燃煤型砷中毒皮损D13S153、D9S287位点微卫星不稳定性的研究.pdf

硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损 D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 英文缩写一览表 英 文缩写英文全称中文全称 b y K b p d d H 2 0 DNA DNa s e d NT P E DT A GI R E m m h MMR MS 1 L OH CAP P T C H b a s e p a i r k i l o b a s e p a i r d e i o n i z e d wa t e r d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d e o x y r i b o n u c l e a s e d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i n i t r i l o t e t r a a c e t i c a c i d g e n o m e i n s t a b i l i ty h e m a t o x y l in a n d e o s i n mi n u t e h o u r mi s m a t c h re p a i r m i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i ty l o s s o f h e t e r o z y g o s ity c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g T h e h u m a n h o m o l o g u e o f D r o s o p h i l a p a t c h e d a l l e l i c i n s t a b i l i ty o p t i c a l d e n s i ty p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n s i n g l e s t r a n d e d D N A s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s T r i s l b o r a t e E DT A e l e c t ro p h o r e s i s b u f f e r t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r ih y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e v o l t 碱基对 千碱基对 去离子水 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸酶 脱氧三磷酸核昔 乙二胺四乙酸 基因不稳定 苏木精和伊红 分钟 小时 错配修复 微卫星不稳定性 杂合性缺失 燃煤型砷中 毒 与人类同源的果蝇的补丁 AI OD P C R s s - DNA S S R s TBE T E ME D T r i s V 等位基因不稳 光密度 聚合酶链反应 单链D N A 简单重复序列 T r i s - 硼酸一 E D T A 电泳缓冲液 四甲基乙二胺 三轻甲基氨基甲烷 伏特 硕士研究生毕业论文 嫩煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 英文缩写一览表 英 文缩写英文全称 T S G I ARC M M K A P ARP c e l l b a s a l c a r c i n o m a a l i g n a n t m e l a n o m a s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a K e r a t o a c a n t h o m a p o l y A D P -r i b o s e p o l y rn e r a s e 中文全称 肿瘤抑癌基因 国际癌症研究中心 基底细胞癌 恶性黑素瘤 鳞状细胞癌 黑棘皮瘤 A D P 一核糖多聚酶 硕 L 研究生毕业论文 嫩煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 位点微卫星不稳定性的研究 摘要 目的观 察 微 卫 星D N A 不 稳 定 性 及 杂 合 性 缺 失 在 燃 煤 型 砷 中 毒 患 者 皮 肤 病 变中 的 表 达 并 探讨其与燃煤型砷中毒临床病理特点、临床分度及病程之间的关系。 方法 选 取D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 两 个 微 卫 星多 态 性 标 记， 采 用P C R 扩增 一 变 性聚丙 烯酞 胺 凝胶电泳一 银染法检测不同病理类型的C A P 患者微卫星的改变。 结果 3 4 例 燃 煤 型 砷中 毒 皮损 组 织D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 两 个 微卫 星 位点 微卫 星不 稳定 性 的发生率为2 9 . 4 1 1 0 / 3 4 ， 杂合性缺失的发生率为2 0 . 5 9 7 / 3 4 ，微卫星的改变与病 理分型相关 p 0 . 