燃煤污染型氟中毒对大鼠睾丸组织凋亡相关基因蛋白表达的影响.pdf

2 5 4 主堡垫直瘟堂盘查垫 』堡垒旦垫旦复3 垒鲞笠垒塑￡照鱼』星壁d ￡迦丑，△P 亘 垫，垫1 5 ，y 尘丝，奠Q 燃煤污染型氟中毒对大鼠睾丸组织 凋亡相关基因蛋白表达的影响 肖跃海田源孙发李崇斌唐开发孙超 余琦石家齐 谷江 官志忠 【摘要】目的研究燃煤污染型氟中毒对大鼠睾丸B 细胞淋巴瘤／8 细胞．2 B ．c e l ll y m p h o m a ／l e u k e m i a ． 2 ，B c l ．2 、B 细胞淋巴瘤／白细胞基因伴随蛋白x B c l ．a s s o c i a t e dxp r o t e i n ，B a x 蛋白表达的影响，探讨氟中毒所 致睾丸生殖毒害的机制。方法将4 0 只雄性S D 大鼠按照体质量，采用随机数字表法分为4 组对照组。低、 中、高氟组，每组l O 只。低、中、高氟组分别喂饲含氟2 0 、4 0 、6 0 m s ／k s 的饲料，对照组喂饲常规大鼠饲料 含氟 1 ．3m g ／k g 。每组大鼠在1 2 0 、1 8 0d 时股动脉放血法各处死5 只。在处死前。观察氟斑牙的发生率及程度，收集 大鼠2 4h 尿液，用氟离子选择电极法检测大鼠尿氟；取大鼠睾丸组织，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 口末端标记法 T U N E L 法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡情况并计算凋亡指数 A I ；采用免疫组化S P 法检测B c l ． 2 、B a x 蛋白表达水平。结果在1 2 0 、1 8 0d ，低、中、高氟组所有大鼠均出现不同程度的氟斑牙，而对照组未检 出。在1 2 0 、1 8 0d ，对照组、低、中、高氟组大鼠尿氟[ 1 ．6 9 0 ．0 3 、 3 ．5 6 0 ．1 0 、 1 2 ．0 9 - I - 0 ．3 8 、 2 3 ．5 5 0 ．3 3 m s ／L ； 1 ．7 1 0 ．0 9 、 4 ．0 7 0 ．2 5 、 1 6 ．2 3 0 ．2 8 、 2 8 ．4 4 O ．5 0 m g ／L ] 均依次增高 P 均 0 ．0 5 ；低、中、高 氟组大鼠在1 8 0d 尿氟均高于1 2 0d P 均 0 ．0 5 。在1 2 0 、1 8 0d 。对照组、低、中、高氟组大鼠睾丸生精细胞凋 亡指数[ O ．4 6 0 ．1 1 ％、 8 ．8 3 1 ．6 4 ％、 1 7 ．2 4 3 ．9 6 ％、 4 4 ．2 1 7 ．8 5 ％； 0 ．5 4 0 ．1 1 ％、 1 0 ．4 1 2 ．7 0 ％、 2 2 ．2 3 3 ．9 6 ％、 4 9 ．6 2 4 ．7 7 ％] 依次增加 P 均 0 ．0 5 ；低、中、高氟组，大鼠睾丸组织生精细胞凋 亡指数在1 8 0d 均高于1 2 0d P 均 0 ．0 5 。在1 2 0 、1 8 0d ．对照组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织B c l ．2 蛋白表达 的平均光密度值 0 ．1 8 3 0 ．0 0 7 、0 ．1 6 5 0 ．0 0 7 、0 ．1 5 2 0 ．0 0 3 、0 ．1 4 3 0 ．0 0 7 ；0 ．1 8 4 0 ．0 0 6 、0 ．1 5 9 0 ．0 1 1 、 0 ．1 5 1 0 ．0 0 5 、0 ．1 3 5 0 ．0 0 5 均依次降低 J P 均 0 ．0 5 。在1 2 0d ，中、高氟组大鼠睾丸组织B a x 蛋白表 达水平 O ．1 9 4 0 ．0 1 8 、0 ．2 0 9 0 ．0 1 2 均高于对照组和低氟组 0 ．1 4 5 0 ．0 0 7 、0 ．1 6 1 0 ．0 1 2 ，P 均 0 ．0 5 ； 在1 8 0d 。对照组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织B a x 蛋白表达水平 O ．1 4 5 0 ．0 0 9 、0 ．1 8 5 0 ．0 1 3 、0 ．2 0 7 0 ．0 1 1 、 0 ．2 3 0 0 ．0 1 4 依次增多 P 均 0 ．0 5 。