煤型地方性氟中毒患者体内同样存在氧化损伤，并与当地生活环境密切相关，为 今后的燃煤型地方性氟中毒防治提供了理论依据2 、本实验首次对氟中毒患者 机体内C u ，Z n ．S O Dm R N A 相对表达量进行检测，发现慢性燃煤型地方性氟中毒 ， 贵州地区璐蠼型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 可以抑制C u ／Z n ．S O D 的m R N A 的表达，减少C u ／Z n S O D 蛋白的产生，降低患 者机体的抗氧化能力，提示了氟可能从分子水平抑制C u ／Z n ．S O D 蛋白的产生从 而影响机体的抗氧化能力，为进一步从明确的量效关系上研究氟对其他抗氧化物 酶基因表达的影响提供了参考。 关键词氟中毒；氧化损伤；原子吸收；逆转录 6 责州地区燃爆型氟中毒人群瓴化损伤研究 遵义医学院 O x i d a n ts t r e s si ng r o u p so fc o a l - b u r n i n g e n d e m i cn u o r o s i si nG U I Z H O U A b s t r a c t o b j e c t i v e T oo b s e r v et h es i t u a t i o no fo x i d a n ts t r e s sa n dg e n ee x p r e s s i o no f C u ／Z n - S O Dm R N Ai ng r o u p so fc o a l - b u r n i n ge n d e m i cf l u o r o s i sf o re x p l o r i n gt h e u n d e r l y i n gm e c h a n i s m so fc o a l - b u r n i n ge n d e m i cf l u o r o s i sa n dp r o v i d i n ge f f e c t i v e p r e c a u t i o nm e a s u r e s ． M e t h o d W i t ht h en a t i o n a ls t a n d a r da n dh i s t o r yd a t e s ，e p i d e m i cr e s e a r c h e sw e r e c a r r i e do u ti nB U I Er e g i o n ．G U I Z H O Up r o v i n c e ．T h ec o n t e n t so fF ‘i nc o r n 、 c a p s i c u m 、a i f 、w a t e r 、f o o d s 、c o a lf r o me n d e m i cr e g i o n sw e r et e s t e di na c c o r d a n c e w i t hn a t i o n a ls t a n d a r dm e t h o d s ；a tt h es a m et i m et h ec o n t e n t so fF ‘i nu r i n ef r o m p a t i e n t sw e r et e s t e db yi r o ns e l e c t i v e l ye l e c t r o d e ．A f t e rb l o o dw h i c hw e r eE D T A ．K 2 a n t i c o a g u l a t o da n ds e r u mf r o mp a t i e n t si nZ H I J I Na n dJ I N S H Ac o u n t ya l o n gw i t h n o r m a lc o n t r o li nB I J I Ec i t y , G U I Z H O Up r o v i n c ew e r ec o l l e c t e d ，t h ea c t i v i t i e so f a n t i o x i d a n tr e l a t e de m z y m ei n c l u d i n gc o p p e r ／z i n cs u p e ro x i d ed i s m u t a s e C u ／Z n S O D ， c a t a l a s e C A T ，g h i t a t h i o n ep e ro x i d a s e G S H - P x w e r et e s t e db yu s i n gs p e c i a lk i t s ； T h es e n l mC o n t e n t so fC u 、Z nw e r e a n a l y z e db y A t o m i cA b s o r p t i o n S p e c t r o p h o t o m e t e r A A S a n dt h a to fm a l o n d i a l d e h y d e M D A w e r et e s t e db yt h e w a yo f M D A t e s tk i t ；t h ec o n t e n t so f v i t a m i nE a n dv i t a m i nCi nb l o o dw e r et e s t e db y u s i n gH P L C ．