0 5 0 结论 微卫 星不 稳 定 性和杂合 性缺失 可 能 在砷中 毒 皮 损 癌 变的 发 生、 发展中 起重要 作 用，并且是诊断砷中毒皮肤癌有价值的分子生物学标记。 I 关键词I 砷 中 毒 ; 微 卫 星D N A ; 微 卫 星 不 稳 定 性 ; 杂 合 性 缺 失 硕士研究生毕业论文姗煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 D e t e c t i o n o f m i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i ty i n D 1 3 S 1 5 3 a n d d 9 s 2 8 7 l o c i i n l e s i o n s o f t h e p a t i e n t s w i t h c o a la r s e n i c p o i s o n i n g Ab s t r a c t O b j e c t i v e T o d e t e c t m i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y M S I a n d l o s s o f h e t e r o z - y g o s i t y L O H i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g C A P s k i n l e s i o n s , e s p e c i a l l y s k i n c a r c i n o m a , a n d t o e x p l o r e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n M S I a n d c l i n i c p a t h o l o g i c f e a t u r e s , c l i n i c a l g r a d e s a n d d i f f e r e n t c o u r s e s o f c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g . Me t h o d s t w o h i g h p o l y m o r p h i c m i c r o s a t e l l i t e m a r k e r s D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 w e r e s e l e c t e d t o i n v e s t i g a t e m i c r o s a t e l l i t e a l t e r n a t i o n s s u c h a s M S I a n d L O H i n 3 4 c a s e s o f c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g s k i n l e s i o n s b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n P C R - d e n a t u r e d p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s - s i l v e r s t a i n i n g , t o c o m p a r e t h e r e s u l t s w i t h t h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a l p a r a m e t e r s R e s u l t s 3 4 c a s e s o f c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g s k i n l e s i o n s t i s s u e s i n D 1 3 S 1 5 3 a n d d 9 s 2 8 7 l o c i s h o w e d t h a t t h e p o s i t i v e M S I a n d L O H a r e 2 9 . 4 1 1 0 / 3 4 a n d 2 0 . 5 9 7 / 3 4 r e s p e c t i v e l y . m i c r o s a t e l l i t e a l t e r n a t i o n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h p a t h o l o g i c a l t y p e s P 0 . 0 5 Co n c l u s i o n s p r o g r e s s i o n o f M S I a n d L O H m a y p l a y a c e r t a i n r o l e i n t h e c a r c i n o g e n e s i s a n d C A P s k i n l e s i o n s a n d t h e y m a y b e v a l u a b l e m o l e c u l a r m a r k e r s i n d i a g n o s i s o f C A P s k i n c a i c i n o m a s . K e y w o r d sA r s e n i c p o i s o n i n g ; M i c r o s a t e l l i t e D N A ; M i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y ; L o s s o f h e t e r o z y g o s i t y 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 前言 燃煤型砷中毒 c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g C A P 是主要见于贵州省黔西南自 治州的 一种地方病， 从1 9 7 6 发现至今， 患病人数已逾2 0 0 0 人， 且发病人数还在不断上升。 C A P 患者除有不同角度的皮肤色素沉着或减退、 角化过度、 增生外， 部分己发展为基底细胞 癌、鳞状细胞癌.停用砷煤及驱砷治疗后，原有皮损仍继续加重且发展为皮肤癌。 在己 死亡的6 5 例癌症病人中， 死于皮肤癌者多达2 1 例〔 u。 过去，国内 外学者对C A P 做了 大量的研究，这些研究主要集中 在流行病学调查， 中毒动物模型实验研究， 一些生化指标如体内轻脯氨酸 H o p 、 谷光甘肤硫转移酶 G S T 的 检测【‘ ， ， p 1 6 , p 2 1 “ “ “ “ , C y c l i n D l 蛋白 的 表达〔， ， ， 血细胞D N A 单 链的 断 裂〔‘ ， 等但 对其 发展为皮肤癌机制的研究至今仍未取得突破性进展。 肿瘤分子遗传学研究表明， 一个正常细胞逐步获得恶性表型需要多个遗传改变的积 累。一类是癌基因的激活、抑癌基因 T S G 的失活和细胞调亡相关基因异常等;另一 类是近来发现的基因不稳定 g e n o m e i n s t a b i l i t y , G I ，基因不稳定分为染色体不稳 定 C h r o m o s o m e i n s t a b i l i t y , C I 和微卫星不稳定 m i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y , M S I 两 类r ] 。 近年 来， 人们的 研究 主 要 集中 在M S I 途径， 认为它是肿瘤发生的 一 种新机 制。 M S 工 是复制错误引起的简单重复序列的改变，与细胞恶性转化和细胞遗传物质的不 稳定有关，目前认 M S I 和杂合性缺失 l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y , L O H 与错配修复系 统 m i s m a t c h r e p a i r , M M R 有关， 它是真核细胞中 存在的一种修复D N A 碱基错配的 安 全保障体系， 这种保障体系是由一系列特异性修复D N A 碱基错配的酶分子组成，它可以 保证遗传物质的完整性和稳定性， 避免遗传物质突变产生。如果基因突变或缺失，D N A 复制时形成的错配不能及时修复， 且不断积累， 将导致基因非表达区的简单重复序列的 改变即M S I ， 使细胞增殖和分裂异常而导 致肿瘤的发生。 近年研究 表明 〔0 1 , M S I 和L O H 与 肿瘤的 发生、 发展密 切相关， 是近年肿瘤机制 研究 的热点。我们既往在对燃煤型砷中毒 c o a l a r s e n i c p o i s o n i n g , C A P 患者的研究中 发现与p 1 6 , p 5 3 基因紧密连锁的D 9 S 3 1 9 , T P 5 3 .P C R 1 5 两个微卫星 m i c r o s a t e l l i t e , 硕士研究生毕业论文嫩煤型砷中毒皮损D 1 3 s 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 M S 位 点 存 在M S I 和L O H I7 } 。 为 了 进 一 步 探 讨 砷 中 毒 致 皮 肤 癌 的 机 理 ， 我 们 又 对 与 人 类 同源的果蝇补丁基因 T h e h u m a n h o m o l o g u e o f D r o s o p h i l a p a t c h e d , P T C H 紧密连 锁的D 9 S 2 8 7 及与R b 基因紧密连锁的D 1 3 S 1 5 3 两个M S 位点进行检测，并分析了它们 与临 床分级、 病程及病理特征的关系， 希望从新的角度揭示砷中 毒致皮肤癌的 机理， 为 其诊治和预防探索新的途径。 硕士研究生毕业论文 燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 材料和方法 一、临床资料 I .病例贵州省兴仁县交乐病区C A P 患者2 6 例，其中男1 2 例，女1 4 例;年龄 2 8 6 5 岁，平均5 4 . 6 岁。病程2 - 2 6 年， 平均1 7 . 6 年。按病程分组， 2 0 年 1 4 例 。 按照 慢 性砷中 毒临 床分度标 准‘. ， ， 其中I 度 例8 , I I 度 1 2 例 ，I I I 度 6 例 。 2 .标本按皮肤病理组织活检法从2 6 例C A P 患者中切取皮损组织3 4 个， 切取后 立即将皮损组织与周围正常皮肤组织分开，皮损组织分为两份，一份标本用 1 0 的甲醛 固定，另一份立即放置- 8 0 0 C 超低温冰箱中保存备用。 3 .病理分型取福尔马林固定的病变组织石蜡包埋， H E 染色。 按照慢性砷中毒皮 肤病理改变分型标准[9 ] 本组中良 性型1 3 例，中间型1 6 例， 恶性型5 例。 4 . 主要试剂 1 D N A 抽提试剂U N I Q - 1 0 柱式临床样品基因组抽提试剂盒S K 1 1 4 2〔 上海生工生 物工程技术服务有限公司 2 P C A 扩增试剂即用P C R 扩增试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司 3 琼脂糖及垂直电泳试剂 琼脂糖 S p a n i s h , 1 0 0 6 p D N A L a d d e r 华美生物 工程公司 ， P A G E 电泳玻璃板硅化处理试剂 A M R E S C O , U S ， 丙烯酞胺/ 甲叉双丙烯酞胺 1 9 1 ，上海生工生物工程限公司 ， 尿素 A M R E S C O , U S A ，去离子甲酞胺 A M R E S C O , U S A , T E M E D A M R E S C O , U S A . 4 银染试剂 硝酸银 A M R E S C O , U S A ， 无水碳酸钠 A M R E S C O , U S A , 硝酸 遵 义高等师专化学试剂厂 ，甲醛 重庆无机化学试剂厂 ，乙酸 重庆东方试剂厂 。 5 .主要溶液配制 1 T E 缓冲液 T r i s - C l一 O m m o l / L E D T A l m m o l / L N a C l 1 0 0 m m o l / L 2 0 . 5 m o l / L E D T A 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 E D T A - N a . 2H,0 超纯水 3 l m o l / L T r i s T r i s碱 超纯水 4 1 0 X T B E T r i s 碱 硼酸 0 . 5 m o l / L E D T A 超纯水 5 8 的变性丙烯酞胺凝胶溶液 尿素 超纯 丙烯酞胺/ 双丙烯酞胺 1 9 1 1 0 X T B E 超纯水 总体积 6 变性载样缓冲液 去离子甲酞胺 E D T A 二甲苯青F F 溟酚蓝 M 1 0 过硫酸酸胺 过硫酸胺 超纯水 8 1 0 无水乙醇 无水乙醇 超纯水 9 1 硝酸 浓硝酸 1 8 6 . 1 g 定容 l 0 0 0 m lP H 8 . 0 1 2 1 . 9 1 g 定容 1 0 0 0 m l P H 8 . 0 1 0 8 8 5 5 g 4 0 m l 定容 P H 8 . 0 l 0 0 0 m l 8 4 g 4 0 m l 2 0 m l 7 0 m l 2 0 0 m 1 9 8 l m m o l / L 0 . 5 0 . 0 2 5 0 . 5 g 5 0 m l 1 0 0 m l 9 0 0 m l 1 5 m 1 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S I S 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 超纯水 1 0 0 . 2 8 碳酸钠 含 0 . 0 1 9 甲醛 9 8 5 m 1 无水碳酸钠 3 7 - 4 0 甲醛 超纯水 3 0 g 5 0 0 u 1 定容 1 0 0 0 m 1 1 1 0 . 0 1 2 M 硝酸银 含甲醛l u l / m l 硝酸银 3 7 - 4 0 甲醛 超纯水 1 2 1 0 冰乙酸 冰乙酸 超纯水 6 .主要仪器及设备 2 . 0 3 8 4 4 g 1 0 0 0 u 1 定容 1 0 0 0 m 1 1 0 0 m 1 9 0 0 m 1 - 8 0 0 - 2 0 0 C 超低温冰箱 C低温冰箱 电子天平 高压蒸汽消毒锅 台式高速离心机 7 5 0 1 型紫外分光光度计 多功能梯度P C R 仪 D Y Y - 1 1 1 3 1 A 型水平电泳仪 垂直电泳装置 电热恒温水温箱 全自 动数码成像及分析系统 紫外分光光度计 光学显微镜 台式p H 仪 台式超声粉碎仪 烤箱 U S A 青岛海尔 1 / 1 0 0 0 0 , S a r t o r i u s，G e r m a n y 国产 型号 5 4 1 5 D , E p p e n g d o r f，G e r m a n y 上海天美科学仪器有限公司 E p p e n g d o r f， G e r m a n y 北京六一厂 B i d - R a d 公司，U S A 上海医用恒温设备厂 S y n G e n e , C a m b r i d g e , E n g l a n d 7 5 0 1 型， 上海天美科学仪器有限公司 O y l m p u s , J a n p a n J e n w a y , U N K M S E , U N K E C O C E L L 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 二、 实验方法 1 . C A P 皮损病理分型 取病变组织常规石蜡包埋、切片，H E 染色， 光镜下鉴定病 理类型。 按慢性砷中 毒皮肤病理 改 变分 型标准19 1 。 将C A P 皮损组 织分为 三型， 即良 性型 庆状角化、乳突状瘤;中间型老年角化病样、角化棘皮瘤;恶性型B o w e n 病、基底 细胞癌、鳞状细胞癌。 2 . 基因组D N A 提取 1 试剂D N A抽提试剂 U N I Q - 1 0 柱式临床样品基因组抽提试剂盒S K 1 1 4 2 上海 生工生物工程技术服务有限公司 试剂盒组成 U N I Q - 1 0 C o l u m n 1 0 0 2 - m l C o l l e c t i o n T u b e 1 0 0 B i n d i n g B u f f e r 3 5 m 1 W a s h S o l u t i o n 2 2 m l E l u t i o n B u f f e r 4 m 1 2 D N A 提取方法 3 2 5 - 3 0 m g 组织用手术刀切成小块。 、 4 将粉末收集到1 . 5 m 1 离心管中， 用4 0 0 9 1 T E 悬浮， 再用超声细胞破碎仪打成匀 浆。 3 将制备的 4 0 0 9 1样品中，加入 8 0 0 u l D i g e s t i o n B u f f e r , 混匀，再加入 3 u 1 P r o t e i n a s e K , 混匀， 5 5 0 C 保 温3 小 时。 4 加入4 0 0 9 1 无水乙醇， 混匀， 然后用 1 - m l T i p 头将样品全部转移到套放于2 - m l 收集管内的U N I Q - 1 0 柱中。 5 8 , 0 0 0 r p m 室温离心1 分钟。 6 取下U N I Q - 1 0 柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入5 0 0 9 1 W a s h S o l u t i o n , 1 0 , 0 0 0 离心3 0 秒。 7 重复步骤 6 一次。 8 取下U N I Q - 1 0 柱，弃去收集管中的全部废液。将柱放回收集管中，1 0 , 0 0 0 r p m , 室温离心1 5 秒，以弃去残留W a s h S o l u t i o n . 9 将柱放入新的洁净的1 . 5 m 1 离心管中，在柱中央加入5 0 卜 1 E l u t i o n B u f f e r ， 室 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 温放置2 分钟。 为提高洗脱率，可以将B u f f e r 预热到5 5 - 8 0 0 C 1 0 1 0 , O O O r p m ， 室温离心1 分钟。 离心管中的液体即为基因组D N A 。 将样品保存于 4 0 C 或一 2 0 0 C 冰箱中备用。 3 . D N A 浓度及纯度测定 1 取3 W I D N A 样品加蒸馏水到3 m 1 , 混匀。 2 以3 m 1 蒸馏水做空白对照。 3 分别测量波长2 6 0 n m 和2 8 0 n m 的光密度值 O D 值 ，两者之比值 A 2 6 0 / A 2 8 0 可 反映D N A 的纯度。 纯品D N A 的A 2 6 0 / A 2 8 0 为1 . 8 ， 如果样品中 有蛋白质或其他吸收紫外波 长的杂质，比值明显降低，可用W a s h S o l u t i o n 再洗脱。 4 用紫外分光光度计测量D N A 含量按I O D , } 5 0 P g 基因组D N A . 5 将D N A 样品稀释到l 0 0 n g 邝1 备用。 4 . D N A 微卫星不稳定性 M S 1 和杂合性缺失 L O H 的检测 1 D N A 微卫星序列的扩增 P C R 方法 ① 试剂 P C A 扩增试剂即用P C R 扩增试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司 试剂盒组成 2 X P C R M a s t e r5 X 0 . 5 m 1 S t e r i a l d d H 2 0 2 5 m m o 1 / L M g c 1 2 5X l m l l m l ② 引物引物序列从G e n e b a n k 或G B D 中直接查得，包括D 1 3 s 1 5 3 和D 9 s 2 8 7 两个位 点，由上海生工生物工程公司合成。合成引物的D N A 序列设计 D 9 S 2 8 7 5 A G G A T G C T C C T C A C G C 3 5‘ A C C A C T A C A T T G T T C A A G G G 3 D 1 3 S1 5 3 5‘ A G C A T T G T T T C A T G T T G G T G 3 硕上研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 5 C A G C A G T G A T G A A G G T C T A A G C C 3 ③ P C R 反应体系组成 总体积5 0 9 1 反应体系原浓度组成 模板D N A 1 0 0 n g / w l 1 0 0 n g 上下游引物各l o p m各1 协 111M d N T P 0 . 2 m m o l / 1 5 0 0 u M T a q 酶0 . 1 U / 9 1 2 . 5 2 XP C R 缓冲液5 . O w l M g c l , 3 m m o l / l 7 . 5 m M 加d d H , O 至总体积 5 0 9 1 , ④ 反应条件 9 4 C 预变性2 m i n - - 9 4 C 变性4 5 S e c , 5 4 0 C 退火4 5 S e c , 7 2 0 C 延伸l m i n ，共3 5 个循环 7 2 C 继续延伸 1 O m i n 5 .3 的琼脂糖电泳 P C R 扩增产物 1 0 9 1 与2 9 1 的上样缓冲液 0 . 2 5 9 澳酚蓝一4 0 9 蔗糖水溶液混匀， 取1 0 9 1 加样。 病变组织与相应的正常对照组织配对加样。电压 6 5 V ， 时间4 5 m i .n ， 温 度2 5 C ， 电泳缓冲液0 . 5 X T B E . 紫外灯下结果观察。 扩增产物阳性用于M S I 和L O H 分析。 6. 丙烯酸胺凝胶电泳 将 匀， 9 5 0 C P C R 扩增产物用于M S I 分析，取P C R 扩增产物1 0 9 1 与2 9 1 的变性载样缓冲液混 变性5 m i n , 迅速置于0 0 C的冰浴中， 取 1 0 9 1 上样于8 变性聚丙烯酞胺凝胶 含 7 m o l / L尿素内，病变组织与相应的正常对照组织配对加样。电压5 5 V ， 时间 3 h , 温度 2 5 “ C ,缓冲液 1 x T B E 。待二甲苯青接近胶下缘时， 关闭电 源，取下凝胶，银染后 观察结果。 - 7 .变性聚丙烯酞胺凝胶硝酸银染色 1 染色步骤 1 0 乙醇固定5 m i n ， 超纯水漂洗2 次， 名 1 M肖 酸溶液氧化 5 m i n ，超纯水漂洗 2 次， 1 0 . 0 1 2 M 硝酸银 含甲醛，1 4 1 / m l 染色2 0 m i n ，超纯水漂洗3 S e c , 硕士研究生毕业论文 燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 3 3 . D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 0 . 2 8 M 碳酸钠 含甲 醛， 0 . 5 w 1 / m l 还原显色， 时间视染色情况而定， 鑫 1 0 乙酸终止反应，凝胶保存于1 X T B E 缓冲液中。 2 染色结果的观察记录 变性聚丙烯酞胺凝胶银染结果在凝胶呈像仪下观察并记录。 三、结果判断 M S I 结果判定病变组织和相应正常组织的D N A 在同一条件下同时进行P C R 扩增， 电泳， 银染， 如果条带完全一致，即M S I 阴性， 如果病变组织扩增产物条带增多或移位 则M S I 阳性。L O H 结果判定和相应的正常组织比较，病变组织扩增产物条带消失或相 对密度减少 5 0 以上为 L O H , M S I和 L O H统称为等位基因不稳定 a l l e l i c i n s t a b i l i t y , A I ，出 现阳性结果者经2 次扩增证实. 四、统计分析 采用S P S S 统计软件处理， 计数资料应用X ， 检验， 检验水准为a 0 . 0 5 , P 0 . 0 5 认为有 统计学差异，P O . 0 1 为有显著差异。 硕士研究生毕业论文燃煤型砷中毒皮损D 1 3 S 1 5 3 , D 9 S 2 8 7 微卫星不稳定性的研究 讨论 砷是国际癌症研究中心 I A R C 确定的人类皮肤和肺的致癌物[ 19 7 ， 但其致癌机制尚 不清楚。目 前认为〔 I 1- 13 ] 砷 对D N A 的 作 用主 要通过 对D N A 的 损伤和 对D N A 修复的 抑制。 前 者系砷通过间接损伤效应如诱发细胞染色体畸变、 姐妹染色单体互换及微核的增加等引 起 D N A损伤作用。 后者系砷具有促裂变原样作用， 诱导人类淋巴 细胞染色体分离[ 14 3 ; 抑 制D N A修复 过程的一个或多 个环节， 导 致基因 变异或 损伤[“ “ o H a r t w i g 等 16 1 人 研究 发 现含疏基的多 聚A D P 一 核 糖多 聚 酶 p o l y A D P - r i b o s e p o l y m e r a s e , P A R P ， 是 真核 细 胞 对D N A 断裂的修复酶之一 体外试验发现亚砷酸钠可与P A R P 结合并抑制其活性， 干扰 D N A 的 修复 功能。 砷对D N A 复 制后 修复也 有抑制 作 用， R o s s m a n 等〔 17 3 发 现砷对 大 肠杆 菌 依赖 R e s A的D N A复制后修复有抑制作用;砷化物还通过干扰 D N A的切除修复机制，增 加 细 胞 对 其 它 致 突 变 剂 或 诱 变 剂 的 敏 感 性 [[18 ] ; 另 有 报 道 砷 对 体 表 皮 肤 组 织 细 胞U V 照 射 引起的D N A 损伤的修复活性也有抑制作用。 因此认为砷通过影响D N A 损伤的修复可致癌 或 致 病 「19] 人类基因组中广泛存在M S ， 是真核细胞基因组中大量而随机出 现的简单串 联重复序 列，也称简单重复序列 s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s , S S R s ，其不仅位于核基因组，也 存在于线粒体D N A中，约占基因组的1 0 。核心序列一般为 1 - 6 b p ,重复5 -1 0 次或更 多。人类基因组中以双核昔酸重复，即 C A n 和 G T n最多，总共有 5 X 1 0 4 - 1 0 5 个， 平均每5 - 5 0 K b D N A 就存在1 个 C A n . M S 多 位于基因非编码区， 基因内 含子或 非翻译区，但在编码序列及外显子中也可找到。大多数 M S无特殊的编码功能，目 前普 遍认为M S 充当基因重组的热点，是基因重排和变异的来源，M S 通过改变D N A 结构或通 过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用， 是一类新的、 多态信息容量高的分子标 志，具有高度多态性和遗传稳定性，广泛用于基因组遗传连锁图的构建、基因定位和克 隆、遗传病的连锁分析和个体鉴定cm } G I 在肿瘤发生中起重要作用。 G I 可分为二种不同的形式，即C I 和M S I . M S 有较高 的突变率，使M S 稳定性差。 M S 重复单位数目 的改变可以引起相当高的多态