MI琼脂法同时检测环境水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌_嵇志远.pdf

2013 年 10 月 October 2013 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 32，No． 5 747 ～752 收稿日期 2013 －04 －23; 接受日期 2013 －05 －20 作者简介 嵇志远， 工程师， 从事水质检测工作。E- mail 95593344 qq． com。 文章编号 02545357 2013 05074706 MI 琼脂法同时检测环境水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌 嵇志远1，王维玮2，文扬3 1． 杭州市水务控股集团有限公司水质监测中心，浙江 杭州310014; 2． 中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;3． 中国人民大学环境学院，北京 100872 摘要 总大肠菌群和大肠埃希氏菌是表征环境水样中粪便污染的两个重要指 标。对这两个指标的检测， 传统的多管发酵法和滤膜法已经无法满足快速、 准确的检测要求。而近年来能够快速测定的固定酶底物技术 DST 已经在 国内开始运用， 但是由于其检测成本较高， 影响了其在基层实验室的推广， MI 琼脂法的出现较好地弥补了这个缺陷。本文应用 MI 琼脂法检测环境水 样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌， 对其方法性能进行了测试和研究， 选择国 家标准方法 远藤琼脂法作为比较对象， 通过菌种加标回收试验比较 MI 琼脂法和远藤琼脂法的灵敏度差异， 通过实际水样的检测验证 MI 琼脂法和 国标法是否具有等效性。结果表明 使用 MI 琼脂法检测总大肠菌群和大肠 埃希氏菌加标样品的平均回收率分别为 89． 2 和 88． 8， 分别高于远藤琼 脂法的 81． 0和 81． 2， 证明 MI 琼脂法的灵敏度高于远藤琼脂法。MI 琼脂法和远藤琼脂法检测总大肠菌 群和大肠埃希氏菌的相关系数分别为0． 9627和 0． 9511， 都具有显著相关性， 且检测结果没有统计学意义上 的差异， 证明两种方法检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌具有等效性。与国家标准方法相比， MI 琼脂法具有 灵敏度高、 操作简便、 检测周期短、 检测成本低、 可同时检测两个指标等优点， 可以替代传统的滤膜法作为检 测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的新方法。 关键词 环境水样; 总大肠菌群; 大肠埃希氏菌; MI 琼脂法; 远藤琼脂法 中图分类号 X171． 5; Q939． 1文献标识码 A 总大肠菌群 Total Coli 和大肠埃希氏菌 Escherichia coli 是指示水体中粪便污染的最重要 的两个细菌学指标。总大肠菌群主要由以下 4 个菌 属细菌组成 埃希氏菌属、 柠檬酸菌属、 克雷伯菌属 和肠杆菌属。与人类生活密切相关的仅有一个种， 即大肠埃希氏菌， 而柠檬酸菌属、 克雷伯菌属和肠杆 菌属所占数量较少。这些菌属可以在人和畜的粪便 中检出， 也可以在营养丰富的水体中检出， 即在非粪 便污染的情况下， 也有检出这些细菌的可能性。作 为粪便污染的指示菌， 大肠埃希氏菌检出的意义最 大， 总大肠菌群的检出意义略差一些 ［1 ］。因此， 对 一般的环境水样可先检测总大肠菌群的存在与否， 再进而根据需要检测大肠埃希氏菌。对这两个指标 的检测， 国内的主要水质标准， 如水和废水监测分 析方法 第四版只收录了多管发酵法和滤膜法 ［2 ］， 目前已经十分落后; 而 2006 版生活饮用水标准检 验方法 虽然新增了能够快速测定的固定酶底物法 Defined Substrate Technology ， 但是由于配套耗材 成本较高， 在基层检测实验室的推广有一定难 度 ［3 ］。目前国内大部分日常检测还是使用原有的 国标方法 远藤琼脂法， 这是一种以远藤琼脂作 为主要培养介质的滤膜法， 其最大的缺点是检测周 期长， 操作繁琐， 方法的干扰因素多， 方法性能不是 十分理想。MI 琼脂法的出现使解决这些问题成为 可能， 该法已经得到美国国家环保署 EPA 的认可， 是 EPA 检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的首 选方法 ［4 ］。 酶底物技术 Enzyme Substrate Technique 是一 747 ChaoXing 种可以快速评价水中总大肠菌群或大肠埃希氏菌的 检测技术。