M e a n w h i l e ，t h ee x p r e s s i o no fC u ／Z n S O Dm R N Ao fp a t i e n t ’Sb l o o d w e r ea n a l y z e dw i t hr e v e r s et r a n s f o r m a t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n R T o P C R a n d e l e e t r o p h o r e s i sb yw h i c ha m p l i f i e dg e n eo fC u ／Z n S o Da n dt h e i rg e li m a g e s c o m p a r e d ．w i t ht h a to f - a c t i nw h i c hc h o o s e da sr e f e r e n c e R e s u l t T h ec o n t e n t so f C u 、Z n 、V i t a m i nEa n dV i t a m i nCi nt h e s ee n d e m i cf l u r o s i s p a t i e n t ss e r u m sd e c r e a s e d 鹄w e l la st h ea c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e sa l s o d e c r e a s e dc o m p a r e d 而t l lt h a to fn o r m a lg r o u p 1 T h ea c t i v i t yo fG S H P x s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nd i f f e r e n ti l l n e s sg r o u p sc o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p sa n d a l s ot h ea c t i v i t yi ns 纠e r eg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a to fm i l d g r o u pf r o m S a l n ea r e ae x c e p tf o rm i l dg r o u p sf r o md i f f e r e n ta r e a s P o ．0 1 ． 7 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤研究 遵义医学院 M e a n w h i l e ，t h ea c t i v i t yi ns e v e r eg r o u pf r o mZ H I J I Nd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a t o f ∞v e t eg r o u pf r o mJ I N S H A P 0 ．0 5 ． 2 T h ea c t i v i t yo fC A Ts i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e di nd i f f e r e n ti l l n e s sg r o u p sc o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p s P o ．0 1 ． 3 T h e a c t i v i t yo fC u ／Z n S O Di np a t i e n t ’Ss e r u ms i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t I l n o r m a lg r o u p s P 0 ．0 1 ，t h ea c t i v i t yi ns e v e r eg r o u pf r o mZ H I J I Nd e c r e a s e dm o r e t h a nt h a to fJ I N S H A P o ．0 1 ，w h i l e ，i nm i l dg r o u pf r o mZ H I J I N ，t h ea c t i v i t ya l s o d e c r e a s e dm o r et h a nt h a to fJ I N S H A P 0 ．0 5 ．A l s o ，i nZ H I J I Na r e a ，t h ea c t i v i t yi n s e v e r eg r o u pd e c r e a s e dm o r et h a nt h a to f m i l dg r o u p P 0 ．0 1 ，a to n e t i m e ，i nJ I N S H A a r e a ，t h ea c t i v i t yi ns e v e r eg r o u pd e c r e a s e dm o r et h a nt h a to f m i l dg r o u p P o ．