燃煤型室内空气污染物和哮喘易感基因的交互作用与儿童哮喘发病风险的研究.pdf

学校代码1 0 6 1 0 学号S 0 4 3 5 1 4 、 谚7 I 『大鉴谚7 I I 犬鉴 硕士学位论文 论文题目憋煤型童盘窒氢盈鎏堑垄哇嗤曼盛基垦 作者 ．魏越 学科专业速堑痼鱼墨生缠盐鲎．． 指导教师 盎莲型塾撞． 二o o 六年五月 Ⅱ 燃煤型室内空气污染物和哮喘易感基因的交互作用 与儿童哮喘发病风险的研究 摘要 【目的】了解贵州省贵定县哮喘儿童居室内燃煤型空气污染物 P M 4 、S 0 2 、C O 的暴露水平和哮喘儿童中O2 肾上腺素能受体 D r A R 基因第1 6 、”位点以 及血管紧张素转移酶 A C E 基因的分布频率，进而揭示燃煤型室内空气污染 物 P M 4 、S 0 2 、C O 扣哮喘易感基因的交互作用与儿童哮喘发病风险的关系。 [ 方法】本次研究采用单纯病例研究的流行病学方法。在贵州省贵定县收集研究 对象的基本信息和血样，通过P C R 方法检测每个研究对象的D2 一A R 基因第1 6 、 2 7 位点多态性和A C E 基因多态性，同时分别检测当地县城和乡村家庭居室内 空气中P M 4 、S 0 2 、C O 的浓度，计算三种哮喘易感基因的基因型分布频率和等 住基因频率，并判断燃煤型室内空气污染物 P M 4 、S O z 、C O 与三种哮喘易 感基因多态性在儿童哮喘的发生中是否存在相乘模型的交互作用。 【结果】县城居民家庭室内的P M 4 、S 0 2 和C O 浓度均未超标，乡村居民家庭室 内的S 0 2 浓度超标率达到6 1 ％，P M 4 浓度超标率达到6 7 ％，C O 浓度未超标。 研究对象02 ．A R 基因1 6 位点A r g ／A r g 纯合子、c l y ／a i y 纯合子、A r g ／G l y 杂合 子的频率分别为1 3 ．9 ％、1 3 ．4 ％和7 2 ．7 ％，2 7 位点G i n ／G i n 纯合子、G l u ／G l u 纯 合子、G l n ／G l u 杂合子的频率分别为1 3 ．9 ％、4 ．3 ％和8 1 ．8 ％，A C E 基因1 I 、D D 和D 基因型的频率分别为4 9 ．3 ％、2 0 ．0 ％和3 0 ．7 ％。另外，未考虑其它因素的 1 影响时，燃煤型室内空气污染物 P M 4 、S 0 2 、C O 和D2 一A R 基因1 6 位点多 态性以及A C E 基因多态性在儿童哮喘的发生中分别存在正相乘模型交互作用 P 值均 0 ．0 5 ；分别控制民 族、家族哮喘史和年龄三种因素的混杂作用后，燃煤型室内空气污染物 P M 4 、 S 0 2 、C O 和D2 一A R 基因1 6 位点多态性以及A C E 基因多态性在儿童哮喘的发 生中均不存在相乘模型的交互作用 P 0 ．0 5 。 【结论】当地燃煤型室内空气污染问题较为突出，尤其以乡村情况更为严重。三 种哮喘易感基因的分布频率与相关研究结果均不同，提示其多态性的频率分布 可能存在民族、地域差异。本次研究在分析燃煤型室内空气污染物 P M 4 、S 0 2 、 C O 和哮喘易感基因的交互作用时，受到了一些混杂因素的干扰。有关燃煤型 室内空气污染物 P M 4 、S 0 2 、C O 和哮喘易感基因的交互作用与儿童哮喘发 生的关系尚须在以后的研究中进一步加以验证。 【关键词】燃煤型室内空气污染物；哮喘易感基因；交互作用；单纯病例研究； 儿童哮喘 2 A S t u d yo nR e l a t i o n s h i pb e t w e e nC h i l d h o o dA s t h m aa n d I n t e r a c t i o no fI n d o o rA i rP o l l u t a n t sf r o m B u r n i n gC o a la n d G e n e t i cP o l y m o r p h i s m s S u s c e p t i b l et oA s t h m a A b s t r a c t [ O b j e c t i v e s ] T ot a k et h em e a s u r e m e n t sf o ri n d o o ra i rp o l l u t a n t Sf r o mb u r n 、i n gc o a I i nG u iD i n g ，G u iZ h o u p r o v i n c e ，i n c l u d i n gP M 4 、S 0 2 、C O ．