在1 2 0d ，对照组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织B c l ．2 ／b a x 蛋白表达比值 1 ．2 6 4 0 ．0 4 4 、1 ．0 2 8 0 ．0 9 6 、0 ．7 8 8 0 ．0 6 0 、0 ．6 8 8 0 ．0 6 4 依次降低 P 均 0 ．0 5 ；在1 8 0d ，对照组、低、中氟 组大鼠睾丸组织B e l ．2 ／b a x 比值 1 ．2 7 7 0 ．1 0 0 、0 ．8 6 5 0 ．0 6 6 、0 ．7 3 l 0 ．0 4 5 均高于高氟组 0 ．5 9 2 0 ．0 3 1 ， P 均 0 ．0 5 ，对照组高于中氟组 P 0 ．0 5 。结论燃煤污染型氟中毒可导致睾丸生精细胞凋亡指数升高、 B c l ．2 表达降低、B a x 表达增强、B c l ．2 ／B a x 比值降低；燃煤污染型氟中毒可能通过对凋亡相关基因调控参与雄 性大鼠睾丸生殖损害机制。 【关键词】氟化物中毒；大鼠；睾丸；基因，B c l ．2 ；基因，B a x R o l eo fe x c e s s i v ef l u o r i n e0 1 1p r o t e i ne x p r e s s i o no ft h er e l a t e da p o p t o s i sg e n ei nr a tt e s t i s X i ∞y 酩e h 面i n 帆Y u m t , S u nF o , L iC h o n g b i n , T a n gK a i f a , S u nC h a o , Y u 仉S h i - 7 洳‘G uJ 油峪G 嘲Z h i z h o n g ． “ D e p a r t m e n t o fU r o l o g y , A J 筛l i a t e dH o s p i t a lo fG u i y a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y , G u i y a n g5 5 0 0 0 4 , C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ．“ S u nF a , E m a i l s f g u i z h o u 1 6 3 ．c o m 【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T os t u d yt h ee f f e c to ff l u o r i n eo ne x p r e s s i o no fB c e l ll y m p h o m a ／l e u k e m i a - 2 B c l - 2 a n dB e l ．a s s o c i a t e dX B 麟 p r o t e i ni nr a tt e s t i s ，a n dt or e v e a lt h em e c h a n i s mo fi m p a i r e dm a l er e p r o d u c t i o nc a u s e d b ye n d e m i cf l u o r o s i so fc o a lb u r n i n g ．M e t h o d s F o r t ym a l eS Dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p sa c c o r d i n g t ob o d yw e i g h tw i t ht h em e t h o do fl 丑n d o md i g i t st a b l e c o n t r o lg r o u p ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i g hf l u o r o s i sg r o u p s ．L o w ， D O I 1 0 ．3 7 6 0 ／c m a ．j ．i s s n ．2 0 9 5 - 4 2 5 5 ．2 0 1 5 ．0 4 ．