0 5 ． 4 T h ea c t i v i t i e so fC u ／Z n S O Di nb l o o dw e r et h a to n l ys e v e r eg r o u p sf r o mt w oi l l n e s s a r e a sh a v en o t a b l es t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p s ，P 0 ．0 5 。 5 T h ec o n t e n to fM D Ai np a t i e n t ’Ss e r n ms i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hn o r m a l g r o u p s 伊 o ．0 1 ．T 1 l ec o n t e n ti ns e v e r eg r o u pf r o mZ H I J I Ni n c r e a s e dm o r et h a nt h a t o f m i l dg r o u p P o ．0 1 ，w h i l e ，i nm i l dg r o u pf r o mJ I N S H A ，t h ec o n t e n ti n c r e a s e dl e s s t h a ns e v e r eg r o u p P O ．0 5 ．M i l dg r o u pf r o mf r o mZ H I J I Ni n c r e a s e dm o r et h a nt h a t o fJ I N S H A P o ．0 1 ． 6 T h ec o n t e n to fC u 、Z ni np a t i e n t ss e r t l m sr e m a r k a b l e d e c r e a s e dc o m p a r e d 谢t hn o r m a lg r o u pp o ．0 1 ．T h ec o n t e n to fC ui ns e v e r eg r o u p s w a sl e s st h a nt h a ti nm i l dg r o u p sr e s p e c t i v e l yw h i c hc a m ef r o ms a m ee n d e m i ca r e a P o ．0 1 ．T h er a t i oo f Z r d C ui n c r e a s e di ns e v e r eg r o u p sc o m p a r e d 谢t I ln o r m a lg r o u p P o ．0 5 ．M e a n w h i l e ，T h er a t i oo fZ r d C ui n c r e a s e di ns e v e r eg r o u pm o r et h a nm i l d g r o u pi nZ H U I N P o ．0 5 ． 7 Q u a n t i t i e so fv i t a m i nEa n dv i t a m i nCi ns e r u m s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di ni l l n e s sg r o u p sc o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p ，e s p e c i a l l yi n s e v e r eg r o u p sa n da l s ot h eq u a n t i t i e so fv i t a m i nCi ns e v e r eg r o u ps i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e dc o m p a r e d 、Ⅳi t ht h a to fm i l dg r o u pf r o ms a m ea r e ae x c e p tf o rv i t a m i nE P 0 ．0 1 ． 8 T h er e l a t i v e l ye x p r e s s i o nl e v e l so f C u ／Z n S O Dm R N Am i l d l yd e c r e a s e d i n p a t i e n t sg r o u p sc o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p ．M e a n w h i l e ．t h i sr e l a t i v e l y e x p r e s s i o ni nm i l dg r o u pd e c r e a s ec o m p a r e dw i t hs e v e r eg r o u pw h i c hc a m ef r o m J I N S H A a r e a P o ．