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燃煤型砷中毒大鼠肾损伤特点及其生物学标志的基准剂量分析 徐玉艳，张爱华，李军，陈黎媛，姚茂琳，于春，曾奇兵，何江 贵阳医学院公共卫生学院卫生毒理学教研室，贵州 贵阳550004 摘要目的观察燃煤型砷中毒大鼠肾毒性作用， 应用基准剂量 BMD 法探讨肾功能效应标志改变的 尿砷 UAs 的基准剂量。方法Wistar 大鼠连续 90 d 喂饲砷 25，50，100 mg kg －1污染饲料。检测大鼠 UAs、 肾砷 KAs 及肾功能指标并观察肾常规病理学及其纤维化改变。以 UAs 为暴露标志， 尿 β2- 微球蛋白 微球蛋白 Uβ2- MG 、 尿 N- 乙酰- β- D- 氨基葡萄糖苷酶 UNAG 及尿白蛋白 UALB 为效应标志， 运用 BMD 法计算各效应标志对应的 UAs 的 BMD 及其基准剂量 95可信限下限 BMDL。结果砷 100 mg kg －1组 大鼠 UAs，KAs，UALB，UNAG，Uβ2- MG 含量均高于正常对照组 P ＜0．05 ; 光镜下各染砷组大鼠肾 HE 染色可见炎性细胞浸润、 肾小管上皮细胞肿胀、 肾间质毛细管扩张、 充血等不同程度的病理学改变， Masson 染色可见肾小管间质不同程度的纤维化; 以 UAs 为暴露标志，Uβ2- MG，UNAG，UALB 为效应标志， 计算得 出各效应标志 UAs 的 BMD 分别为 998．9，1213．5 和 1386． 9 μgg －1Cr， BMDL 分别为 660． 5，803． 6 和 909．4 μg g －1Cr。燃煤型砷中毒大鼠肾功能早期改变的尿砷的 BMD 及BMDL 分别为998．9 和660．5 μg g－1Cr。 结论微小病变型肾病可能是燃煤砷污染对肾损害的主要病理类型， 推荐使用较为敏感的生物学标志 Uβ 2- MG来估算砷致肾损伤的生物暴露限值。 关键词砷中毒; 煤; 肾损伤; 生物学标志; 基准剂量 中图分类号Ｒ994．6， Ｒ114文献标志码A文章编号 1000- 3002 2014 02- 0243- 05 DOI 10．3867/j． issn．1000- 3002．2014．02．017 燃煤污染型地方性砷中毒 以下简称燃煤型砷 中毒 主要流行于贵州、 陕西两省， 是一种严重危害 人类健康的公共卫生疾病 ［ 1］。本课题组前期研究 显示， 燃煤型砷中毒对机体的影响是多方面的， 燃煤 砷污染可引起暴露人群肾不同程度的损害［ 2］。鉴 于人群研究生物材料难以获得、 混杂因素较多等局 限性， 为了进一步了解燃煤型砷中毒对肾的毒性作 用及其生物学效应， 本课题组模拟贵州省燃煤型砷 中毒病区暴露实际， 以高砷煤烘玉米粉配制成含砷 饲料喂养大鼠建立砷中毒大鼠肾损伤模型， 通过检 测课题组前期人群研究中筛选的砷致肾损伤的相对 敏感生物学标志， 探讨高砷煤烘玉米粉致大鼠肾的 毒性效应及其剂量- 效应关系， 同时采用目前国际上 推荐的基准剂量 benchmark dose， BMD 法 ［ 3］探 讨肾功能效应标志早期改变的尿砷 urinary arsenic， 基金项目国家自然科学基金 81172603 ; 贵州省教 育厅培育项目 黔教科 2008020 ; 贵州省科技厅基金 黔科 合人才团队 20124003 ;贵州省科技 厅 基 金 黔 科 合 J20112274 作者简价徐玉艳 1985 － ， 女， 硕士， 讲师， 主要从事 燃煤污染型砷中毒发病机制及防治研究。 通讯作者张爱华，E- mailaihuagyaliyun． com UAs 的基准剂量， 为砷暴露人群肾损伤的健康监测 提供参考依据。 1材料与方法 1．1药物、 试剂和仪器 尿 N- 乙 酰- β- D- 氨 基 葡 萄 糖 苷 酶 urinary N- acetyl- β- D- glucosaminidase， UNAG 、尿 β2 - 微 球蛋白 urinary β2- microglobulin， Uβ2- MG 、 尿白 蛋白 urinary albumin， UALB 试剂盒购自南京建成 生物工程研究所; 砷标准储备液购于国家标准物质 研究中心 GB08611 ， 浓度为 1． 00 gL －1; 其余试 剂均为国产分析纯。Vista MPX 型 ICP- OES 光谱 仪 美国 Varian 公司 、 VGA- 77 型氢化物发生器 美国 Varian 公司 、 MQX200 型酶标仪 日本 Olympus公司 、 Ethos 高压微波消解系统 意大利 Milestone 公司 。 1．2动物及分组 选取健康断乳 Wistar 大鼠 40 只， 购自中国人 民解放军第三军医大学动物实验中心， 合格证号 ［ SCXK 渝 2007- 0003］ ， 体质量 80 ～100 g， 雌雄 各半， 按体质量随机分为 4 组， 即正常对照组， 砷 25， 50， 100 mg kg －1污染粮食组， 每组 10 只。染 342中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 毒时间为 90 d。实验期间所有大鼠在清洁级动物 房内 室内温度 22 ～ 24℃， 湿度为 60 ～ 70， 12/12 h光照/黑暗交替 分笼饲养， 自由饮水进食。 