该检测技术利用了目标菌群在选择性培 养基上产生特异性的酶类物质， 进而分解可以起到 指示作用的底物来达到检测目的 ［5 ］。此类选择性 培养 基 亦 被 称 为 显 色 培 养 基 Chromogenic/ Fluorogenic Culture Media 。显色培养基结合了酶 与底物反应的特异性和菌落颜色的可视化信息， 可 以在自然环境中检测和鉴定不同的微生物个体， 尤 其是对混合生长的多种微生物进行检测， 因此被广 泛应用于不同微生物群落结构检测和评价， 是微生 物快速检测方法中的研究热点 ［6 ］。 目前， 能较好地应用于水中总大肠菌群和大肠 埃希氏菌检测的显色培养基主要有 mTEC 琼脂和 MI 琼脂两种。其中 mTEC 琼脂法只能检测大肠埃 希氏菌单个指标， 而 MI 琼脂法能同时检测总大肠 菌群和大肠埃希氏菌两个指标， 显然具有更好的工 效 ［7 －8 ］。MI 琼脂是一种含有 MUGal 4 － 甲基伞形 酮 － β － D － 吡喃半乳糖苷 和 IBDG 吲哚基 － β － D － 葡萄糖苷酸 两种底物的显色培养基。总大肠 菌群和大肠埃希氏菌在 MI 琼脂培养基上能够分别 产生分解 MUGal 和 IBDG 这两种底物的酶类物 质 β － 半 乳 糖 苷 酶 和 β － 葡 萄 糖 醛 酸 酶。 MUGal 被总大肠菌群分解后， 能够在365 nm 紫外光 照射下产生荧光， 同时， 大肠埃希氏菌能够分解 IBDG， 在 MI 琼脂上产生蓝色的菌落 ［9 ］。 由于 MI 琼脂法和远藤琼脂法的过滤操作步骤 相同， 且结果均以 CFU/100 mL 表达， 所以本文运用 MI 琼脂法和国家标准方法 远藤琼脂法同时检 测环境水样中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌， 从两 种方法的灵敏度、 特异性、 检测结果等效性等方面进 行数据分析比较， 验证 MI 琼脂法的技术优势， 为该 技术在国内的推广应用提供参考依据。 1实验部分 1． 1仪器与设备 恒温 培 养 箱 35℃ ，紫 外 检 测 仪 美 国 Spectroline 公司， 功率 6 W， 波长 365 nm 等。 1． 2材料 MI 琼脂培养基 美国 BD 公司 用于 MI 琼脂 法检测。 远藤琼脂培养基、 NA － MUG 培养基、 乳糖蛋白 胨培养基等 用于远藤琼脂法检测。 BioBall总大肠菌群定量质控菌株 产气肠杆 菌 Enterobacter aerogenes ， 生物梅里埃公司， 菌含量 为 30 3 CFU/100 mL， 用于总大肠菌群回收率 试验。 BioBall大肠埃希氏菌 Escherichia coli 定量质 控菌株 生物梅里埃公司， 菌含量为 30 3 CFU/ 100 mL， 用于大肠埃希氏菌回收率试验。 其他材料 醋酸纤维素酯滤膜 0． 45 μm 孔 径 ， 革兰氏染色试剂盒， 生理盐水等。 1． 3两种检测方法实验步骤 1． 3． 1MI 琼脂法 使用经过灭菌处理的微孔滤膜 孔径为 0． 45 μm 过滤 100 mL 水样， 细菌被截留在滤膜上， 将滤 膜贴在 MI 琼脂培养基上， 35℃培养 24 h 后， 在 365 nm 紫外光下产生白色荧光的菌落为总大肠菌群， 在 常光下显蓝色的菌落为大肠埃希氏菌， 未产生荧光 的蓝色菌落一并计入总大肠菌群， 最终结果用 CFU/100 mL 表达 ［9 ］。 1． 3． 2远藤琼脂法 实验步骤参照 生活饮用水标准检验方法 总大 肠菌群和大肠埃希氏菌滤膜法检测步骤 ［ 10 ］。使用经 过灭菌处理的微孔滤膜 孔径为 0． 45 μm 过滤 100 mL 水样， 细菌被截留在滤膜上， 将滤膜贴在远藤琼脂 培养基上， 36℃培养 24 h 后， 计数具有金属光泽的紫 红色菌落， 对此类菌落进行革兰氏染色和乳糖蛋白胨 复发酵试验， 若结果均为阳性则判定为总大肠菌群阳 性菌落。若将远藤琼脂上培养 24 h 的滤膜转移至 NA －MUG 培养基上， 再培养4 h， 在365 nm 紫外光下 产生荧光的菌落即为大肠埃希氏菌。 1． 4回收率试验和地表水样品检测步骤 1． 4． 1加标样品 准备 20 件生活饮用水样品， 将 BioBall水溶性 干粉菌株溶解于相应体积的饮用水样中， 混匀样 品 ［11 ］。分别使用 MI 琼脂法和远藤琼脂法对加标水 样进行总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测， 检测方 法分别等同于 1． 3． 1 节和 1． 3． 2 节， 每个样品平行 测定三次， 取平均值计算其回收率。 1． 4． 2地表水样品 准备 30 件地表水样品， 同时使用 MI 琼脂法和 远藤琼脂法检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌。检测 方法分别等同于 1． 3． 1 节和 1． 3． 2 节。使用 Excel 软件对两组检测结果进行相关性和一致性检验。 2MI 琼脂法和远藤琼脂法的比较 2． 1方法精密度比较 通过定量菌株的加标回收试验可以间接显示 847 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing MI 琼脂法和远藤琼脂法的灵敏度差异。所得平均 回收率占优的方法具有较好的灵敏度。 20 件加标样品的总大肠菌群回收率测试结果 如图1 所示， 使用 MI 琼脂法和远藤琼脂法的平均回 收率分别为 89． 2 和 81． 0。20 件加标样品的大 肠埃希氏菌回收率测试结果如图2 所示， 使用 MI 琼 脂法和远藤琼脂法的平均回收率分别为 88． 8 和 81． 2。可见 MI 琼脂法对目标菌的检出率总体上 要高于远藤琼脂法， 方法灵敏度更佳。 图 1总大肠菌群回收率试验结果 Fig． 1Results of recovery test for total colis 图 2大肠埃希氏菌回收率试验结果 Fig． 2Results of recovery test for Escherichia coli 2． 2水样的检测结果比较 2． 2． 1总大肠菌群 根据图3 拟合的曲线所示， MI 琼脂法和远藤琼 脂法同时检测地表水中总大肠菌群的相关系数达到 了0． 9627， 具有直线回归关系。相关系数 t 检验 t 18．841， P ＜0．05。检验结果表明， MI 琼脂法和远 藤琼脂法检测总大肠菌群的结果具有显著的相关性。 同时， 对图 3 的两组检测结果进行一致性检验， t 检 验 t 1． 641 ＜ t0．05/2， 292． 045 P ＞0． 05， α 0．05 ， 显示 MI 琼脂法和远藤琼脂法同时检测总大肠菌群的 结果没有统计学意义上的差异。相关性和一致性检 验结果证明， 两种方法检测总大肠菌群具有等效性。 图 3地表水样检测总大肠菌群结果 Fig． 3Detection results of surface water samples for total colis 2． 2． 2大肠埃希氏菌 根据图 4 拟合的曲线所示， MI 琼脂法和远藤琼 脂法同时检测地表水中大肠埃希氏菌的相关系数达 到了 0． 9511， 具有直线回归关系。相关系数 t 检验 t 16． 292， P ＜ 0． 05。检验结果表明， MI 琼脂法和 远藤琼脂法检测大肠埃希氏菌的结果具有显著的相 关性。同时， 对图 4 中两组检测结果进行一致性检 验， t 检验 t 1． 893 ＜ t0． 05/2， 29 2． 045 P ＞ 0． 05， α 0． 05 ， 显示 MI 琼脂法和远藤琼脂法同时检测 检测大肠埃希氏菌的结果没有统计学意义上的差 异。相关性和一致性检验结果证明， 两种方法检测 大肠埃希氏菌具有等效性。 图 4地表水样检测大肠埃希氏菌结果 Fig． 4Detection results of surface water samples for Escherichia coli 947 第 5 期嵇志远， 等 MI 琼脂法同时检测环境水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌第 32 卷 ChaoXing 3MI 琼脂法的技术优势 保证微生物安全是世界各国制定生活饮用水卫 生标准遵循的第一原则 ［12 ］。就目前的水质安全形 势而言， 细菌学应急检测的需求将会越来越大， 这就 要求新的检测方法必须尽量缩短检测周期， 提高方 法的特异性和可操作性， 并能够有效控制检测成本， 减轻实验室的资金负担。与传统的国标检测方法 远藤琼脂法、 酶底物法 相比， MI 琼脂法还具备了 以下独特优势。 3． 1检测周期较传统方法大大缩短 MI 琼脂法操作简便， 检测周期短， 可同时检测 总大肠菌群和大肠埃希氏菌两个指标， 大大提高了 检测效率。表 1 归纳了 4 种方法检测总大肠菌群和 大肠埃希氏菌的检测周期， 其中以多管发酵法的检 测周期最长， 远藤琼脂法次之， 固定酶底物法和 MI 琼脂法的检测周期最短。传统的多管发酵法和远藤 琼脂法， 若有阳性检出则需要进行平板划线分离、 革 兰氏染色和多管复发酵的验证步骤， 操作过程十分 繁琐， 不易掌握。而 MI 琼脂法的检测周期仅需 24 h， 只需滤膜过滤操作即可， 无需验证步骤， 易于 操作人员掌握。 表 1检测周期比较结果 Table 1Comparison of detection period 检测方法 总大肠菌群 检测周期/h 文献 大肠埃希氏菌 检测周期/h 文献 多管发酵法72［ 10］48［ 10］ 远藤琼脂法48［ 10］24 4［ 10］ MMO － MUG 酶底物法 24［ 10］24［ 10］ MI 琼脂法24 ［ 9］24［ 9］ 3． 