0 5 ，e x c e p tf o ro t h e rg r o u p s ． C o n c l u s i o n l 、T h ee x p e r i e n c ew h i c ht e s t e dt h er e l a t i v e l y c o n t e n t sr e l a t e dt o a n t i o x i d a n ts y s t e m so fb o d yi nC h r o n i cc o a l - b u r n i n ge n d e m i cf l u o r o s i sa n da n a l y z e d R 责} I f 地区燃攥型氟中毒人群氧化损伤研究 遵义医学院 t h e s er e s u l t sw i t he p i d e m i c a lr e s u l t st o g e t h e rc o n f i r m e dt h a tC l l r o m cc o a l b u r n i n g e n d e m i cf l u o r o s i si n d e e dh a r m e da n t i o x i d a n ts y s t e m sa n da l s or e l a t e dt of o o d sa n d a t m o s p h e r ei nt h e s ea r e a s ．A l lo ft h e s er e s u l t sc a r lp r o v i d et h e o r e t i c a l l yg u i d et ot h e p r e v e n t i o n so fC l l r o m cc o a l b u r n i n ge n d e m i cf l u o r o s i s ．2 、1 1 1 e t r i a lt e s t e dt h e e x p r e s s i o no fC u ，z n S O Dm R N Ai nC l l r o m cc o a l b u r n i n ge n d e m i cf l u o r o s i sf o rt h e f i r s tt i m ea n df o u n dt h a tF ‘C a ni n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fC u ／Z n S O Dm R N A ，t h e r e b y r e d u c e dt h ep r o d u c t i o no fC u ／2 r m S O Dp r o t e i n ．c o n s e q u e n t l yc u td o w nt h ea b i l i t yf o r a n t i o x i d a n ti np a t i e n t s ．T h i sr e s u l tp r o v i d e dg u i d e l i n ef o rt h ef u r t h e rs t u d yi ne x a c t l y d o e s e f f e c tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nF 。a n de x p r e s s i o no fo t h e ra n t i o x i d a n te n z y m e sa t m o l e c u l a rl e v e Ii nt h ef u t u r e ． K e yw o r d s E n d e m i ct l u o r o s i s ；C u ／z 小S O DmR N A ；A n t i o x i d a n tE n z y m e ；R T - P C R ； T r a c ee l e m e n t 9 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 前言 氟作为一种微量元素，过去多关注缺氟与龋齿的关系和高氟引起的氟斑牙与 氟骨症，氟化物与自由基关系的研究始于近二十多年。氟中毒动物和人群抗氧化 酶系统异常国外报道较早。C u r n u t t e [ 1 1 等人首次意外发现，在培养基中加入2 0 m l 的N a F ’使多形核白细胞产生0 2 ’的速度比对照组高出2 0 倍。在肝匀浆中加入 N a F 0 ．2 5 - 2 ．2 5 m g ／m l ，引起脂质过氧化显著增加，而在2 ．2 5 m g 时转为抑制作用。 R z e u s k i [ z ] 等曾于1 9 9 8 年在氟研究权威期刊F l u o r i d e 就氟化物与自由基反应发表 过述评，认为氟化物的浓度决定了所产生的自由基的种类。 王志成【3 】等人在国内首先提出氟中毒与自由基有关，认为过量的氟影响体内 很多氧化还原酶的生物活性，干扰体内氧化与抗氧化系统的平衡。使体内起抗氧 化作用的S O D 、G S H P x 等酶的生物活性受抑制。使自由基在体内大量蓄积而 致脂质过氧化作用增强，其中间产物丙二醛 M D A 可交链蛋白质和磷脂的氨 基，使膜性结构的脆性增加。黄冶森[ 4 1 等报道氟中毒大鼠肝、血清、红细胞G S H ．P x 活性降低，王志成分析了氟中毒时抗氧化酶活性、G S H 、v i t E 、M D A 水平以及 有关微量元素含量。近年氟引起人和实验动物脂质过氧化的文献大量出现，众多 实验研究发现氟可对动物多种组织产生脂质过氧化损伤【5 。”。边建朝f 1 2 1 等报道， 无论氟中毒患者还是实验氟中毒大鼠血液、肝、肾等组织抗氧化能力降低，脂质 过氧化物L P O 和自由基含量升高，服硒可拮抗高氟的这一作用。