0 0 7 基金项目国家自然科学基金 8 1 3 6 0 0 9 7 ；国际合作项目 2 0 1 0 D F B 3 0 5 3 0 ；贵州省高层次人才基金 T Z J F - - 2 0 1 1 年一2 7 号 ；贵州省省长基金 黔省专合字[ 2 0 1 0 1 8 1 ；贵州省科技厅基金 黔科合L H 字[ 2 0 1 4 1 7 1 2 6 作者单位5 5 0 0 0 4 贵阳医学院附属医院泌尿外科[ 肖跃海、田源、孙发、李崇斌 现工作于河北省胸科医院泌尿外科 、唐 开发、孙超、余琦、石家齐、谷江] ；贵州省医学分子生物学重点实验室 官志忠 通信作者孙发，E m a i l s f g u i z h o u 1 6 3 ．c o r n 论著 万方数据 主堡丝友疸堂盘查2 Q 』生生旦垫旦箜3 垒鲞筮璺翅￡丛 』星趟￡逝丛△P d l2 Q ，垫 ，y 丛3 垒。塑Q 璺 m o d e r a t ea n dh i g hf l u o r i d eg r o u p sw e r ef e dw i t hf l u o r i n a t e df o o d 2 0 ．0 ，4 0 ．0 ，6 0 ．0r a g ／k s ，a n dc o n t r o lg r o u pw a sf e d c o n v e n t i o n a lr a tc h o w f l u o r i n a t e d1 ．3m g ] k g ．A f t e r1 2 0a n d1 8 0d a y s ．t h er a t sw e ms a c r i f i c e d ．D e n t a lf l u o r o s i sw a s d e t e r m i n e db yo b s e r v a t i o na n du r i n a r yf l u o r i d ew i l t 8d e t e c t e db yf l u o r i n ei o n s e l e c t i v ee l e c t r o d e ．T h ea p o p t o t i ci n d e x o fs p e r m a t o g e n i cc e l lw a sm e a s u r e db yt e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e - m e d i a t e dd U T Pn i c ke n dl a b e l i n g T U N E L ．T h ee x p r e s s i o no fB c l 一2a n dB a xw e r em e a s u r e db yi m m u o h i s t o c h e m i s t r y ．R e s u l t s A t1 2 0a n d 1 8 0 d a y s ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i g hf l u o m s i sg r o u p sw e r es u f f e r e df r o md i f f e r e n td e g r e e so fd e n t a lf l u o m s i s ，t h et e e t ho ft h e c o n t r o lg r o u pw a sn o r m a l ．A t1 2 0a n d1 8 0d a y s ，t h ec o n t e n to fu r i n a r yf l u o r i d ew a si n c r e a s e di nt u r ni nt h ec o n t r o l g r o u p ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i g hf l u o r o s i sg r o u p [ 1 ．6 9 0 ．0 3 ， 3 ．5 6 O ．1 0 ， 1 2 ．0 9 O ．3 8 ， 2 3 ．5 5 0 ．3 3 m g ／L ； 1 ．7 1 0 ．0 9 ， 4 ．0 7 0 ．2 5 ， 1 6 ．2 3 0 ．2 8 ， 8 ．4 4 0 ．5 0 m s ／L ；a l lP 0 ．0 5 1 ．