2检测结果的现象较远藤琼脂法更为明显 MI 琼脂法相对于传统的远藤琼脂法， 检测结果 现象明显， 方法干扰小 ［13 ］。由于总大肠菌群在远藤 琼脂上的阳性特征是带有金属光泽的淡红色到紫红 色菌落， 在遇到高浊度或者较为复杂的水样时， 其阳 性特征与淡红色的培养基背景色区分度不高， 其金 属光泽亦容易被滤膜上富集的颗粒物所掩盖， 影响 了计数的准确性 ［14 ］。而 MI 琼脂中的两种酶底物可 以使总大肠菌群菌落在 365 nm 紫外光下产生荧光， 同时使大肠埃希氏菌产生蓝色的菌落， 与培养基的 背景色区分十分明显。相比之下， MI 琼脂法更有利 于阳性菌落的精确计数 ［15 ］。 3． 3检测成本远低于酶底物法 相比于国标收录的 MMO － MUG 酶底物法， MI 琼脂法既兼具了酶底物技术的先天优势， 又极大地 控制了检测成本。MMO － MUG 酶底物法因为需要 使用多孔定量盘等配套耗材， 单个样品的检测成本 在 30． 0 左右。而一瓶 500 g 的 MI 琼脂成品干粉 培养基售价大约是 2200， 可以配制倾倒大约 900 块 MI 琼脂平板， 每块平板的成本不足 2． 5 元， 单个 样品的检测成本远低于 MMO － MUG 酶底物法。 3．4方法的特异性较 MMO －MUG 酶底物法有优势 MI 琼脂法特异性高。根据国外对 MI 琼脂法和 MMO － MUG 酶底物法有关假阳性率和假阴性率的 测试报告， 除了总大肠菌群的假阴性率， MI 琼脂法 要高于 MMO － MUG 酶底物法， 其他结果均低于 MMO － MUG 酶底物法 ［16 －18 ］， 具体数据见表 2。相 比之下， MI 琼脂法总体上具有优势。 表 2假阳性率和假阴性率比较结果 Table 2Comparison of false- positive and false- negative 检测方法 假阳性率/ 总大肠菌群 大肠埃希氏菌 假阴性率/ 总大肠菌群 大肠埃希氏菌 MI 琼脂法 6．94．36．24．3 MMO －MUG 酶底物法 7．49．63．56．3 4结语 传统的细菌学检测方法因为较长的检测周期和 繁琐的验证步骤， 在实际应用中已经难以改进。随 着酶底物技术和荧光检测技术的发展， 显色培养基 被越来越多的被应用于水中各类细菌的检测， MI 琼 脂便是其中之一 ［19 －20 ］。本文通过 MI 琼脂法和远 藤琼脂法定量菌株回收率试验以及两种方法同步检 测地表水样比较， 对 MI 琼脂法的方法性能进行了 基本的测试， 其方法的灵敏度以及和国家标准方法 的等效性能够保证环境水样中总大肠菌群和大肠埃 希氏菌检测结果的可靠性。MI 琼脂法是一种具有 快速、 简便、 抗干扰强等优异性能和成本控制较为理 想的检测方法， 在将来可以完全替代国家标准方法 中传统的滤膜法， 推广为检测环境水样中总大肠菌 群和大肠埃希氏菌的日常检测方法。 本文测试的水样种类有一定的局限性， 缺乏对 一些复杂水样的测试， 如工业用水和重度污染的废 水等。MI 琼脂法是否适用于整个水质检测领域， 需 要开展进一步的研究。 057 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 5参考文献 ［ 1］王秀茹． 预防医学微生物学及检验技术［M］ ． 北京 人民卫生出版社， 2002 676 －679． ［ 2］魏复盛． 水和废水监测分析方法［ M］ ． 北京 中国环境 科学出版社， 2002 696 －700． ［ 3］赵春霞， 张哲海， 厉以强， 梅卓华， 郭晓颖， 沈燕飞． 酶底物法检测环境水样大肠菌群的探讨［C］∥中国 环境科学学会学术年会论文集． 北京 北京航空航天 大学出版社， 2009 502 －507． ［ 4］Francy D S，Darner R A． Comparison of s for determiningEscherichiacoliconcentrationsin recreational waters ［ J］ ． Water Research， 2000， 34 10 2770 －2778． ［ 5］Annie R，Pierre S，Julia B，Marie- Rene R，Patrick L． Detection and enumeration of colis in drinking water Current s and emerging approaches ［J］ ． Journal of Microbiological s， 2002， 49 1 31 － 54． ［ 6］吴清平， 周艳红， 蔡芷荷． 卫生微生物特异性显色培养 基的研究与应用［J］ ． 