梁刚等给大鼠 饮用含1 5 0 m g ／L 氟化钠的蒸馏水，1 2 周后大鼠血清、肝脏、肾脏、脑等多脏器 组织中M D A 含量显著增加，全血、肝脏、肾脏、心脏、睾丸组织中的S O D 活 性显著降低全血G S H - P X 活性降低。进一步证明了氟可促进机体脂质过氧化， 抑制抗氧化酶的活性。 此外，氟中毒在人体内引起氧化应激反应也有相关的报道[ | 3 - 1 4 ] 。I n g d d a 。5 1 等对培养的人神经元细胞加氟，发现细胞出现了氧爆发现象，活性氧明显增多， W a n g i t 6 ] 等研究了氟对人胚胎肝细胞的脂质氧化损伤的情况，以及对D N A 和对细 胞凋亡的影响，发现氟可引起培养细胞膜脂质氧化损伤，造成D N A 损伤，并促 进细胞凋亡，印度学者S h a n t h a k u m a r i [ “ l 研究了印度T a m i l 地区饮水型氟中毒人 群血液中的氧化损伤情况，证实了氧化损伤的情况在人体内确实存在，我国学者 陈百炼I l8 】等重点研究了慢性饮水型氟中毒患者红细胞膜脂质的变化，也证实了 1 0 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 氧化损伤的存在，于燕妮 1 9 1 等研究了贵州地区燃煤型氟中毒患者血液中抗氧化 系统的变化，同样发现抗氧化物酶活性下降，脂质氧化产物含量增加。 总之，国内外对慢性氟中毒与氧化应激关系的研究，人群观察对象涉及燃煤 污染型和饮水型地方性氟中毒患者；动物实验对象包括大鼠，小鼠等有些试验 还使用了体外细胞培养检测样品有全血或血清，红细胞，肝。脑，肾等；观测 指标有多种抗氧化酶 G S H - P X ，S O D 等 活性、G S H 、V E 、脂质过氧化物水 平以及有关微量元素含量；还进行了一系列针对自由基与氧化应激的阻断或拮抗 试验。从这些研究可以看出，不同的研究者试验结果多数一致，即无论氟中毒患 者还是染毒动物基本上都是抗氧化酶活性下降，脂质过氧化产物升高。人体材料 和动物实验资料表明，慢性氟中毒时确实有自由基增多和氧化应激反应1 2 0 1 。 同时，近年随着基因表达研究技术的发展，有关抗氧化酶的基因表达研究也 成为热点。研究多集中在S O D ，G S H ．P X 以及硫氧还蛋白还原酶 T R 1 2 1 1 等在 不同组织的表达情况与临床相关疾病的关系。例如钟绮丽f 2 2 1 等研究了超氧化物 歧化酶在人表皮肿瘤组织中的表达朱保平【2 3 1 等在研究大鼠生殖系统损害时， 同时检测了三种主要的抗氧化物酶- C A T ，G S H ．P X ，S O D 的基因表达情况。总之， 不管是在动物实验还是在人群试验，抗氧化物酶的活性降低，同时伴有相应基因 表达的下降。 贵州省是全国最严重的地氟病省份，病区主要分布在省境内中部、西北部和 西南部的产煤区。2 0 0 1 2 0 0 3 年全省地氟病流行病学抽样调查显示，我省地氟病 在总体病情减轻的同对．尚存5 5 5 3 个重病村 G B l 7 0 1 8 - - 1 9 9 7 地氟病划分标准， 缺损型氟斑牙检出率大于4 0 ％，X 线重度氟骨症检出率大于2 ％，人群嗣均总摄氟 量大于7m g 的地氟病村为重病区 ，占调查总村数的4 4 ％【2 4 1 。重病区村民深受氟 中毒困扰，因病致贫、因病返贫现象极为普遍，己严重制约着当地的经济社会发 展，是地氟病控制工作的难点和重点。 本次试验希望通过氟中毒人群血液样本采集，运用已发展完善的分子生物学 技术，从整体水平上研究S O D ，G S H ．P x 等抗氧化物酶在贵州省地方性氟中毒流 行区内居民不同性别、不同年龄间的活性差异以及基因表达差异，进一步了解氟 中毒发病机制中环境基因的交互作用，为贵州地区氟中毒防治和毒性评价提供新 的依据和思路。 贵州地区燃煤型氟中毒人群氧化损伤研究遵义医学院 流行病学调查 材料与方法 1 ．流行病学研究对象 以国家地氟病区划分标准 G B l 7 0 1 8 - - 1 9 9 7 、历史调查资料及2 0 0 1 2 0 0 3 年全省地氟病调查结果为依据，选择织金县城关镇荷花村、金沙县高坪乡联合村、 毕节市吉场乡吉坪村和吉丰村作为历史特重病村，选择织金县城关镇杨柳村、金 沙县城关镇院子村作为对照村，对上述6 个村的村民进行了流行病学调查研究。 2 ．流行病学调查内容 2 ．1 相关一般情况调查用统一调查表，采用村民座谈会、询问法和现场查看方 式开展调查，失访率不高于2 0 ％。主要调查内容地理位置、人口与住房结构、 经济文化状况、燃煤方式、燃煤类型及用量、拌煤粘土使用情况、食物干燥及贮 存方式等。 2 ．2 氟斑牙检查氟斑牙按D e a n 氏分级标准，由受训专业人员实施，自然光线 下逐颗检查受检者牙齿，以损害最重的牙齿分级记录；受检者为8 1 2 岁儿童及 1 6 岁以上成人。 2 ．3 氟中毒临床症状体征个案调查重病村的估计氟中毒临床症状体征阳性率在 8 0 ％以上，中病村和轻病村分别为6 0 ％、4 0 ％，根据公式计算出各村的个案调查 样本含量。按此样本量，按照地方性氟中毒防治手册 卫生都地病所，1 9 9 1 氟申毒临床症状体征诊断标准，对1 6 岁以上成人做健康检查，并进行氟中毒临 床症状体征的检查诊断，并随机抽取1 0 ％的人进行重复调查，以确保调查的准确 性。 2 ．4 氟骨症临床诊断在上述接受氟中毒症状体征检查的人群中，按病情和年龄 抽样作x 线拍片检查。氟中毒临床症状体征分