1．3尿砷含量的测定 收集大鼠 24 h 尿液， 取 1．0 mL 尿样于聚四氟 乙烯消解管中， 加入 3．0 mL 浓硝酸和0．5 mL 过氧 化氢进行微波消解。冷却后， 用 1∶ 100 的硝酸定容 至 10．0 mL 待测。采用 HG- ICP- OES 检测大鼠尿 液中的砷含量。将获得的数据用尿肌酐 UCr 值进 行校正。单位为 μg g －1Cr。 1．4肾砷含量的测定 准确称取 0． 5 g 新鲜肾组织， 用生理盐水制备 成肾匀浆， 放置于聚四氟乙烯消解管中， 加入 8．0 mL浓硝酸和 2．0 mL 过氧化氢进行微波消解。 冷却后， 用去离子水定容至 25． 0 mL 待测。采用 HG- ICP- OES检测大鼠肾中的砷含量 kidney arse- nic，KAs 。单位为 μg g －1。 1．5尿液中 UALB，UNAG 和 Uβ2- MG 含量的 测定 收集大鼠 24 h 尿液， 按试剂盒说明书操作。采 用 ELISA 法测定尿液中 UALB 及 Uβ2- MG 含量; 对- 硝基苯酚比色法测定尿液中 UNAG 含量。将获 得的数据用 UCr 值进行校正。UALB，UNAG 和 Uβ 2- MG 单 位 分 别 为 mgg －1 Cr，μgg －1 Cr 和 mg g －1 Cr。 1．6肾组织病理形态检测 取部分肾组织用 4甲醛溶液固定 48 h， 常规 脱水、 石蜡包埋、 切片， HE 染色和 Masson 染色后 于光学显微镜下观察肾组织的病理形态改变以及肾 的纤维化程度。 1．7统计学处理 采用 SPSS13．0 统计软件进行方差分析、 相关 分析、 趋势 χ2检验。原始数据呈正态分布， 用x s 表示。检验水准 α 0．05。 1．8基准剂量的计算 以正常对照组各效应标志的 95上限作为正 常参考值上限， 当大鼠各肾损伤效应标志小于该值 时， 判为正常－ ， 反之为异常 ， 统计各效应标 志异常发生率， 应用 BMDS V2．1 软件以 10反应 率计算砷中毒大鼠肾损伤 UAs 的 BMD 和基准剂量 95可信限下限 lower confidence limit of bench- mark dose，BMDL 。根据 BMD 及 BMDL 大小判 断肾功能标志相对敏感性， 并以最小的 BMD 及 BMDL 作为砷中毒大鼠引起肾功能改变的基准剂量 及其可信限下限。 2结果 2．1燃煤型砷染毒大鼠尿及肾中砷含量 表 1 结果显示， 砷 25，50，100 mgkg －1组大 鼠 UAs，KAs 含量均高于正常对照组 P ＜0． 05 ， 砷 100 mgkg －1 组大鼠 UAs，KAs 含量高于砷 25 mg kg －1组 P ＜0．05 。 Tab．1Arsenic in the urine UAsand kidney KAs of rats exposed to coal- burning Arsenic/ mg kg －1 UAs/ μg g －1Cr KAs/ μg g －1 091．9 8．71．815 0．397 25786．9 172．9*3．475 0．957* 501481．9 248．0*5．030 1．080* 1003348．9 637．5* 7．027 1．620* Ｒats were fed with 164． 67 ppm arsenic contaminated grain at levels of 15，30and 60 equals to arsenic 25，50， 100 mg kg －1for continuously 90 d． x s，n 10．* P ＜0． 05， compared with normal control group;P ＜ 0．05，compared with arsenic 25 mg kg －1 group． 2．2燃煤型砷染毒对大鼠肾功能的影响 表 2 结果显示， 砷 25 mgkg －1 组大鼠 UNAG 含量高于对照组 P ＜0．05 ; 砷50 mg kg －1组大鼠 UNAG，Uβ2- MG 含量高于正常对照组 P ＜0．05 ; 砷 100 mgkg －1 组大鼠 UALB，Uβ2- MG，UNAG 含量 均 显 著 高 于 正 常 对 照 组 P ＜ 0． 05 ; 砷 100 mg kg －1组大鼠 UNAG 高于砷 25 mgkg－1组 P ＜0．05 。 Tab． 2ALB，NAG and β2- MG in the urine of rats exposed to coal- burning Arsenic/ mg kg －1 UALB/ mg g －1Cr UNAG/ μg g －1Cr Uβ 2- MG/ mg g －1Cr 00．390 0．073 5．915 1．646 1．860 0．462 250．584 0．13410．433 2．110*2．941 0．539 500．641 0．15216．524 3．195*3．321 0849* 1000．805 0．283*20．483 6．660* 3．836 1．066* See Tab．1 for the treatment． UALBurinary albumin;UNAGuri- nary N- acetyl- β- D- glucosaminidase;Uβ2- MGurinary β2- micro- globulin． x s，n 10． * P ＜0．05，compared with control group; P ＜0．05，compared with arsenic 25 mg kg－1 group． 2．3燃煤型砷染毒对大鼠肾组织的影响 2．3．1HE 染色 图 1 结果显示， 正常对照组大鼠肾小球和肾小 442中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 管结构清晰， 肾小管上皮细胞形态正常， 管腔规则， 肾间质无炎性细胞浸润 图 1A 。砷 25 mgkg －1 组大鼠肾可见少量炎性细胞浸润 图 1B 。砷 50 mg kg －1组大鼠肾小管上皮细胞的轻微肿胀， 细 胞间隙不清 图 1C 。砷 100 mgkg －1组大鼠肾可 见肾小球毛细血管明显扩张充血， 肾间质毛细血管扩 张、 充血明显， 肾小管上皮细胞水肿 图1D 。 Fig． 1Morphological changes of kidneys of rats exposed to coal- burning HE 400 ．See Tab． 1 for the treatment． A normal control;B，C and Darsenic 25，50 and 100 mg kg －1 groups，respectively． 2．3．2Masson 染色 光镜下 Masson 染色可见正常对照组肾组织无 明显纤维化病变 图 2A ; 砷 25 mg kg －1组大鼠肾 组织可见少量纤维化 图 2B ; 砷 50 mg kg －1组大 鼠肾可见部分肾小管间质纤维化 图 2C ; 砷 100 mg kg －1组大鼠肾中可见较多的肾小管间质纤 维化 图 2D 。 Fig． 2Morphological changes of kidneys of rats exposed to coal- burning Masson 400 ．See Tab． 1 for the treatment． A normal control;B，C and Darsenic 25， 50 and 100 mg kg －1 groups，respectively． 2．4暴露标志与效应标志间的相关性 表 3 结果显示， UAs 与 KAs 存在明显的正相关 关系 P ＜0． 01 ; UAs，KAs 与各肾功能效应标志 之间呈正相关关系 P ＜0．05，P ＜0．01 。 Tab．3Correlation between exposure biomarkers and effect biomarkers Variable UAs Correlation coefficient P- value KAs Correlation coefficient P- value KAs0．9440．0001．0001．000 UNAG0．2910．0030．2710．006 β2- MG0．5320．0080．4830．000 UALB0．2630．0080．2000．046 2．5染砷量与肾功能效应标志异常检出率间关系 Uβ 2- MG，UALB，UNAG 正常上限值分别为 2．516 mg g －1Cr， 0．567 mg g－1Cr 和10．999 μg g－1 Cr。表 4 结果显示， 染毒量与肾功能效应标志 UALB，UNAG，Uβ2- MG 异常检出率间存在明显的 剂量- 效应关系 P ＜0．05，P ＜0．01 。 Tab． 4Correlation between the abnormal rate of effect biomarkers in the urine and the expose level of arsenic Arsenic/ mg kg －1 UALB － UNAG － Uβ 2- MG － 09191100 25374691 50375573 1000102855 χ2correlation18．2410．408．459 P- value0．0000．0150．037 See Tab．1 for the treatment． n 10． “- ”as normal，and“”as abnormal． 2．6UAs 的 BMD 和 BMDL 各效应标志异常发生率， 应用 BMDS V 2．1 软 件， 以 UAs 为暴露标志， Uβ2- MG，UALB，UNAG 为效应标志， 计算 UAs 的 BMD 和 BMDL。表 5 结 果显 示， 以 UAs 为 暴 露 标 志，UALB， UNAG ， Uβ 2- MG为效应标志， 计算 UAs 的 BMD 分别为 1386．9， 2123． 6 和 999． 0 μgg －1 Cr; BMDL 分别 为 909． 4， 880． 8 和 660． 5 μgg －1 Cr。模型为 Logistic， 反应率为 10。 542中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 Tab．5The BMD and BMDL of UAs Exposure biomarker Effect biomarker Logistic model with BMＲ of 10 BMDBMDL UAsUALB1386．