M e a S u r e m e n t sw e r e t a k e ni na s t h m a t i cc h i l d r e n ’sh o u s e ．T od e t e c t1 6 ，2 7l o c u so f p2 ．A Ra n dA C E g e n e t i cp o l y m o r p h i s m s ．S oa st of i n do u tt h el i n k a g eb e t w e e nc h i l d h o o da s m m aa I l d i n t e r a c t i o no fi n d o o ra i rp o l l u t a n t sf r o mb u r n i n gc o a la n dg e n e t i cp o l y m o r p h i s m s s u s c e p t i b l et Oa s t h m a ． [ M e t h o d s ] B a s i ci n f o r m a t i o n sa n d b l o o d s a m p l e so fa s t h m a t i cc h i l d r e nw e r e o o l l e c t e d P C Rw a su s e dt Od e t e c t 1 6 ，2 7l o c u so fD2 一A Ra n dA C Eg e n e t i c p o l y m o r p h i s m s M e a s u r e m e n t sf o rP M 4 、S 0 2 、C Ow e r et a k e ni nc o u n t ya n d c o u n t r y r e s p e c t i v e l y ．G e n o t y p ef r e q u e n c i e so ft h r e eg e n e t i cp o l y m o r p h i s m sw e r ec a l c u l a t e d ． U s i n gt h ee p i d e m i o l o g i cm e t h o do fc a s e o n l ys t u d y , t h ei n t e r a c t i o no fi n d o o ra i r p o l l u t a n t sf r o mb u r n i n gc o a la n dg e n e t i cp o l y m o I p h i s m ss u s c e p t i b l et Oa s t h m aw a s a n a l y z e d ． ’ [ R e s u l t s ] P M 4 ，S 0 2a n dC Oc o n c e n t r a t i o n so fc o u n t ya l ew i t h i nC 0 1 ．n o ns t a n d a r d s ． P M 4 ，S 0 2c o n c e n t r a t i o n so fc o u n t r ya l ei ne x c e s so fc o m m o ns t a n d a r d sf o r6 7 ％a n d 6 1 ％r e s p e c t i v e l yw h i l eC Oc o n c e n t r a t i o ni sw i t h i ng u i d e l i n e ．T h ef r e q u e n c i e so f 3 A r g ／A r g ．G l y ／G l y ．A r g ／G l yg e n o t y p e s o f1 6l o c u so fB2 一A Ra r e1 3 ．9 ％，1 3 - 4 ％ 7 2 ．7 ％r e s p e c t i v e l y ．T h ef r e q u e n c i e so fG l n ／G l n ，G l u ／G l u ，G l n ／G l ug e n o t y p e so f2 7 l o c u so fD2 ．A Ra r e1 3 ．9 ％，4 ．3 ％，8 1 ．8 ％r e s p e c t i v e l yT h ef r e q u e n c i e so fI I ，D D I Dg e n o t y p e so fA C Ea r e4 9 ．3 ％，2 0 ．0 ％，3 0 ．7 ％r e s p e c t i v e l y ．A f t e rc o n t r o l l i n g c o n f o u n d i n gf a c t o r so fn a t i o n ，f a m i l ya s t h m ah i s t o r ya n da g er e s p e c t i v e l y , i td o e s n ’t c o n c l u d e dt h a ti n t e r a c t i o n so fi n d o o ra i rp o l l u t a n t sf r o mb u r n i n gc o a la n dt h r e e g e n e t i cp o l y m o r p h i s m ss u s c e p t i b l et Oa s t h m ae x i s td u r i n gm eh a p p e no fc h i l d h o o d a s t h m a ． [ C o n c l u s i o n s ] T h ep r o b l e mo fi n d o o ra i rp o l l u t i o nf r o mb u r n i n gc o a l i ss e r i o u s ， e s p e c i a l l yi nt h ec o u n t r y ．D i s t r i b u t i o n so f t h r e eg e n e t i cp o l y m o r p h i s m sa r ed i f f e r e n t f r o mo t h e rs t u d i e sp o s s i b l yb e c a u s eo fn a t i o na n dr e g i o n ．A n a l y s i so fi n t e r a c t i o no f i n d o o ra i rp o l l u t a n t sf r o mb u r n i n gc o a la n dg e n e t i cp o l y m o r p h i s m ss u s c e p t i b l et o a s t h m ai si n f l u e n c e db ys o m ef a c t o r si nt h es t u d y , S Ot h er e l a t i o n s h i ps h o u l db e t e s t i f i e db ym o r es t u d i e s ． [ K e y w o r d s ] i n d o o ra i rp o l l u t a n t s f r o mb u r n i n gc o a l ；g e n e t i cp o l y m o r p h i s m s s u s c e p t i b l et oa s t h m a ；i n t e r a c t i o n ；c a s e o n l ys t u d y ；c h i l d h o o da s t h m a 4 前言 支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T 淋巴细胞等多种炎性细胞参 与的一种以气道高反应性为特征的气道慢性炎症性疾病。 大量的流行病学研究表明，世界范围内儿童哮喘的发病率呈逐年上升的趋 势。在新西兰，从1 9 6 9 年的7 ．1 ％上升到1 9 8 2 年的1 3 ．5 ％；在澳大利亚墨尔本， 5 岁儿童哮喘的发病率从1 9 6 0 年的1 9 ％增加到1 9 9 0 年的4 6 ％t 1 1 。美国自2 0 世 纪8 0 年代以来，哮喘患者的人数已经增加了6 0 ％，l f l 前大约有1 0 0 0 万人患有 哮喘，特别是5 0 ％以上的哮喘病人年龄在1 4 岁以下；苏格兰的调查显示，8 ～ 1 3 岁儿童哮喘患病率在1 9 8 9 年已达到1 0 ．2 ％，显著高于1 9 6 4 年的4 ．1 ％[ Z l 。日 本在2 0 世纪6 0 年代为O ．5 ％一0 ．7 ％，7 0 年代上升为1 ．5 ％～4 ．O ％，9 0 年代进一 步上升至4 ．O ％～6 ．0 ％t 3 ] 。 尽管国内资料显示，我国各地儿童哮喘的发病率在0 ．1 1 ％～2 ．0 3 ％之间，差 异近2 0 倍【4 】，但1 9 9 0 年和2 0 0 0 年分别对2 7 个省市0 ～1 4 岁儿童进行的哮喘 流行病学调查结果表明，患病率由1 9 9 0 年的0 ．9 1 ％_ k 升到2 0 0 0 年的1 ．5 ％t s q 。 我国台湾省5 1 5 岁儿童哮喘患病率由1 9 7 4 年的1 ．3 ％上升到1 9 8 5 年的5 ．0 7 ％， 到1 9 9 , 4 年达1 0 ．8 ％t 6 J 。 据初步估计，全世界每年用于治疗哮喘的费用高达3 0 亿美元，其花费超过 艾滋病和结核病二者的总和，而且还在逐年增长，原因不明，该现象已经引起 W H O 、世界各国政府以及临床医生的广泛和高度关注【7 】o 哮喘是遗传和环境共同作用引起的复杂疾病，其发病与过敏原 如引起感 染的病原体及其毒素、吸入物、食物等 、非特异性刺激物质 如灰尘、烟、气 味等 、气候 如气温突然变冷或气压降低 、精神因素 如大哭大笑或激怒恐 惧 、遗传因素 患儿家庭及个人过敏史，如哮喘、婴儿湿疹、荨麻疹、过敏性 鼻炎等的患病率较一般群体为高 、药物 阿司匹林、心得平、心得安等 、运 动等因素有关。然而，目前对几十年来儿童哮喘发病率不断上升的根本原因还 知之甚少。虽然有学者认为空气污染日趋严重可能是儿童支气管哮喘患病率增 加的重要原因之一，但对多种因素在儿童哮喘的引发及加重过程中起的作用仍 然说法不一，特别是各种因素之间是否相互干扰或存在联合作用尚不明确。 研究拟选择燃煤型室内空气污染严重地区为现场，通过检测室内常见空气 污染物，包括粒径小于4 _ u ／1 2 的颗粒物 P M 4 、二氧化硫 s 0 2 、一氧化碳 C O 的含量以及哮喘患儿的D2 肾上腺素能受体 02 一A R 基因第1 6 、2 7 位点多态 性和血管紧张素转移酶 A C E 基因插入，缺失 I ／D 多态性，了解当地哮喘 几童居室内燃煤型空气污染物 P M 4 、S 0 2 、C O 的暴露水平和哮喘儿童中三 种哮喘易感基因的分布频率，进而揭示燃煤型室内空气污染物 P 1 V 1 4 、S 0 2 、 C O 和哮喘易感基因的交互作用与儿童哮喘发病风险的关系。 一、研究对象 一 对象收集 研究对象及方法 1 ．病例来源贵州省贵定县第二人民医院和各乡镇卫生院诊治的哮喘儿童病例 包括住院和门诊病例 ； 2 ．纳入标准 1 按照“1 9 9 8 年全国儿科哮喘防治协作组制定的标准[ 8 1 ”确诊的哮喘病例； 2 年龄为1 ～1 4 周岁的儿童； 3 居住于该县辖区至少半年以上。 3 ．收集方法和时问采用序贯收集病例的方法从2 0 0 4 年9 月起至2 0 0 5 年9 月止进行收集。 二 样本含量估计 本研究采用单纯病例研究‘9 1 的流行病学研究方法，正常人群中估计的环境 暴露率、基因型频率、估计的基因型与环境暴露的交互作用O R 值、无该基因 型组环境暴露作用的O R 值、无环境暴露组易感基因型作用的O R 值等是影响 单纯病例研究样本舍量大小的主要因素，实际工作中一般以常规病例对照研究 估计主效应大小所需病例和对照样本总量来计算单纯病例研究估计交互作用所 需的病例样本量‘1 0 1 。 n 5 等铲⋯P l2 尚u o v ．，芦 半，列．．．。”弋丽，其中2 而瓣习，芦2 半，虿_ l - 芦。 本次研究共检．a q _ ．- - 个易感基因多态性，将健康儿童三种易感基因型中暴露 频率最低的作为p o ，这样算出的样本量最大，同时可满足估计燃煤型室内空气 污染物和三种易感基因交互作用所需的样本量。 根据健康儿童中估计的口2 一A R 基因第1 6 位点G i n ／G i n 基因型频率为 1 6 ％t 圳、估计该基因型暴露的O R 值为3 ．5 、希望达到的检验显著性水平0 【 o ．0 5 、 希望达到的检验把握度1 一D O ．9 0 ，计算得到样本量为2 0 8 。 二、研究方法 一 研究总体设计 本次研究的重点是探索基因与环境因素在儿童哮喘发病中是否存在交互作 用以及交互作用的大小和方向。传统的病例对照研究和队列研究虽然也常用于 分析交互作用，但需要的样本量较大且统计效率较低，采用单纯病例研究则可 以以较少的研究对象获得更精确的交互作用O R 值可信区间。 单纯病例研究的基本原理【9 1 如下 确定某一患者群 体作为研究对象 收集病人的一般情况、环境 暴露资料，并采集生物标本 二 研究对象基本信息调查 在确定为收集病例的医院儿科门诊和住院病房，采用面访方式调查哮喘儿 童的监护人 父母或其他知l C r 者- ，收集患儿的一般情况、家族史、家庭做饭取 暖情况等信息。调查表见附表Ⅸ哮喘儿童一般情况调查表。 三 采集研究对象血样 1 ．采血人员由贵州省贵定县第二人民医院委派专业人员 1 ～2 人 完成。 2 ．采血部4 i 患儿肘部静脉 小儿可在颈静脉、股静脉 。 3 ．采血时机住院病例在清晨进行，门诊病例在门诊诊疗过程中进行。 4 ．采血量- 每个研究对象5 m l 。 5 ．采集的血液标本装入含有抗凝剂的清洁试管，按顺序编号，置于贵州省贵定 县第二人民医院或各个乡镇卫生院- 2 0 1 2 冰箱保存待检。 四 燃煤型室内空气污染物浓度的测量 1 ．仪器 S 0 2 分析仪 I n t e r s c a n8 1 7 9 0 0 C O 分析仪 i n t e r s c a n8 1 6 9 7 0 m 山分析仪B L P C N TI N S T I T U T E6 9 1 3 0 0 6 温湿度计V A I S A L AR 0 2 4 0 0 0 1 空盒气压表长春气象仪器厂D Y M 3 2 ．测量单位 贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所 3 ．测量内容 室内空气中P M 4 、S 0 2 和C O 的浓度 9 4 ．测量地点 考虑到贵定县县城居民或乡村居民由于生活环境相似，家庭在做饭取暖使 用燃料、炉灶、排烟道情况以及 们对于燃煤型室内空气污染的认知等方面基 本相同，因此，在县城内随机选择2 个家庭，所属乡村随机选择4 个家庭分别 作为县城、乡村的代表，进行采样。 5 ．测量时间 2 0 0 5 年3 月底及2 0 0 6 年3 月底。 6 ．测量方法 以被检测家庭的起居室作为采样地点，采样高度1 m 左右，每天早、中、 晚各采样一次，每次立即读数并记录，连续采样2 天。 7 ．浓度计算 1 由于每次从仪器直接读数结果的单位是p p m ，可按照下面公式将其换算 成以m r d m 3 为单位的浓度 P M 。浓度 m g ／m 3 仪器读数结果 p p m x 0 ．0 1 3 1 s 0 2 浓度 m g ，m 3 仪器读数结果 p p m 0 ．3 8 2 C O 浓度 m g ／m 3 仪器读数结果 p p m x1 ．1 4 5 2 以某种空气污染物所有测量结果的平均值作为该污染物的平均暴露浓度。 8 ．标准 按照国家室内空气质量标准 G B F I 1 8 8 8 3 2 0 0 2 ，s 0 2 标准值为0 ．5 0m g ／m 3 ， C O 标准值为1 0m g ／m 3 ；按照日本办公环境室内空气质量标准Ⅱ舶，m 山标准值 为0 ．1 5m g ／m 3 。 1 n 五 基因多态性的检测及方法 1 ．技术路线 采集研究对象血样， 并保存于一2 0 “ C 冰箱 0 “ c 条件下运回四川大学华 西公共卫生学院，集中检测慢 1 蛩P C R匿 l 扩增Il 判断基因型l 2 ．试剂和仪器 1 试剂 基因组D N A 提纯试剂盒北京赛百盛基因有限公司 1 0 P C R 反应缓冲液北京赛百盛基因有限公司 2 5 m m o l ／L M g C l 2北京赛百盛基因有限公司 1 0 m m 0 1 ／Ld N T P s 北京赛百盛基因有限公司 R e d T a qD N A 聚合酶北京赛百盛基因有限公司 D N AM a r k e r北京赛百盛基因有限公司 G o l d V i e w北京赛百盛基因有限公司 琼脂糖北京赛百盛基因有限公司 三羟甲基氨基甲烷 T r i s 北京赛百盛基因有限公司 硼酸北京赛百盛基因有限公司 引物 日本I n v i t r o g e n 公司 无水乙醇成都金山化工试剂厂 氢氧化钠成都金山化工试剂厂 2 试剂的配制 按照分子克隆实验指南㈣配制0 ．5 T B E 电泳缓冲液。 1 1 3 仪器 高速台式离心机 三用电热恒温水箱 P C R 仪 电泳仪 电泳槽 紫外光检测仪 3 ．检测方法 1 基因组D N A 的提取 上海安亭科学仪器厂T G L - 1 6 8 北京东霞科学仪器厂 B i om e t r a 公司 美国B i o R A Dp o w e rP A C 3 0 0 北京六一仪器厂D Y C P 一3 2 K o d a kG e lL o g i c2 0 0 l 将全血轻轻混匀并转移0 ．5 r r d 到i m l 纯化树脂中，颠倒混匀5 ～6 次。室温下温育 3 分钟，g - , 间颠倒混匀一次，5 0 0 0 r p m 离。3 秒，收集沉淀． 用l m lG N 结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5 0 0 0 r p m 离。3 秒，收集沉淀． J 用O ．5 m l 漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5 0 0 0 r p m 离。3 秒，收集沉淀。 l 用o ．8 m l 无水乙醇悬浮，装入离m 纯化柱，1 2 0 0 0 r p m 离≈1 分钟，倒掉废液收集 l管中的乙醇，再离心1 分钟，尽量除尽乙醇。 I 『将纯化柱装入一个干静的1 ．j I I l l 离心管中，开盖放置2 ～3 分钟使乙醇挥发干净。 I 加入l 。。l 无菌超纯水于纯化树脂上，室温下放置3 分钟，1 3 。o o r p m g , , x2 分钟。 l 离心管中收集的液体即是洗脱下来的基因组D N A 。 i 2 2 基因多态性检测 1 p2 一肾上腺素能受体 p2 一A R 基因采用序列特异引物聚合酶链反应 S S P P C R 方法进行检测。 引物设计n 4 1 1 6 位点精氨酸 A r g 基因引物序列5 - C T T C T T G C T G G C A C C C A A A A 一3 ， 1 6 4 ．i - 点甘氨酸 G l y 基因引物序列5 - C T TC T TG C TG G CA C CC A A A G 一3 ， 2 7 4 - - 点谷氨酰胺 G i n 基因引物序列5 - G G A C C A C G A C G T C A C G C A A C 一3 ， 2 7 位点谷氨酸 G l u 基因引物序列5 ’一G G A C C A C G A C G T C A C G C A A G - 3 ， 统一下游基因引物序列5 ’T G A T G A A G T A G T T G G T G A C C 一3 ≯P C R 扩增 每份D N A 标本，第1 6 、2 7 4 ．- - 点各作2 管P c 皈应。4 个反应管中按上述顺序 分别加入1 种上游引物加．2 肛l ，下游引物- 各- - 0 ．2 肛l ，模板D N A 各2 “l ，1 0 扩增缓 冲液 舍M 9 2 各l 扯l ，R e d T a qD N A 聚合酶 1 U ／9 1 各0 ．4 山，4 种d N T P 混合液 各o ．2 9 l ，最后用水将体积补足至l O u l ． 在P c R 扩增仪上按以下条件进行循环反应9 4 ℃预变性5 f n i n ，按照9 4 ℃变 - l l m i n ，5 7 ℃退火1r n i n ，6 8 ℃延伸l r n j n ，经过3 5 个循环后，6 8 ℃再延伸7 I I l i n 。 电泳 称取琼脂糖1 ．4 9 于烧瓶中，倒入7 0 m l0 ．5 T B E 电泳缓冲液，加热至沸腾， 加入3 ．5 l x l G o l d V i e w ，放置于室温，待温度稍稍下降后倒入电泳槽制备凝胶。 将P C R 扩增产物3 r t l 和上样缓冲液l 山混和，加入加样孔，在恒压1 2 0 V 、 电泳液为0 ．5 T B E 、D N A M a r k e r B 3 1 条件下，电泳6 0 分钟。 1 观察结果 电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下，根据表1 确定基因多态性结果，记 录结果并照相。 表1D ．肾上腺素能受体 D - A R 基因多态性的结果判断 2 血管紧张素转移酶 A C E 基因采用聚合酶链反应 P C R 进行检测。 ≯引物设计‘1 5 1 上游引物序列5 - C T G G A G A C C A C T C C C A T C C T T T C T - 3 ’ 下游引物序列5 - G A T G T G G C C A T C A C A T T C G T C A G AT - 3 ’ ≯P C R 扩增 P c 王皈应管内加入模板D N A 5 耻l ，1 0 扩增缓冲液 含M 9 2 2 ．5 1 d ，R e d T a q D N A 聚合酶 1 U ／p I 1 } L l ，4 d N T P 枞0 ．5 m ，上下游引物加．5 1 ．t l ，最后用 水将体积补足至2 5 u 1 。 在P C R 扩增仪上按以下条件进行循环反应9 4 ℃预变t I 5 m i n ，’按照9 4 ℃变 } 生- 2 m i n ，5 8 “ C 退火1 I I l i n ，7 2 “ C 延伸l m i n ，经过3 0 个循环后，7 2 “ C 再延伸5 m i n 。 1 4 ≯电泳 称取琼脂糖1 ．4 9 于烧瓶中，倒入7 0 m l0 ．5 T B E 电泳缓冲液，加热至沸腾， 加入3 ．5 9 l G o l d V i e w ，放置于室温，待温度稍稍下降后倒入电泳槽制备凝胶。 将P C R 扩增产物3 1 ．t l 和上样缓冲液l g l 混和，加入加样孔，在恒压1 2 0 V 、 电泳液为0 ．5 T B E ，D N A M a r k e r B 3 9 1 条件下，电泳6 0 分钟。 观察结果 电泳结束后，将凝胺放置于紫，l - 史r T ，根据表2 确定基因多态性结果，记 录结果并照相。 表2 血管紧张素转移酶 A C E 基因多态性的结果判断 里堡垦堑鲎苎堑￡堑垄 f № 结果 1 9 04 9 0 三、统计分析内容及方法 一 资料录入及整理 按照收集顺序，每个研究对象的血样和调查表采用相同编号；所有调查表 内容和血样基因多态性检测数据用E p i d a t a3 ．0 进行录入，并做逻辑查错；导入 S P S S l l ．5 软件进行分析。 二 计算基因型分布频率舜口等位基因频率 1 ．基因型频率计算公式 基因型频率 望鼍鬻。。％ 2 ．等位基因频率计算公式 等位基因频率 望兰堡垒堡塑鐾童兰等霎羁弱未孽墅塑墼里幽。。％ 三 统计分析 1 ．对调查表内容和基因多态性检测结果进行分析，包括均数、频率分布描述等。 2 ．判断燃煤型室内空气污染物 P M 4 、S 0 2 和C O 与儿童哮喘基因多态性是 否存在相乘模式的交互作用；如果交互作用存在时，确定交互作用的方向，并 计算交互作用O R 值的大小及其9 5 ％可信区间。 1 定义环境暴露和基因暴露 1 环境暴露 研究对象居室里P M 4 、S 0 2 和C O 三种空气污染物中任意一种 或以上 的 浓度超过了相应标准，就将其定义为燃煤型室内空气污染物 P M n 、S 0 2 和C O 暴露反之三种空气污染物浓度均没有超标，则将其定义为燃煤型室内空气污 染物 P M 4 、S 0 2 乖C O 非暴露。 2 基因暴露 ≯D2 - A R 基因1 6 位点将G l y ／G l y 基因型定义为暴露；A r g ／A r g 、A r g ／G l y 基 因型定义为非暴露㈣。 D2 ．A R 基因2 7 位点将G i n ／G i n 基因型定义为暴露；G l u ／G l u 、G l r d G l u 基 因型定义为非暴露‘1 1 1 。 A C E 基因将D D 基因型定义为暴露；Ⅱ、D 基因型定义为非暴露‘垌。 1 6 将环境及基因暴露资料整理如表3 表3 单纯病例研究资料归纳袁 那么交互作用O R i n t2 瓦a d ，交互作用。‰的芳差砌r o 尺n 三 吉 1 吉 交互作用o ‰的可信区间l n 0 ‰p 5 ％a 1 n O R 。 0 石稠 当讲k l 时，有正相乘模型交互作用；当0 尺0 1 时，无相乘模型交互作 用；当0 心t 2 年，详见图2 。 2 年～ 图2 研究对象在当地居住时间构成 ∞ 加 ∞ 如 ∞ 如 ∞ m o 一啦一甚奄杠 四 家族哮喘史 6 4 ．5 ％ 1 4 9 人 的研究对象亲属中有人患哮喘，其中有1 个亲属患哮喘的 比例最大，为4 9 ．8 ％ 1 1 5 人 ，详见表5 。1 8 5 个患哮喘的亲属中，一级亲属 占7 0 ．3 ％，其余为二级亲属，详见图3 。 一3 0 冰2 5 一 翟2 0 霉1 5 1 0 5 0 表5 研究对象的亲属患哮喘情况 圭星主查垂厶童堂堡△墼垫盛些 墅2 有 有1 人 有2 人 有3 人 无 1 1 5 3 2 2 8 2 4 9 ．8 1 3 ．8 0 ．9 3 5 ．5 合计 2 3 11 0 0 ．0 2 3 ．8 兰 ，常 冀 1 6 8 蠹 ；手。 1 03 净、 。n 1 ’ 1 ．6 凌 霪黉 - I J ．圈．冈．o 黧 1 1 ．4 爱 R 翻 黧 5 ．9 瞵 幅- 蜀 I ，_ 二 篓 终 ．隧 祖 5 , 2 一 母 外 祖 父 父 亲 母 亲 哥 哥 姐 姐 弟 弟 母 图3 患哮喘亲属与研究对象的关系构成 2 l 妹其 妹他 亲属类别 五 做饭和取暖情况 1 ．燃料 8 2 ．7 ％ 1 9 1 人 的研究对象家庭做饭时使用的主要燃料是煤，8 6 ．6 ％ 2 0 0 人 的研究对象家庭取暖时使用的主要燃料是煤 表6 。 表6 研究对象家庭做饭、取暖使用的燃料类型 2 ．炉灶烟道 2 4 ．2 ％ 5 6 人 的研究对象家庭做饭炉灶无排烟道，即使有排烟道但排烟 道出屋的比例也不高 3 5 ．1 ％ 。2 9 ．9 ％的研究对象家庭取暖炉灶无排烟道，有 排烟道但排烟道不出屋的比例为3 7 ．2 ％ 表7 。 表7 研究对象家庭做饭、取暖炉灶的排烟道情况 。_ _ _ - - ●_ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - ●_ _ _ - _ 一 生些查垂盐塑重叁塾 塑盛些 丝2 做饭 有 排烟道出屋 排烟道未出屋 无 合计 取暖 有 8 1 9 4 5 6 2 3 1 3 5 ．1 4 0 ．7 2 4 ．2 1 0 0 ．0 排烟道出屋7 6 3 2 ．9 排烟道未出屋8 6 3 7 ．2 无 6 9 2 9 ．9 合计2 3 1 1 0 0 0 3 ．做饭时小孩在炉灶附近玩耍情况 大人做饭时，1 3 ．4 ％的研究对象“经常’’在炉灶附近玩耍，8 2 ．7 ％t t 有时”、 3 ．9 ％“从不”在炉灶附近玩耍。 4 ．做饭、取暖时，家长对室内空气的主观感受 做饭时，7 7 ．9 ％ 1 8 0 人 的家长“有时”觉得呛人或眼睛被熏得难受、流 泪，“经常”的为3 ．9 ％ 9 人 。取暖时，8 3 ．1 ％ 1 9 2 人 的家长“有时”觉得 呛人或眼睛被熏得难受、流泪，“经常’’的为2 ．6 ％ 6 人 。详见表8 。 袁8 做饭、取暖时家长对室内空气的主观感受 二、燃煤型室内空气污染物浓度 6 个研究对象家庭共3 6 次测量结果的平均值见表9 。结果显示县城被检家 庭的P M 4 、S 0 2 、C O 三种空气污染物浓度均未超标，乡村的P M 4 、S 0 2 浓度超 标，C O 浓度没有超标。 表9 县城和乡村燃煤型室内空气污染物的平均浓度 m g ／m 3 竺Qi Q 2些 标准 1 00 ．5 O ．1 5 县城 乡村 1 ．4 3 1 8 ．3 6 2 0 ．0 2 5 0 ．8 0 5 0 ．1 1 6 O ．2 5 0 三、基因多态性 一 p2 ．肾上腺素能受体 D2 ．A R 基因 1 6 住．女 1 3 ．4 ％ 3 1 人 的研究对象为G l y ／G l y 纯合子，7 2 ．7 ％ 1 6 8 人 为A r g ／G l y 杂合子，G l y 等位基因频率为4 9 ．8 ％ 表1 0 。 表1 0D2 - A R 基因1 6 位点基因型频率和等位基因频率 A r g ／A r g G l y ／G l yA r g ／G l yA r gG