U r i n a r yf l u o r i d eo fl o w , m o d e r a t ea n d h i g hf l u o r o s i sg r o u p sa t1 8 0d a y sw a sh i g h e rt h a nt h a to fe a c hc o r r e s p o n d i n gg r o u p sa t1 2 0d a y s a l lP 0 ．0 5 ．A t 1 2 0a n d1 8 0d a y s ，t h ea p o p t o t i ci n d e x e sw e r ei n c r e a s e di nt u r ni nt h ec o n t r o lg r o u p ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i g h f l u o m s i sg r o u p s 【 o ．4 6 0 ．11 ％， 8 ．8 3 1 ．6 4 ％ ， 1 7 ．2 4 3 ．9 6 ％， 4 4 ．2 1 7 ．8 5 ％； o ．5 4 O ．11 ％， 1 0 ．4 1 ．4 - 2 ．7 0 ％， 2 2 ．2 3 3 ．9 6 ％， 4 9 ．6 2 4 ．7 7 ％；a l lP o ．0 5 1 ．A t1 8 0d a y s ，t h ea p o p t o t i ci n d e x e so fl o w , m o d e r a t ea n d h i g hf l u o r e s i sg r o u p sw e r eh i g h e rt h a nt h o s eo fe a c hc o r r e s p o n d i n gg r o u p sa t1 2 0d a y sf a l lP 0 ．0 5 ．A t1 2 0a n d 1 8 0d a y s ，t h ee x p r e s s i o no fB c l 一2w e r ed e s c e n d e di nr u mi nt h ec o n t r o l ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i ．g hf l u o r o s i sg r o u p s 0 ．1 8 3 0 ．0 0 7 ，0 ．1 6 5 0 ．0 0 7 ，0 ．1 5 2 0 ．0 0 3 ，0 ．1 4 3 0 ．0 0 7 ，0 ．1 8 4 0 ．0 0 6 ，O ．1 5 9 0 ．0 1 1 ，O ．1 5 1 0 ．0 0 5 ， 0 ．1 3 5 0 ．0 0 5 ，a l lP 0 ．0 5 ．T h ee x p r e s s i o no fB a xo fm o d e r a t ea n dh i g hf l u o r i d eg r o u p s 0 ．1 9 4 0 ．0 1 8 ，0 ．2 0 9 0 ．0 1 2 w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a t o ft h ec o n t r o la n dl o wf l u o m s i sg r o u p o ．1 4 5 O ．0 0 7 ，0 ．1 6 1 0 ．0 1 2 a t 1 2 0d a y s a l lP 0 ．0 5 ．T h ee x p r e s s i o no fB a xw e r ei n c r e a s e di nt u mi nt h ec o n t r o l ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i g h f l u o m s i sg r o u p s 0 ．1 4 5 0 ．0 0 9 ，0 ．1 8 5 0 ．0 1 3 ，0 ．2 0 7 0 ．0 11 ，0 ．2 3 0 0 ．0 1 4 ，a l lP 0 ．0 5 ．A t1 2 0d a y s ，t h eB c l - 2 ／ B a xr a t i o sw e r ed e s c e n d e di nt u r ni nt h ec o n t r o l ，l o w ，m o d e r a t ea n dh i i g hf l u o m s i sg r o u p s 1 ．2 6 4 0 ．0 4 4 ，1 ．0 2 8 0 ．0 9 6 ，0 ．7 8 8 0 ．0 6 0 ，0 ．6 8 8 0 ．0 6 4 ，a l lP 0 ．0 5 ．A t1 8 0d a y s ，t h eB c l - 2 ／B a xr a t i oo fc o n t r o l ，l o w ，m o d e r a t e f l u o r o s i sg r o u p s 1 ．2 7 7 0 ．1 0 0 ，0 ．8 6 5 O ．0 6 6 ，O ．7 31 0 ．0 4 5 w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fh i g hf l u o m s i s g r o u p 0 ．5 9 2 0 ．0 31 ，a l lP 0 ．0 5 ，a n dt h a to fc o n t r o lg r o u pw a ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h a to fm o d e r a t ef l u o m s i s g r o u pf P 0 ．0 5 ．C o n c l u s i o n s E n d e m i cf l u o r o s i so fc o a lb u r n i n gm a yl e a d st oi n c r e a s e da p o p t o t i ci n d e xo fr a t s ’ s p e r m a t o g e n i cc e l l ，i n c r e a s e dB a xe x p r e s s i o na n dd e c r e a s e dB c l - 2 ／B a xr a t i o ．T h em e c h a n i s mo fi m p a i r e dm a l e r e p r o d u c t i o ni sp o s s i b l yc a u s e db yr e g u l a t i o no ft h er e l a t e da p o p t o s i sg e n ei nt h et e s t i s ． 【K e yw o r d s 】 F l u o r i d ep o i s o n i n g ； R a t s ；T e s t i s ；G e n e s ，b c l 一2 ；G e n e s ，b a x 燃煤污染型地方性氟中毒 地氟病 是我国独 有的一种类型．是由于病区居民长期以敞灶方式燃 烧高氟煤烘烤粮食、辣椒及取暖等，导致室内空气 和食物受到氟污染．机体摄人过量氟而引起的慢性 氟中毒H ] ，主要分布于长江三峡流域和西南地区[ 2 - 6 ] 。 贵州省是世界上燃煤污染型地氟病涉及人数最多、 病区最集中的重病区，在贵州8 7 个市 县 中有3 7 个市 县 受燃煤污染型地氟病累及；在全省约40 0 0 万人口中，病区人口高达19 0 0 万人，占总人口近 1 ／2c 1 。。目前，我国燃煤型氟中毒得到一定控制，但是 形势仍然严峻[ 1 ] 。随着对氟中毒研究的深人，国内外 学者发现机体氟中毒与雄性生殖功能损伤有密切 关系[ 7 - 9 ] 。研究表明。过量氟可导致睾丸生精细胞超 微结构和功能发生变化，生精细胞凋亡率升高，睾 丸氧化／抗氧化系统失衡，性激素水平紊乱，生精功 能降低，使精液质量下降，甚至不育[ 8 , 1 0 - 1 2 ] 。但燃煤型 氟中毒对生殖系统的损伤的具体机制尚不十分明 确，相关防治工作仍然是一个难点。有学者认为生 精细胞过度凋亡在氟中毒所致睾丸生殖功能损伤 中起重要作用[ L a - 1 4 ] 。由于受经济水平和气候条件的 限制，燃煤污染型氟中毒病区很多群众仍以煤烘干 燥的玉米为主食[ 1 5 1 ，为最真实地建立燃煤污染型氟 中毒动物模型，本实验在前期研究[ 1 1 - 1 2 ] 的基础上，采 用病区煤烘玉米加工的饲料建立燃煤污染型氟中 毒动物模型，研究燃煤污染型氟中毒大鼠睾丸组织 凋亡相关基因B 细胞淋巴瘤／白细胞 B ．c e l l l y m p h o m a ／l e u k e m i a - 2 ，B c l ．2 、B 细胞淋巴瘤／白细 胞基因伴随蛋白x B c l a s s o c i a t e dxp r o t e i n ，B a x 蛋 白的表达变化，以探讨燃煤型氟中毒睾丸生精细胞 凋亡的可能机制，为其防治工作提供科学的依据。 1 材料与方法 1 ．1 主要试剂和仪器凋亡试剂盒 美国R o c h e 公 司 ；B c l ．2 兔抗鼠多抗、B a x 兔抗鼠多抗 北京中杉 金桥生物技术有限公司 ；S P 免疫组化染色试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 。P X J ．1 B 型数字式 离子计 江苏江分电分析仪器有限公司 显微图像 万方数据 生堡丝直题堂苤查2 Q 』生4 旦2 Q 旦蔓3 垒鲞筮垒翅￡h 垃』星n 堕￡逝堂，△哑1 2 Q ，2 Q ，y 丛3 垒，丛Q 璺 采集系统 B H ．2 型，日本O L Y M P U S 公司 ；氟离子 选择电极计、参比电极 上海仪电科学仪器股份有 限公司 。 1 ．2 模型制备选用清洁级雄性S D 大鼠6 0 只．体 重9 0 ～1 1 0g ，由贵阳医学院实验动物中心提供 [ S C X K 渝 2 0 0 7 0 0 0 5 ] 。采用随机数字表法，按照体 质量分为对照组、低、中、高氟组，每组1 0 只。对照 组给予正常饲料 饲料中平均含氟量为1 ．3m g ／k g ， 低、中、高氟组分别喂饲含2 5 ％、5 0 ％、7 5 ％的病区煤 烘玉米配制的饲料 低、中、高氟组饲料中含氟量分 别为2 0 、4 0 、6 0m g ／k g ，复制燃煤型氟中毒模型。4 组大鼠均自由饮用自来水。分别于染氟1 2 0 、1 8 0d 时每组选5 只大鼠股动脉放血法处死。本实验符合 动物伦理规定，得到贵阳医学院伦理学委员会批准。 1 ．3 检测指标 1 ．3 ．1 氟斑牙发生情况分别于1 2 0 、1 8 0d 分批观 察各组大鼠氟斑牙出现情况。并参考氟斑牙分度标 准进行诊断。 1 ．3 ．2 尿氟测定分别在1 2 0 、1 8 0d 处死大鼠前，收 集每只大鼠2 4h 尿液。采用氟离子选择电极法测定 尿氟水平。 1 ．3 ．3 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端 标记法 T d T - m e d i a t e dd U T Pn i c ke n dl a b e l i n g ，T U N E L 检测大鼠睾丸生精细胞凋亡率大鼠处死后。立即 取睾丸组织，1 0 ％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常 规脱蜡脱水．按T U N E L 试剂盒说明书进行操作，阴 性对照不加末端转化酶。判定标准凋亡细胞核呈 棕黄色即为阳性细胞，阴性细胞核为蓝色。光镜下观 察、拍照、计算凋亡指数 A I 。A I 的计算方法参考文 献[ 1 6 1 8 ] 。每个大鼠睾丸组织切片光镜下 4 0 0 取2 0 个生精小管横断面。计数凋亡生精细胞数量／ 总生精细胞数量．取平均值即为生精细胞的A I 。 1 ．3 ．4 凋亡相关蛋白B c l ．2 、B a x 蛋白表达检测取 大鼠睾丸组织，石蜡包埋、切片，按免疫组化S P 法 检测B c l ．2 、B a x 蛋白表达水平，操作步骤按试剂盒 说明书进行。判定标准以细胞质呈棕黄色颗粒者 为B c l ．2 、B a x 表达阳性。每个标本取5 张切片，每张 切片光镜下 4 0 0 选取5 个视野，在同一光源、相 同亮度、饱和度、对比度、增益条件下拍照；所得图 片用图像分析软件I m a g e ．P r oP l u s6 ．0 I P P6 ．0 ，美 国M e a d i aC y b e r n e t i c s 公司 进行检测，计算平均光 密度值 a v e r a g eo p t i c a ld e n s i t y ，A O D ，反映蛋白表 达量【19 1 。 1 ．3 ．5 统计学处理采用S P S S1 1 ．5 统计软件，进行 析因设计的方差分析，进一步的两两比较采用S N K 法；数据以面s 表示，P 0 ．0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 ．1 氟斑牙发生情况在1 2 0 、1 8 0d ，低、中、高氟组 所有大鼠均出现不同程度的氟斑牙，对照组均无异 常表现。 2 ．2 尿氟检测结果在1 2 0 、1 8 0d ，对照组、低、中、 高氟组大鼠尿氟均依次增加 P 均 0 ．0 5 ；在低、中、 高氟组，大鼠尿氟在1 8 0 d 均高于1 2 0 d P 均 0 ．0 5 。 见表1 。 表14 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 时尿氟含量 i - I - s ，m s ／L 注在相同时同点，与对照组比较，I P 0 , 0 5 ；与低氟组比较，h P 0 ．0 5 ；与中氟组比较，c P 0 ．0 5 ；在同一组别，与1 2 0d 比较，d ／, 0 ．0 5 2 ．3 睾丸生精细胞凋亡检测结果低、中、高氟组大 鼠睾丸组织中出现大量细胞核被染成棕黄色的凋 亡细胞，主要为靠近基底膜的精原细胞和精母细 胞。亦可见少量睾丸支持细胞和间质细胞发生凋 亡。对照组大鼠睾丸组织生精细胞偶见凋亡发生。 在1 2 0 、1 8 0d ，对照组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织 生精细胞凋亡指数依次增加 P 均 0 ．0 5 ；在低、 中、高氟组，大鼠睾丸组织生精细胞凋亡指数在1 8 0d 均高于1 2 0d P 均 0 ．0 5 。见图1 、表2 。 表24 组大鼠1 2 0 、1 8 0 d 时睾丸生精 细胞凋亡指数 面土s ，％ 注在相同时间点，与对照组比较，a P 0 ．0 5 ；与低氟组比较，b p 0 ．0 5 ；与中氟组比较，c P 0 ．0 5 ；在同一组别，与1 2 0d 比较，d P 0 ．0 5 2 ．4 氟对凋亡相关蛋白表达的影响 2 ．4 ．1 B c l 一2 蛋白表达变化B c l ．2 蛋白免疫反应阳 性物质为位于胞质的棕黄色颗粒，在睾丸生精细胞 和间质细胞中均有表达。在1 2 0d ，对照组、低、中、 高氟组大鼠睾丸组织B c l ．2 蛋白表达水平依次 降低 P 均 0 ．0 5 ；在1 8 0d 。低、中、高氟组大鼠睾 丸组织B c l ．2 蛋白表达水平均低于对照组 P 均 0 ．0 5 ，且高氟组低于低、中氟组 P 均 0 ．0 5 。见图 2 、表3 。 万方数据 涵 淄 一蕊 ’户翟哦 一 ， 。k ．’。j 溺菸矗．、，j ’_ i j ．僦．； o 。。0 jo 蠢铽≈瓿 瓿瀚阁 2 5 7 A 、E 对照组睾丸组织中无或偶见极少量的凋亡细胞；B 、F 低氟组出现少量的凋亡细胞，细胞核被染成棕黄色C 、G 中氟组出现较多的 凋f 细胞；D 、H 高氟组m 现大量细胞核被染成棕黄色的凋产细胞．主要为靠近基底膜的精原细胞和精母细胞． 亦可见少量睾丸支持细胞和问质细胞发生凋亡；A 、B 、C 、D 为1 2 0d ；E 、F 、G 、H 为1 8 0d 图l光镜下4 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 睾丸生精细胞凋亡情况观察结果 T U N E L 4 0 0 誊麓蠹 鬻缫 ．；融矗． ． O A 、E 对照组生精细胞和间质细胞胞质内均有B c l - 2 蛋白表达，呈黄色，部分呈棕黑色；B 、F 低氟组阳性着色的细胞较对照组稍减少 C 、G 中氟组见少量的阳性着色细胞；D 、H 高氟组阳性着色的细胞明显减少；A 、B 、C 、D 为1 2 0d ；E 、F 、G 、H 为1 8 0d 圈2光镜下4 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 睾丸组织B c l - 2 蛋白表达情况观察结果 s P 4 0 0 表34 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 时睾丸组织B c i ．2 蛋白 表达水平 A O D ，面s 注在相同时间点，与对照组比较，I P 0 ．0 5 ；与低氟组比较，b P 0 ．0 5 ；与中氟组比较，c P 0 ．0 5 ；A O D 为平均光密度值 2 ．4 ．2 B a x 蛋白表达B a x 蛋白免疫反应阳性物质 为位于胞质的棕黄色颗粒，在生精细胞和间质细胞 中均有表达。在1 2 0d ，中、高氟组B a x 蛋白表达量 均高于对照组和低氟组 P 均 0 ．0 5 ；在1 8 0d ，对 照组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织B a x 蛋白表达水 平依次增多 P 均 0 ．0 5 。见表4 、图3 。 表44 组大鼠1 2 1 1 、1 8 t l d 时睾丸组织B a x 蛋白 表达水平 A O D ，面s 注在相同时间点，与对照组比较，．P 0 ．0 5 ；与低氟组比较．b P 0 ．0 5 ；与中氟组比较，中 O ．0 5 ；A O D 为平均光密度值 鞴露 ●．● ● ， ．- ● ■ 万方数据 舔 主堡丝直通堂苤查2 Q 生垒旦2 Q 旦筮3 垒鲞筮璺塑g h 地』E Ⅱd 道堂，△P 逊垫，2 Q 1 5 ，y 丛3 璺，丛Q 璺 ≈’ O 气t ’、j I ～ 纛 ．髓囊 j 猃．j ．．、’ ．二⋯0 畦‘．一．。t 蓦蠢 A 、E 正常组睾丸组织中偶见极少量的B a x 蛋白表达，主要位于生精细胞和间质细胞质内中，被染成棕黄色B 、F 低氟组出现少量的阳性着色 的细胞；C 、G 中氟组出现较多的阳性着色的细胞；D 、H 高氟组出现大量阳性着色的细胞，主要位于靠近基底膜的精原细胞和精母细胞中， 皋丸支持细胞和间质细胞亦出现阳性着色细胞；A 、B 、C 、D 为1 2 0d E 、F 、G 、H 为1 8 0d 围3光镜下4 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 睾丸组织B a x 蛋白表达水平观察 S P 4 0 0 2 ．4 ．3 B c l - 2 ／B a x 蛋白表达水平比值在1 2 0d ，对照 组、低、中、高氟组大鼠睾丸组织B c l ．2 ／B a x 蛋白表 达比值依次降低 P 均 0 ．0 5 。在1 8 0d ，中氟组大 鼠睾丸组织B c l ．2 ／B a x 蛋白表达比值均低于对照组 P 0 ．0 5 ；高氟组大鼠睾丸组织B c l ．2 ／B a x 蛋白表 达低于对照组、低、中氟组 P 均 O ．0 5 。见表5 。 裹54 组大鼠1 2 0 、1 8 0d 毫丸组织B c l ．2 ／B a x 蛋白 表达比值 i s 注在相同时I 司点，与对照组比较，- P 0 ．0 5 ；与低氟组比较，b 尸 0 ．0 5 ；与中氟组比较，c p 0 ．0 5 3 讨论 经饮水、灌胃、腹腔注射染氟的动物实验表明， 摄人过量氟可引起生精细胞凋亡增加，影响睾丸生 殖功能[ 1 3 - 1 4 ] 。本课题组前期模拟燃煤污染型氟中毒 动物实验发现。燃煤污染型氟中毒亦可引起睾丸组 织学结构改变，生精细胞的超微结构和功能改变， 睾丸氧化应激／抗氧化应激系统失衡，生殖内分泌 水平紊乱，生精细胞凋亡率增加，影响睾丸的生精 功能[ n q 2 ] 。人群调查研究方面，石修权等⋯报道了贵 州遵义燃煤污染型氟中毒病区男性青年氟中毒患 者不育的病例报告，检查结果显示患者精子存活 率和活动度降低，精液不全液化，但氟中毒对睾丸 生殖功能影响的具体机制尚不明确。有学者认为， 生精细胞过度凋亡在氟中毒所致睾丸生殖功能损 伤中起重要作用[ 1 3 - 1 4 ] 。凋亡是细胞接受到某种信号 或受到某种刺激后发生的一种主动的死亡过程，它 受多种相关基因的调控。本实验结果显示，染氟组 睾丸生精细胞的凋亡指数明显高于对照组．且随染 氟剂量的增加和染氟时间的延长而加重．与相关报 道结果一致【H 】。此外，通过本实验还发现，氟斑牙程 度越重的染氟大鼠．睾丸生精细胞凋亡的程度越 重。睾丸生精细胞凋亡率与大鼠氟中毒症状的严重 程度相一致。 B c l ．2 和B a x 是一对关系十分密切的细胞凋亡 相关基因。分别是抗凋亡基因和促凋亡基因。B a x 同 属’B c l ．2 家族。B c l ．2 蛋白家族中抗凋亡和促凋亡成 员间的相互协调作用起着细胞凋亡开关的作用∞] 。 在无外界凋亡刺激时，B c l 一2 抗凋亡蛋白作为细胞 器的整合膜蛋白被隔离起来从而抑制促凋亡因子 的释放B a x 作为促凋亡蛋白以非活性的形式定位 分布于细胞质中。当细胞接受到凋亡刺激信号后， B a x 发生构象变化，从细胞质中转移到线粒体膜上， 与膜内和膜上的抗凋亡蛋白相互作用．使抗凋亡蛋 白失去对凋亡的抑制活性．线粒体膜上的通透性孑L 道开放，导致线粒体膜电位下调、细胞色素C 释放， 从而启动线粒体介导的细胞凋亡[ 2 屹。 B c l ．2 与B a x 表达的比例决定着细胞接受到凋 亡信号刺激后是生存还是凋亡，当B c l ．2 过表达时， 形成异源二聚体B c l ．2 ／B a x ，发挥抑制凋亡作用；当 B a x 过表达时．形成同源二聚体B a x ／B a x ．抵消B c l ．2 的抑凋亡作用，发挥