9909．4 UAsUNAG1213．6880．8 UAs Uβ 2- MG 999．0660．5 3讨论 本研究发现， 随着染砷剂量的增加， 大鼠 UAs， KAs 含量及肾功能效应标志 Uβ2- MG，UNAG 和 UALB 含量逐渐增高， 均存在明显的剂量- 效应关 系。提示， 燃煤型砷中毒大鼠可以引起肾功能改变。 UAs 作为暴露标志可反映近期砷的暴露水平， KAs 可直接反映砷在肾的蓄积状况［ 4］。UNAG 是肾近 曲小管上皮细胞内的一种溶酶体水解酶， Uβ2- MG 是一种低分子蛋白， 两者均可通过肾小管重吸收并 完全降解， 当肾小管受损时， 尿液中 UNAG，Uβ2- MG 的含量升高。肾小球滤过膜的电荷选择性屏障 存在静电同性排斥作用， 绝大多数 UALB 不能通过 滤过膜， 当肾小球受损时， 尿液中 UALB 升高 ［ 5 －6］。 结合本次动物实验结果， 考虑砷暴露后由于砷在大 鼠肾中蓄积， 从而引起肾小管重吸收功能和肾小球 滤过功能受损。这与课题组前期饮水型砷中毒动物 模型的研究结果 ［ 7］一致， 提示虽然燃煤型砷暴露有 更多的影响因素， 但其致肾损害的作用与饮水型砷 暴露的主效应一致。 病理学检查是确定脏器损害的“金指标” ， 本研 究 HE 染色结果显示， 染砷大鼠肾发生了不同程度 的病理组织学改变， 主要表现为肾功能改变， 肾小球 充血， 肾小管上皮细胞肿胀， 肾间质炎症、 充血等。 这与前期人群研究结果［ 8］基本一致。由此可见， 微 小病变型肾病可能是燃煤砷污染对肾损害的主要病 理类型， 也是导致 Uβ2- MG，UNAG，UALB 增高的 病理学基础。Masson 染色结果显示， 各染砷组大 鼠肾间质出现了不同程度的纤维化， 考虑可能是砷 在肾中蓄积的结果; 结合人群研究及 HE 染色结果 中发现的肾间质炎症， 提示长期反复的肾炎症， 能够 激活机体免疫系统， 诱发一系列修复反应， 导致大量 纤维的增生， 引起肾的纤维化。 基准剂量法是近年来毒理学界提出的一种新的 确定参考剂量的方法， 自 1984 年 Crump［ 9］提出以 来， 由于其利用了数据资料所提供的全部信息， 考虑 了资料的变异性， 避免了传统方法进行低剂量外推 时的一些不确定因素等特点和优势， 已逐渐得到毒 理学界的认同， 并在金属、 类金属毒性等研究上得到 应用， 同时也有学者利用该方法进行敏感生物学标 志的 筛 选 ［ 10 －12］。本 研 究 以 UAs 为 暴 露 标 志， Uβ 2- MG，UNAG，UALB 为效应标志， 计算得出各 效应 标 志 BMD 分 别 为 998． 9 μgg －1 Cr， 1213．5 μg g －1Cr 和 1386． 9 μgg－1 Cr， BMDL 分 别为 660． 5 μgg －1 Cr，803． 6 μgg －1 Cr 和 909．4 μg g －1Cr。根据 BMD 及 BMDL 的大小， 得 到燃煤型砷中毒大鼠引起肾功能效应标志早期改变 的 BMD 及 BMDL 分别为 998． 9，660． 5 μgg －1 Cr; 推荐使用较为敏感的生物学标志 Uβ2- MG 来计 算砷致肾损伤的生物暴露限值。 综合分析本动物实验研究结果和课题组前期人 群研究结果， 认为微小病变型肾病可能是燃煤砷污 染对肾损害的主要病理类型， 也是导致 Uβ2- MG， UNAG，UALB 增高的病理学基础; 燃煤型砷中毒大 鼠引起肾功能效应标志早期改变尿砷的 BMD 及 BMDL 分别为 998．9， 660．5 μg g －1Cr; BMD 法在 筛选敏感生物学标志方面具有相对优势， 推荐使用 较为敏感的生物学标志 Uβ2- MG 来估算砷致肾损 伤的生物暴露限值。 参考文献 ［ 1］ Zhang AH． Ｒesearch status and prospects of burn- ing coal endemic arsenism in China［ J］ ． Chin Envi- ron Health Persp 环境与健康展望 ，2005，113 4 653- 654． ［ 2］ Hong F，Zhang AH，Jin TY． A study on renal dys- function of arsenie poisoning victims caused by air pollution from coal burning［J］ ． J Environ Occup Med 环境与职业医学 ， 2 007， 24 6 580- 583． ［ 3］ Song XY，Zhang L，Sui HX，Li JW，Ma J，Liu N， et al． Application of bench mark dose approach in risk assessment［J］ ．J Hyg Ｒes 卫 生 研 究 ， 2011， 40 1 1- 26． ［ 4］Hong F．Crowdtoxicology［M］∥Zhang AH， 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AbstractOBJECTIVEStudy the kidney toxic effects caused by burning coal endemic arsenism in rats，application benchmark dose BMD to investigate the benchmark dose of urinary arsenic UAsand the changes in biomarkers of renal function． SWistar rats were fed for 90 d with arsenic 0， 25， 50， 100 mg kg －1 contaminated feed． Urinary arsenic，kidney arsenic and renal function indicators were determined，and routine pathological and fibrosis of kidney were examined． UAs as the exposure biomarker，Uβ2- MG，UNAG and UALB for the effect biomarkers，application benchmark dose to calculate the BMD and BMDL of UAs for each effect biomarkers． ＲESULTSUAs，KAs， Uβ 2- MG，UNAG，UALB levels of rats in arsenic 100 mg kg －1 group were increased than normal group P ＜ 0． 05 ;In light microscope，the results of HE staining of rat kidney in all arsenic dose groups showed inflammatory cell infiltration，renal tubular epithelial cell swelling，renal interstitial capillary dila- tion，congestion and other varying degrees pathological changes，and the results of masson staining showed varying degrees of tubulointerstitial fibrosis;UAs as the exposure biomarker，Uβ2- MG，UNAG， UALB for the effects of mark，the BMD and BMDL of UAs for Uβ2- MG，UNAG，UALB were calculated， the BMD values were 998．9， 1213．5， 1386．9 μg g －1Cr， the BMDL values were 660．5， 803．6 and 909． 4 μg g －1Cr，respectively． CONCLUSION Burning coal arsenic pollution can cause kidney damage in rats，minimal change nephropathy may be the primary pathological in the coal arsenic contamination of kidney damage． The BMD and BMDL of UAs were 998．9， 660．5 μg g －1Cr，the early changes of renal function of burning coal arsenism in rats;it is recommended to use the more sensitive biomarkers Uβ 2- MG to calculate the biological exposure limits on renal injury caused by arsenic． Key wordsarsenic poisoning;coal;kidney damage;biomarkers;benchmark dose Foundation itemThe project supported by National Natural Science Foundation of China 81172603 ;Cultivate project by Bureau of Education of Guizhou Province 2008020 ;Science and Technology Bureau Foundation of Guizhou Province 20124003 ;and Science and Technology Bureau Foundation of Guizhou Province J20112274 Corresponding authorZHANG Ai- hua，E- mailaihuagyaliyun． com 收稿日期 2014- 01- 20接受日期 2014- 02- 26 本文编辑乔 虹 742中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014