固相萃取-衍生化-气相色谱-质谱联用测定不同水体中类固醇雌激素方法研究_王园园.pdf

2017 年 9 月 September 2017 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 36，No． 5 519 －528 收稿日期 2017 －05 －31; 修回日期 2017 －06 －30; 接受日期 2017 －07 －17 基金项目 国家自然科学基金资助项目 41472237， 41471409 ; 沈阳市科学事业费竞争性选择项目; 辽宁省创新团队项目 LT2015017 作者简介 王园园， 硕士研究生， 环境科学与工程专业。E- mail wangyuanyuan5921 qq． com。 通讯作者 杨悦锁， 教授， 主要从事污染地下水和土壤的场地调查、 污染物识别等方面研究。E- mail yangyuesuo jlu． edu． cn。 王园园，宋晓明，温玉娟， 等． 固相萃取 － 衍生化 － 气相色谱 － 质谱联用测定不同水体中类固醇雌激素方法研究［J］ ． 岩矿 测试， 2017， 36 5 519 －528． WANG Yuan- yuan，SONG Xiao- ming，WEN Yu- juan，et al． Determination of Steroid Estrogens in Different Water Samples Using SPE- derivatization Coupled with GC- MS［ J］ ． Rock and Mineral Analysis， 2017， 36 5 519 －528． 【DOI 10． 15898/j． cnki． 11 －2131/td． 201705310092】 固相萃取 － 衍生化 － 气相色谱 － 质谱联用测定不同水体中 类固醇雌激素方法研究 王园园1，宋晓明1，温玉娟1，Muhammad Adeel 1，杨悦锁1， 2* ，宋伟3 1． 沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044; 2． 吉林大学地下水环境与资源教育部重点实验室，吉林 长春 130021; 3． 中国石油天然气股份有限公司吉林油田分公司新民采油厂，吉林 松原 138001 摘要 针对地下水及地表水体样品中痕量类固醇雌激素 SEs 污染问题， 本文建立了固相萃取 － 衍生化 － 气相色谱 － 质谱联用 SPE － GC － MS 同时测定不同水体中 5 种 SEs 雌酮 E1 、 17α － 雌二醇 17α － E2 、 17β － 雌二醇 17β － E2 、 17α － 乙炔基雌二醇 EE2 、 雌三醇 E3 的分析检测方法。通过优化固相萃取过 程和衍生化条件以及复杂样品的二次净化过程， 发现用 Oasis HLB 柱萃取， 用乙酸乙酯洗脱， 40℃条件衍生 化 20 min 可以达到最佳效果， 并且经甲醇活化过的 Generik NAX 柱对复杂样品的二次净化效果较好。本方 法对 E1、 17α － E2、 17β － E2 和 EE2、 E3 检测的线性范围分别为5 ～1000 ng/L 和10 ～1000 ng/L; 方法检出限 和定量限分别为 2 ～3 ng/L 和 6． 5 ～10 ng/L; 对水样的加标回收率范围为 80 ～120; 该方法测定 SEs 峰 面积的日内相对标准偏差为 6． 8 ～10。应用此方法对鱼塘水、 河水、 地下水、 污水处理厂二级出水进行 了 SEs 污染水平检测， 结果表明该检测技术可以有效应用于不同水质地表及地下水体类固醇雌激素化学风 险识别与评估。 关键词 水样; 类固醇雌激素; 气相色谱 － 质谱法; 固相萃取; 衍生化 中图分类号 O657． 63文献标识码 A 水体是各种污染物传输和扩散的环境途径， 尤 其地下水循环是对土壤包气带与含水层构成污染风 险的重要营力。地下水中污染物的含量虽然一般比 地表水低， 但是潜在健康和环境风险更高， 这给检测 带来更大的挑战。环境雌激素作为一种内分泌干扰 物 EDCs ， 能够进入动物或人体， 在生物体内富集， 并对机体内正常内分泌物质的合成、 释放、 运转、 代 谢以及结合等产生干扰， 从而破坏内分泌系统的正 常运行 ［1 －2 ］。相对于其他 EDCs， 类固醇雌激素 SEs 被认为具有更强的内分泌干扰性和生物活 性 ［3 －4 ］。在很低的浓度 1 ng/L 条件下， SEs 便能 引起人体或动物生殖障碍、 行为异常和幼体变异 等 ［5 －7 ］。目前， 研究人员从不同环境水体甚至饮用 水中均检测到 SEs［8 －10 ］。因此， 针对不同类型水体 尤其是杂质含量高、 成分复杂的地表水以及受到痕 量污染的地下水中类似于 SEs 的新型污染物的可靠 检测技术和方法是其化学风险评估和进一步修复工 程实施的重要内容， 应当尽快开发灵敏、 高效的 SEs 915 ChaoXing 测试方法， 对不同类型水体中的 SEs 污染化学风险 进行识别和评估。 环境中典型的 SEs 主要包括动物和人体内天然 存在的雌酮 E1 、 17β － 雌二醇 E2 、雌三醇 E3 和人工合成的用于口服避孕药物的 17α － 乙炔基雌 二醇 EE2 。SEs 的危害性比较大， 尤其是 17β － E2 的内分泌干扰性最强 ［11 －12 ］。这些 SEs 部分已经迁 移进入地下水中， 给人类饮用水安全造成严重威 胁 ［13 －15 ］。不同类型的水体中 SEs 种类多， 含量通常 较低， 一般为 μg/L 或 ng/L 数量级， 再加上基质效 应等其他干扰因素的存在， 即使使用灵敏度很高的 分析仪器也难以得到准确的测试结果， 因此样品分 离富集前处理技术在痕量分析中尤为重要 ［16 ］。目 前， 针对水体样品的前处理技术主要有 ①固相萃取 法 SPE ［17 －18 ］; ②液液萃取 LLE［19 ］; ③固相微萃 取 SPEA ［20 －21 ］; ④分 散 液 液 微 萃 取 DLLME ［22 －24 ］。其中， 固相萃取法应用最为广泛。 而针对水体中 SEs 的检测方法主要有 ①免疫分析 法 ［25 ］ 具有很好的稳定性和重现性， 但是由于不同 SEs 组分具有相似的结构， 免疫分析法无法对不同 类型的 SEs 进行分离， 只能检测单一 SEs 化合物含 量或所有 SEs 总量; ②IT 分子印迹技术 ［17， 26 ］ 该方 法选择性很高， 但是制备模板分子或分子印迹聚合 物不适宜非专业人士操作; ③同位素标注法 ［27 ］ 该 方法灵敏度高， 定量准确、 方法简便， 但是同位素标 记物具有放射性， 对人体健康危害较大， 标记化合物 所需原料成本较高; ④液相色谱 － 质谱法 LC － MS ［28 －29 ］ 可检测城市污水及地下水中以纳克级存 在的低浓度 SEs， 具有很高的分离性能， 但是样品前 处理时间较长， 仪器价格昂贵; ⑤气相色谱 － 质谱法 GC － MS ［30 －32 ］ 虽然该技术也需要足够量的样品 和衍生化操作， 但是灵敏度高、 检测速度快、 选择性 好， 通常被人们应用于水环境中痕量 SEs 的分析 检测。 现有关利用 SPE － 衍生化 － GC － MS 方法检测 水中类固醇雌激素的报道已有很多， 但仍存在以下 问题 ①地表水中的 SEs 污染物因浓度高而容易被 检测， 而地下水中的 SEs 新型污染物因浓度低而不 易被探测; 前人涉及相关文献研究已经表明 SEs 的 确能够由地表穿透包气带进入地下水中。但是目前 的研究仍然主要集中于对河流、 污水等地表水的检 测， 很少涉及污染物含量更低、 潜在风险更高的饮用 水等地下水样检测; ②对于某些成分比较复杂、 含有 色杂质较多的污废水以及部分地下浅水水样经 SPE 浓缩富集之后仍有不同程度的色素残留， 若直接进 行 GC － MS 检测， 对色谱柱损害较大， 可能造成色谱 柱堵塞或缩短色谱柱使用寿命， 以往研究很少针对 这种情况提及固相萃取之后的二次净化过程; ③大多数研究 ［32 －34 ］中， 衍生化过程时间较长， 所需 温度较高， 导致总体衍生化效率较低。因此， 针对以 上问题， 本研究建立的 SPE － 净化 － 衍生化 － GC － MS 法对包括地表水和地下水在内的不同类型水 体中 SEs 污染水平进行检测， 并针对固相萃取之后 仍含有色素等杂质的污水增加了二次净化过程。本 方法中衍生化时间相对较短， 所需衍生化温度相对 较低， 在一定程度上提高了衍生化效率。因此， 本项 研究就是在有效吸收前人研究成果基础上， 努力在 这几个方面有所突破， 为地下水资源保护和饮用水 安全提供检测技术支撑。 1实验部分 1． 1仪器和设备 TRACE GC Ultra － Polaris Q 型气相色谱 － 质谱 仪 ThermoFisher 公司， 美国 ， 配 AI/AS3000 型自动 进样器; DB － 5MS 色谱柱 J＆W Scientific 公司， 美 国 ; DP400D －2 型氮气吹扫仪 无锡德谱仪器制造 有限公司， 中国 ; VisiprepTM大体积采样器与 24 位 真空固相萃取装置 Supelco 公司， 美国 ; 固相萃取 小柱 Agilent 公司， 美国 Oasis HLB Waters 公司， 150mg/6cc ; 净化柱 Generik NAX Sepax 公 司， 500mg/6cc ; PB － 10 型 pH 计 赛多利斯公司， 德 国 ; SQP 型电子天平 赛多利斯公司， 德国 。 1． 2标准溶液和主要试剂 SEs 标准品 Sigma － Aldrich， 美国 E1 纯度 ≥99． 5 、 17α － E2 纯度≥99． 0 、 17β － E2 纯 度≥98． 2 、 EE2 纯度≥98． 2 和 E3 纯度 ≥98． 8 ; 衍生化试剂 MSTFA［ N － 甲基 － N － 三 甲基硅烷基 三氟乙酰胺 C6H12F3NOSi］购自美国 Sigma － Aldrich 公司。 SEs 标 准 储 备 液 准 确 称 取 E1、 17 － αE2、 17 － βE2、 EE2、 E3、 17β － E2 － d4 标准品各 10 mg 分 别溶于 10 mL 甲醇中， 配制成 1． 0 g/L 的 SEs 标准 储备液， 置于冰箱 4℃ 中冷藏保存。 SEs 混合标准储备液 分别从上述各 SEs 标准 025 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2017 年 ChaoXing 储备液中准确量取100 μL 于10 mL 容量瓶中， 用甲 醇定容， 配制成 10 mg/L 的 SEs 标准混合液， 置于冰 箱中 4℃保存。实验中根据需要稀释成所需浓度。 本实验所用有机试剂 甲醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 二 氯甲烷等均为色谱纯级， 购自德国 Merck 公司; 吡啶 科密欧公司， 中国 纯度≥99． 5; 本研究所用水 为超纯水， 由美国 Millipore 公司的 Milli － Q Direct16 超纯水机制备。 1． 3实验方法 1． 3． 1固相萃取 用 SEs 标准混合溶液与超纯水配制浓度为 200 ng/L 的溶液进行 SEs 测试方法的开发， 利用野外采 集的不同类型的水样进行测试方法的验证与基质效 应评估。取各类型水样 1 L， 过 0． 45 μm 混合纤维 素膜 MCE ， 加入内标物质 17α － E2 － d4， 使其含量 为200 ng/L。Oasis HLB 柱活化与平衡条件为 首先 用 5 mL 乙酸乙酯过柱， 然后用 5 mL 甲醇浸泡 5 min， 最后用 15 mL 超纯水过柱， 以 1 ～ 2 mL/min 流速对柱子进行活化与平衡。将 1 L 水样利用大体 积采样器以 3 ～5 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 柱 对 SEs 进行富集。水样过柱后， 用 10 mL 体积浓度 10的甲醇水溶液淋洗固相萃取柱， 以清除柱内的 杂质。将固相萃取柱真空抽干 60 min， 最后用 10 mL乙酸乙酯以1 mL/min 的流速对目标 SEs 进行 洗脱。成分复杂的样品 如 污水处理厂二级出水 洗脱液中有色杂质较多时需要进行二次净化步骤 将洗脱液利用轻柔氮气流吹干， 然后加入1 mL 甲醇 重新溶解 SEs， 并将其通过 Generik NAX 柱 预先用 5 mL 甲醇进行活化 进一步净化， 最后利用 5 mL 甲 醇洗脱。 图 1目标 SEs 的 a 全扫描和 b 选择离子扫描总离子流色谱图 Fig． 1TIC chromatograms of target steroid estrogens by a full scan and b selected ion monitoring 1． 3． 2样品衍生化 将 SEs 标准溶液和 SPE 洗脱液经轻柔氮气流 吹至近干， 转移至色谱小瓶内， 然后在氮气流中浓缩 至干， 加入 50 μL 吡啶和 100 μL MSTFA， 涡旋 30 s 后， 在 40℃条件下反应 20 min， 冷却至室温后转入 内衬管中进行 GC － MS 分析。 1． 3． 3GC － MS 分析条件 1 GC 条件 TR5 － MS 型石英毛细管色谱柱 30 m 0． 25 mm 0． 25 μm ; 载 气 纯 度 为 99． 999的氦气 流量为 1 mL/min 恒流 ; 进样方 式为不分流进样; 进样量为 1 μL; 色谱柱升温程序 初始温度 50℃， 保持 2 min; 以 12℃ /min 速率升至 260℃， 保 持 8 min; 最 后 以 3℃ /min 速 率 升 至 280℃， 保持 5 min。进样口温度为 280℃。 2 MS 条件 电子轰击离子源 EI ， 电离电压 70 eV; 离子源温度 250℃， 传输线温度 280℃; 溶剂 延迟时间 15 min; 采用全扫描模式 SCAN 和选择 离子扫描模式进行扫描 SIM ， 扫描范围为质量数 m/z 50 ～ 600， 根据 5 种 SEs 组分的标准谱图， 对每 种物质选择几个丰度较强的离子作为定性和定量 离子。 2结果讨论 2． 1色谱与质谱行为 全扫描模式可以得到衍生物特征离子和保留时 间用于定性分析， 选择离子扫描模式可以得到色谱 峰面积用于定量分析。将 5 种 SEs 组分和内标化合 物 17β － E2 － d4的单标溶液进行衍生化后， 在 m/z 50 ～600 范围内进行全扫描， 得到其对应的标准谱 图以及各目标 SEs 的保留时间， 并选择几个相对丰 125 第 5 期王园园， 等 固相萃取 － 衍生化 － 气相色谱 － 质谱联用测定不同水体中类固醇雌激素方法研究第 36 卷 ChaoXing 度较强的碎片离子作为特征离子 见表 1 。将特征 离子中丰度最大的碎片离子作为定量离子， 其他作 为定性离子。然后将 5 种 SEs 组分与 17β － E2 － d4 的混合标准溶液衍生化后进行扫描， 得到 6 种 SEs 的总离子流色谱图， 如图 1a 和 b 所示分别为全扫描 模式和选择离子扫描模式下的总离子流色谱图。从 图 1 中可以看出， 通过优化升温程序后， 5 种 SEs 组 分分离良好， 但 17β － E2 和 17β － E2 － d4的峰相互 重叠， 这也与 Nie 等 ［35 ］、 Liu 等［36 ］等的研究结果一 致。虽然二者未能实现分离， 但它们的定性离子和 定量离子均不相同， 因此仍可以对其进行准确的区 分与定量研究。 表 1目标 SEs 的保留时间及其特征离子 Table 1Retention times and characteristic ions of the target steroid estrogens 化合物 保留时间 min 定性离子 m/z 定量离子 m/z E123．24342， 218， 257342 17α － E222．81285， 326， 416285 17β － E223．40285， 326， 416285 17β － E2 － d423．40285， 129， 416285 EE225．19425， 232， 285425 E326．56311， 386311 2． 2衍生化条件的选择 衍生化时间和温度会影响衍生化的效果。本研 究采用 MSTFA 作为衍生化试剂， 分别考察不同衍生 化时间和衍生化温度对 SEs 组分的回收率影响， 每 组实验条件重复 3 次， 计算平均回收率和标准偏差 见表 2。 表 2衍生化时间和温度对目标化合物回收率的影响 Table 2The effects of derivatization time and temperature on recoveries of the target compounds 化合物 回收率 标准偏差 20℃ 40℃60℃80℃40℃60℃80℃40℃60℃80℃ 20 min40 min60 min E188．8 2．898．4 2． 9101．2 3．4 101． 3 3．1 100． 2 3．7 103．1 3．996．7 5．0105．5 3．4 105．6 6．1 108．1 4．3 17α － E290．7 2．998．2 2． 995． 8 7． 098． 2 5．099．3 3．299．2 4．593．9 8．6100 3．4102．8 3．699．1 5． 8 17β － E290．5 7．098．8 5． 098． 1 3． 498． 5 2．696．1 6．498．9 4．593．8 5．899．8 4．4103 8．2100．6 3．1 EE286．8 4．399．9 5． 299． 8 5． 496． 5 8．8101． 3 3．397 7．695．9 8．8108 4．2100．6 7．0 100．3 8．4 E388．7 6．1102． 3 2．4 103．4 4．1 109． 5 5．3 103． 4 2．8 111．8 5．386．8 8．4111．8 5．3 109．4 4．1 109．7 4．8 根据表 2 测试结果可以看出， 在室温 20℃、 不 加热条件下， 各 SEs 组分的平均回收率较低， 仅为 86． 8 ～ 90． 7。温度较高 80℃ 时， 衍生化 20 min和 60 min 回收率较高， 而衍生化 40 min 回收 率略微有所降低。推测该现象的原因可能是温度较 高 80℃ 时， 初始阶段 20 min 衍生化试剂与 SEs 快速反应生成有利于 GC － MS 分析的产物， 随 着反应时间的推移， 衍生化试剂可能与吡啶、 SEs 或 初始阶段的衍生化产物重新反应生成不利于 GC － MS 分析的副产物所致。再延长反应时间， 这种不利 于 GC － MS 分析的副产物可能在高温条件下分解还 原生成有利于 GC － MS 分析的衍生化产物。对比不 同的衍生化温度可以看出， 当温度为 40℃ 时， 衍生 化效果较好， 随着衍生化温度的升高， 5 种 SEs 的回 收率无明显提高甚至出现回收率降低的情况; 对比 不同的衍生化时间可以看出， 当时间为 20 min 时， 各目标化合物的回收率均已达到 96． 5 以上， 再增 加衍生化时间对回收率的提高贡献不大。综合考虑 5 种 SEs 组分的回收率以及衍生化效率， 发现在 40℃条件下衍生化 20 min 可达到最佳效果。因此， 本研究选择衍生化温度 40℃、 衍生化时间20 min 作 为 MSTFA 的最佳衍生化条件。 2． 3固相萃取条件的优化 2． 3． 1固相萃取条件的改进和确证 文献［ 37］ 采用 10 mL 丙酮作为洗脱溶剂， 对比 了 4 种固相萃取柱 LC － 18、 Oasis HLB、 Sep － Pak C18 和 ENVITM － 18 对 E1、 E2、 EE2 和 E3 的萃取 效果， 结果表明， Oasis HLB 对 4 种目标化合物的回 收率最高， 可以达到 82． 0 ～ 94． 9， 并具有良好 的重现性。ENVITM － 18 柱对 E2 的回收率虽然也 高于 90， 但是对 E1、 EE2 和 E3 的回收率较低。 本研究对该文献中提到的 4 种固相萃取柱对比实验 进行了重复和验证， 得到了类似的结论。因此， 选择 Oasis HLB 柱对水样进行固相萃取。 根据相似相溶原理， 不同的洗脱溶剂由于极性 225 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2017 年 ChaoXing 不同， 对 SEs 各组分洗脱效果也有所差异， 因此有必 要对不同极性的洗脱溶剂进行研究。现有文献报 道 ［32， 35， 37 －38 ］中， 主要用到的洗脱溶剂有丙酮、 乙酸 乙酯、 二氯甲烷或二氯甲烷与丙酮的混合溶液。本 研究以常用的洗脱溶剂以及极性更强的甲醇， 考察 了 Oasis HLB 柱对加标水样中目标化合物的回收 率。所用 4 种洗脱溶剂极性大小为 甲醇 ＞ 丙酮 ＞ 乙酸乙酯 ＞ 二氯甲烷， 洗脱溶剂体积均为 10 mL。 结果表明， 乙酸乙酯对 5 种目标化合物的洗脱效果 最好， 测试回收率为 100． 3 ～ 111． 5; 甲醇对 5 种 目标化合物的洗脱效果较乙酸乙酯差， 测试回收率 只有 86． 5 ～94． 4; 二氯甲烷极性较弱， 只对 E1 和 E2 的洗脱效果较好， 而 E3 的极性强于 E1 和 E2， 二氯甲烷不能将极性相对较强的 E3 充分洗脱 下来， 对 E3 的回收率几乎为 0， 并且对 EE2 的回收 率也低于 90。丙酮对 5 种目标化合物的洗脱效 果总体上也比较差， 仅对 17β － E2 和 EE2 的洗脱效 果相对较好， 回收率分别为 107． 6和 95． 3， 对其 余 3 种 SEs 的回收率均高于 120， 可能是由于甲 醇和丙酮的极性均强于乙酸乙酯， 在洗脱 SEs 各组 分的同时也把部分杂质洗脱下来， 不利于 GC － MS 分析， 这与文献［ 37］ 中所得结论有所不同。根据本 研究得到的乙酸乙酯对 SEs 的洗脱效果强于丙酮的 结论， 并且丙酮比乙酸乙酯对人体健康的危害更大， 而对比丙酮洗脱和乙酸乙酯洗脱的实验过程， 显示 出丙酮在氮气流中吹干的速度较乙酸乙酯更慢， 因 此本研究选择乙酸乙酯作为洗脱溶剂。 表 3五种类固醇雌激素的线性方程、 相关系数、 线性范围、 检出限和定量限 Table 3Linear equation，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ of five estrogens 化合物回归方程 相关系数 R2 线性范围 ng/L 检出限 S/N 3， ng/L 定量限 S/N 10， ng/L E1Y －3987．67 1312．43X0． 99845 ～100026．5 17 － α E2Y －32075．1 1541．75X0． 99825 ～100026．5 17 － β E2Y －36461．6 1694．59X0． 99815 ～100026．5 EE2Y －7596． 5 291． 442X0． 996310 ～1000310 E3Y －5898．03 425．589X0． 998610 ～1000310 2． 3． 2含有色杂质水样的二次净化 本研究发现某污水处理厂出水和一部分地下浅 水水体中含有一定量的有色杂质， 经 Oasis HLB 柱 固相萃取之后， 样品中的有色杂质仍难以去除， 若直 接进行衍生化操作及 GC － MS 检测， 对色谱柱损害 较大， 并且很可能影响测试结果的准确性。因此， 本 研究对比了 Silica cartridge、 Florisil 和 Generik NAX 三种净化柱对含有色素等杂质的污水水样的净化效 果， 并通过优化活化与洗脱过程， 最后发现用甲醇对 Generik NAX 净化柱进行预先活化， 并用甲醇作为 洗脱溶剂可以达到去除水样中有色杂质的目的。含 有色杂质的水样经过 SPE、 Generik NAX 柱净化后， 色谱图基线噪声信号与净化前相比有所降低， 并且 杂峰数量也有所减少， 回收率可达到 90 以上。具 体净化步骤为 将 Oasis HLB 柱 SPE 后的洗脱液利 用轻柔氮气流吹干， 然后加入 1 mL 甲醇重新溶解 SEs， 并将其通过预先用 5 mL 甲醇进行活化过的 Generik NAX 柱进一步净化， 最后利用 5 mL 甲醇洗 脱。洗脱液再次经轻柔氮气流吹干后， 可进行衍生 化过程。含有色杂质的水样经 Generik NAX 柱净化 前后色谱图对比见图 2。 2． 4方法线性范围、 检出限和定量限 将 SEs 标准混合液稀释配制成系列浓度梯度的 样品溶液， 经上述优化的 SPE － 衍生化 － GC － MS 分析测定后， 以信噪比 S/N 3 所对应的被测化合 物浓度作为该方法的检出限 LOD ， 以信噪比 S/N 10 所对应的被测化合物浓度作为该方法的定量 限 LOQ 。以各 SEs 组分的分子离子峰与内标物的 分子离子峰的峰面积的比值 Y 为纵坐标， 以质量浓 度 X ng/L 为横坐标进行线性回归分析， 得到 5 种 SEs 组分的线性回归方程与相关系数 表 3 。由表 3 结果可知， 各化合物峰面积与其质量浓度的线性 相关性良好， 相关系数 R2 大于 0． 995， 线性范围为 5 ～1000 ng/L E1、 E2 和 10 ～1000 ng/L E2、 E3 。 2． 5地下水加标回收测试 取位于沈阳市北部的沈北新区地下水 2 份， 加 入混合标准溶液， 使 2 份样品的加标量分别为 100 ng/L、 和 500 ng/L， 每份水样做三个平行样， 按照本 研究优化好的 SPE － GC － MS 方法进行测定， 一天 内重复测定 7 次， 测试结果减去样品本底值后， 计算 各 SEs 组分的加标回收率和日内相对标准偏差 325 第 5 期王园园， 等 固相萃取 － 衍生化 － 气相色谱 － 质谱联用测定不同水体中类固醇雌激素方法研究第 36 卷 ChaoXing 图 2含有色杂质水样经 Generik NAX 柱净化前 a 和 净化后 b 的色谱图 Fig． 2The chromatograms before purification a and after purification b using Generik NAX columns RSD 。测试结果表明， 加标浓度无论是 100 ng/L 还是 500 ng/L， 地下水样中 5 种 SEs 的回收率都在 83． 2 ～ 120． 6， 相对标准偏差范围在 6． 8 ～ 10， 基质效应较弱。因此， 本研究建立的 SPE － GC － MS 测试方法具有较好的准确度与精密度， 可 以满足相关实际水样的分析测试要求。 2．6地表水及地下水中 SEs 污染水平检测和污染 来源初步分析 利用本研究建立的 SEs 分析测试方法， 调查了沈 阳市城郊不同水体中 SEs 的分布及其浓度水平。地 下水水样包括苏家屯区八一镇地下水， 位于沈阳市北 部的沈北新区农田地下水、 居民用井水; 地表水水样 包括八一镇鱼塘水、 苏家屯和穆家桥河水以及沈北新 区某污水处理厂二级出水。由测试结果 图 3 可以 看出， 人工合成的类固醇雌激素 EE2 在除了农田地 下水水样之外的其他水样中都有检出， 且浓度范围在 51．76 ～200．35 ng/L， 远远超过 EE2 的预计无影响浓 度0．1 ng/L， 说明人工合成的雌激素EE2 对生态环境 和人体健康的潜在危险性较高。鱼塘水样中5 种SEs 都有检出， 浓度最高可达200．35 ng/L， 该浓度可能会 对鱼类生长繁殖造成一定的影响 ［ 39 －41 ］。苏家屯与穆 家桥两条河流水样中均未检出 17α － E2， 苏家屯河水 中 E1、 17β －E2、 EE2、 E3 均有检出， 浓度范围在 17．26 ～67．34 ng/L; 穆家桥河水中只检出EE2， 并且浓度较 高， 达到了 193． 37 ng/L， 其他四种 SEs 均未检出。 八一镇地下水、 农田地下水以及民用井水中也检测出 SEs， 可 能 与 畜 禽 养 殖 以 及 粪 肥 使 用 有 很 大 关 系 ［ 42 －43 ］。除了农田地下水外， 其余地下水中的 EE2 含量较高， 可能是由于农田中人口密度小， 人工合成 的 EE2 使用量较少， 而一般乡镇居民区人口密度大， 使用人工合成的 SEs 药物较多， 因此地下水受到 EE2 的污染严重。污水处理厂的污水经过处理后， 大部分 SEs 可以被微生物降解， 但是很难被降解完全。在污 水处理厂的二级出水中， 17α － E2、 E1、 17β －E2、 EE2、 E3 均被检出， 平均浓度为 50． 9 ng/L， 此分析结果对 于污水处理工艺的选择以及针对典型 SEs 污染水体 优化处理方式提供了依据。 图 3不同水体中 SEs 浓度分布柱状图 Fig． 3Histograms for estrogen concentration in different water samples 425 第 5 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2017 年 ChaoXing 3结论 针对水体尤其是地下水中的新型污染物的低浓 度和高毒性特点， 本研究开发了利用 SPE － 净化 － 衍生化 － GC － MS 测试方法对不同类型水体中痕 量 SEs 进行有效检测， 进而在进一步污染化学风险 识别及评估方面具有很好的应用前景。实验室检测 研究证实， 通过优化固相萃取柱的类型、 衍生化时间 和温度， 并增加优化了针对成分复杂有色杂质含量 高的污水二次净化过程， 另外用乙酸乙酯代替常用 的丙酮作为洗脱溶剂， 可以大大缩短氮气吹干的时 间， 提高固相萃取效率， 降低有机溶剂对实验人员的 健康危害; 优化后的衍生化时间较短， 所需温度较 低， 大大提高了衍生化效率。该方法的检出限、 定量 限、 准确度和精密度等参数均能够满足不同类型实 际水样的测试要求， 可以为水体中痕量 ng/L 级 类 固醇雌激素的检测提供可靠的数据。 通过野外场地不同水体样品检测结果表明， SEs 已经对各类水体造成了比较严重的污染， 尤其是地 下水中 SEs 的检出对人类饮用水安全产生了威胁， 应针对此类新型污染物的修复治理以及预防等方面 进行深入研究。 4参考文献 ［ 1］Chowdhury R R， Charpentier P A， Ray M B． Photode- gradation of 17β- estradiol in aquatic solution under solar irradiation Kinetics and infiuencing water parameters ［J］ ． Journal of Photochemistry and Photobiology A Chemistry， 2011， 219 67 －75． ［ 2］Chambers K B， Casey F X， Hakk H，et al． Potential bioactivity and association of 17β- estradiol with the dissolved and colloidal fractions of manure and soil［ J］ ． Science of the Total Environment， 2014， 494 － 495 58 －64． ［ 3］Zheng W， Zou Y， Li X， et al． Fate of estrogen conjugate 17α- estradiol- 3- sulfate in dairy wastewater Comparison of aerobic and anaerobic degradation and metabolite ation［J］ ． Journal of Hazardous Materials， 2013， 258 －259 109 －115． ［ 4］Liu Z H， Lu G N， Yin H， et al． Removal of natural estro- gens andtheirconjugatesinmunicipalwastewater treatment plants A critical review［J］ ． Environment Science ＆ Technology， 2015， 49 5288 －5300． ［ 5］都韶婷， 金崇伟， 刘越． 水体 SEs 污染现状研究进展 ［ J］ ． 环境科学， 2013， 34 9 3358 －3365． Du S T， Jin C W， Liu Y． A review on current situations ofsteroidestrogeninthewatersystem ［J］ ． Environmental Science， 2013， 34 9 3358 －3365． ［ 6］Sun W L， Zhou K． Adsorption of 17β- estradiol by multi- walled carbon nanotubes in natural waters with or without aquatic colloids ［J］ ． Chemical Engineering Journal， 2014， 258 185 －193． ［ 7］D’ Alessio M， Vasudevan D， Lichwa J， et al． Fate and transport of selected estrogen compounds in Hawaii soils Effect of soil type and macropores［J］ ． Journal of Contaminant Hydrology， 2014， 166 1 －10． ［ 8］Combalbert S， Hernandez- raquet G． Occurrence， fate and biodegradation of estrogens in sewage and manure ［J］ ． Applied Microbiology and Biotechnology， 2010， 86 6 1671 －1692． ［ 9］Jiang J Q， Yin Q， Zhou J L， et al． Occurrence and treatmenttrialsofendocrinedisruptingch