中国卫生检验杂志，2005，15 1 124 －126． ［ 7］Hrmana A，Hnninena M． uation of the lactose Tergitol- 7， m- EndoLES， Colilert18， Readycult Colis 100，Water- Check- 100，3M Petrifilm EC and DryCult Coli test s for detection of total colis 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indicators of fecal pollution． The traditional s， such as the multiple- tube fermentation MTF technique and membrane- filter MF technique do not meet the requirements for fast and accurate testing． Recently，Defined Substrate Technology DST was developed to replace the traditional s but it is a costly and therefore，unpopular． A new membrane filter medium，MI agar，which was developed to simultaneously detect total colis and Escherichia coli in environmental water samples has been researched and is presented here． MI agar was compared with Endo agar， which was adopted by national standards． Spiked drinking water samples and real water samples were analyzed with duplicates by using MI agar- membrane filteration and Endo agar- membrane filteration． The results show that the average recovery rates by using MI agar for total colis and Escherichia coli are 89． 2 and 88． 8 respectively，comparing favourably with the Endo agar which has lower recovery rates of 81． 0 and 81． 2． Thirty surface water samples were studied by using MI agar and Endo agar and the results show that there is no statistically significant difference between the two s． The correlation coefficients by using MI agar and Endo agar were 0． 9627 and 0． 9511 for total colis and Escherichia coli，respectively． In summary，compared with national standards，MI agar is more sensitive，simpler to manage，less time consuming， has reduced interference effects and is suitable for the simultaneous detection of total colis and Escherichia coli． Since the results of this study show MI agar to be better than the current ，it meets the criteria for routine compliance monitoring of environmental water． Key words environmental waters; total coli; Escherichia coli; MI agar ; Endo agar 257 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing