石油污染物的微生物降解研究.pdf

第 4 O卷第 1 期 2 0 1 1年 1 月 应用化工 Ap p l i e d Ch e mi c a l I n du s t r y Vo 1 ． 40 No ． 1 J a n ． 2 0 1 1 石 油 污染 物 的微 生物 降解 研 究 陈涛， 李春荣 长安大学 国土资源部干 旱半干旱地区水资源与国土环境开放实验室 ， 陕西 西安7 1 0 0 5 4 摘要 从炼油厂污水池底 泥中分离 出 3株石油降解菌。经过摇床培养研究 了各菌株及混合 菌对石 油烃 的降解性 能 ， 并考察 了营养物质 、 电子受体对石油污染生物降解作用的影 响。结果表 明 ， 2 5 d后 ， 3种单菌对石油烃的降解率 依次达到 8 7 ． 6 9 ％ ， 5 2 ． 1 4 ％ ， 9 2 ． 0 2 ％ ， 混合 菌高达 9 3 ． 1 8 ％； 营养物质 、 电子受体对石 油污染物生 物降解影 响显 著， 营养物质 N与 P适宜 比为 2 1 质量 比 ， 电子受体 H 2 O 适宜累计添加量为 1 2 0 O 0 m s ／ k g 。 关键词 石油污染物 ； 嗜油菌 ； 筛选 ； 微生物降解 中图分类号 x 5 3 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1 3 2 0 6 2 0 1 1 O 1 0 0 3 4一o 4 S t u d y o n b i 0 d e g r a d a t i 0 n o f p e t r o l e u m p o l l u t a n t s C HEN T a o， L I Ch u n r o n g C h a n g ’ a n U n i v e r s i t y ， K e y L a b o r a t o r y f o r t h e Wa t e r R e s o u r c e s a n d L a n d E n v i r o n m e n t i n t h e A r i d and S e m i A r i d A r e a s ， M i n i s t ry o f L a n d a n d R e s o u r c e s ， X i ’ a n 7 1 0 0 5 4 ， C h i n a Ab s t r a c t T h e t h r e e k i n d s o f o i l d e g r a d i n g b a c t e ria we r e s e p a r a t e d f r o m the b o t t o m mu d o f s e wa g e r e s e r - v o i r i n t h e r e fi ne r y． Th e p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n s d e g r a d a t i o n p e r f o r ma nc e o f s e v e r a l b a c t e ria a n d the mi x e d b a c t e ria a f t e r s h a k i n g c u l t u r e a n d the e f f e c t s o f n ut r i e n t s a n d e l e c t r o n a c c e p t o r o n t h e b i o d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m p o l l u t a n t s we r e s t ud i e d． T he r e s u l t s s h o we d t ha t the o i 1 d e g r a d a t i o n r a t e o f the t } I r e e s i n g l e b a c t e r i a r e a c h e d 8 7． 6 9％ ， 5 2． 1 4％ ， 9 2． 0 2％ r e s p e c t i v e l y a f t e r 2 5 da y s ， the mi x e d b a c t e ria wa s u p t 0 9 3 ． 1 8 ％ ； n u t r i e n t s ， e l e c t r o n a c c e p t o r h a d s i g n i fi c a n t e f f e c t s o n the b i o d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m p o i l u t a n t s ． The s u i t a b l e r a t i o o f N t o P n u t ri e n t s w a s 2 1 ， a n d t h e s u i t a b l e c u mu l a t i v e a d d i n g q u anti t y o f H 2 0 2 e l e c t r o n a c c e p t o r w a s 1 2 0 0 0 m g ／ k g ． Ke y wo r d s p e t r o l e u m p o l l u t a n t s；o i l d e g r a d i n g b a c t e r i a；s e l e c t i o n；bi o d e g r a d a t i o n 在石油及石油产品的开发利用 中， 不可避免的 会对人类生存环境造成污染 ， 防范 、 治理石油污染成 为环境保护的重要任务之一 。目前用于土壤石油污 染治理的方法主要有 物理修复法 ， 化学修复法和生 物修复法。与传统的物理化学方法比较， 生物修复 法具有经济花费少 、 对环境影响小 、 遗 留问题少 、 最 大限度地降低污染物的浓度 、 修复时间较短、 就地修 复、 操作方便等特点 J ， 是 国内外科研工作者关注 的热点领域 ， 在石油污染土壤的治理中具有广阔 的应用前景。 有关影响微生物对石油污染物降解的因素研究 已有较多报道 引， 在此基础上人们提出了一系列强 化石油污染物生物降解的措施和方法， 主要有 ①投 加表面活性剂 ； ②投加高效降解石油的微生物； ③投 加氮、 磷等营养源 ； ④添加电子受体 H 0 。 ． 1 o j 。 本文从石油污染底泥中富集、 驯化、 分离出 3种 降解菌 ， 研究了各菌株的主要菌落形态特征和生理 生化性质及单菌和混合菌对石油烃的降解性能， 考 察了营养物质 、 电子受体对石油污染物微生物降解 的强化作用 ， 为石油污染物微生物修复提供技术支 持。 1 实验部分 1 ． 1 原料与仪器 石油污染底泥 ， 采 自延安炼油厂； 原油 初馏点 8 3 ． 5℃， 密度为 0 ． 8 5 2 0 ． 8 9 3 k g ／ L 。 A L 2 0 4 ． I C电子天平； 7 5 2型紫外分光光度仪； T O C - V C P H总有机碳测定仪。 1 ． 2 标 准油配 制 称取一定量实验用原油 ， 用石油醚 3 0 6 O℃ 溶解 ， 经无水硫酸钠干燥 ， 过滤 ， 滤液于 6 55 ℃ 收稿日期 2 0 1 0 ． 1 1 ． 1 2 修改稿日期 2 0 1 0 ． 1 1 ． 2 9 基金项目 中央高效基本科研业务费专项基金 C H D 2 0 1 0 J C 0 6 4 和长安大学基础研究支持计划专项基金， 国土资源部干 旱半干旱地区水资源与国土环境重点实验室开放基金 作者简介 陈涛 1 9 8 6一 ， 男 ， 陕西甘泉人 ， 长安大学硕士研究生 ， 师从李春荣 副教授 ， 从事环境应 用化 学研究 。电话 0 2 9 8 2 3 39 0 5 2， Ema i l c h e n t a o 8 61 1 1 26． e o m 第 1期 陈涛等 石油污染物的微生物降解研究 3 5 水浴上蒸去石油醚 ， 再于6 5～ 7 O c c恒温箱中烘 2 h ， 置 干燥器 中密封备 用 。 1 ． 3培养基 1 ． 3 ． 1 细菌培养基牛肉膏一 蛋 白胨培养基成分如 下 牛肉膏 3 ． 0 g ， 蛋 白胨 1 0 ． 0 g ， 氯化钠 5 ． 0 g ， 琼脂 1 5～ 2 0 g ， 蒸馏水 1 0 0 0 mL ， 用 N a O H调节 p H值至 7． 0。 1 ． 3 ． 2 无机 盐培 养基 成分 如下 N H 4 2 S O 0． 5 g， Ca C1 2 0．1 g， Na H2 PO4 1． 0 g， Na NO3 0．5 g， M g S O 4 7 H 2 0 0 ． 2 g ， K 2 H P O 4 1 ． 0 g ， 蒸馏水l 0 0 0 m L ， 用 N a O H调节 p H值至 7 ． 0 。 1 ． 3 ． 3 含 油无机 盐培养基在无机盐培养基中分 别加入 3 0 0 0 ， 5 0 0 0 ， 1 0 0 0 0 m L原油 。 1 ． 4实验方 法 1 ． 4 ． 1 嗜油茵的富集、 驯化及分 离 取经过破碎处 理的底泥 菌悬液上 层液 1 m L， 接种 到 1 0 0 m L含 原油 3 0 0 0 m g ／ L 的 含 油 无 机 盐 培 养 基 中， 于 2 91 ℃， 1 5 0 r ／ mi n摇 床 培 养 ， 待 含 油 培 养 基 明显浑 浊 时 ， 取 该 培 养 液 l m L接 种 于 含 原 油 5 0 0 0 mg ／ L的含油无机盐培养基中， 继续培养至培 养液浑浊。同样方法可以得到含原油 1 0 0 0 0 m g ／ L 的含油无机盐培养基驯化液 。 取 1 m L上述菌悬液 ， 用无菌水稀释后， 分别接 种于牛肉膏一 蛋 白胨培养 基， 2 91 ℃恒 温培养 3 d 。待平板菌落有效分离后 ， 根据各菌落颜色、 形 态等特征的不同， 分别用接种针挑取单菌落进行平 板划线纯化分离。将各单菌种接种于斜面， 4℃冰 箱冷藏。 1 ． 4 ． 2嗜 油茵 降解 性 能 的研 究选 取 分 离得 到 的 3种菌 X 6 ， X 4， X 9 ， 在 3 O℃ 、 1 5 0 r ／ m i n的条件下进 行扩大培养。分别取扩大培养的菌悬液 4 m L接种 到 1 0 0 m L含原油 1 0 0 0 0 mg ／ L的含油无机盐培养 基 中， 2 91 o C、 1 5 0 r ／ m i n摇床培养。不同时期 取样 ， 用紫外分光光度法测定培养液 中石油烃的浓 度[ p 烃 ／ m g L I 1 ， A 2 5 6 a m， 1 a m石英比色 皿 ， 石油醚为参 比液] ， 根据初始石油烃浓度计算除 油 率 。 1 ． 4 ． 3 石油污染物微 生物 降解的优化条件研究 以分离得到的 3种嗜油菌为供试菌 菌悬液浓度为 l O ～1 0 c f u ／ m L ， 于含原油 1 0 0 0 0 m g ／ L的含油 无机盐 培 养 基 中， 添 加 不 同质 量 的 N H S O 、 K H 2 P O 和 H2 0 2 溶液 ， 于 2 91 o c、 1 2 0 r ／ m i n摇 床培养 ， 考察营养物配 比、 电子受体对石油污染物生 物降解 的影响 ， 实验条件设计见表 1 。 表 1 实验条件设 计 Ta bl e 1 De s i g n o f e x pe r i m e nt a l c o ndi t i o n s 2 结果与讨论 2 ． 1 嗜油菌的分离及其主要性质 通过摇床培养和平板划线纯化分离得到 3株嗜 油菌， 其主要菌落形态特征和生理生化性质见表 2 。 表 2 嗜油菌的主要菌落形态特征和生化性质 Ta b l e 2 M a i n mo r p h o l o g i c a l 。 p h y s i o l o g i c al a n d b i o c h e mi c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f o i l - d e g r a d i n g b a c t e r i a 注 “” 表示实验结果呈阳性 ， “一” 表示实验结果呈阴性。 应用化工 第 4 o卷 2 ． 2嗜 油菌对 石油烃 的降解性 能 不同时期各菌种及混合菌培养液中石油烃的降 解率测定结果见图 1 。 时 I司， d 图 1 各菌株降解率 F i g ． 1 De g r a d a t i o n r a t e o f p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n s 由图 1可知， 在 2 91 c C、 摇床培养条件下， 3 株菌对石油烃均有降解能力， 但差异较大。x 9菌 对石油烃具有很强的降解能力， 在第 5 d降解率达 到5 3 ． 8 ％ ， 第 2 5 d降解率为 9 2 ． 0 ％； X 6菌对石油烃 具有较强的降解能力， 第 5 d和第 2 5 d降解率分别 达到 2 7 ． 7 ％和 8 7 ． 7 ％ ； X 4菌降解速度较慢， 第 2 5 d 和 X 6菌， 但显著高于 X 4菌， 随后降解速度加快， 至 第 1 0 d混合菌的降解速度超过了 x 4 、 x 6单菌株 ， 第2 5 d达到 9 3 ． 2 ％ ， 超过 了 x 9 。这可能是因为单 一 菌株培养时 ， 只能代谢一定范围内不同种类的烃； 将具有不同酶活力的菌株进行混合培养， 有利于提 高对石油污染物 的复杂体系的降解效果； x 9菌第 1 5 d后降解速度减慢 ， 其原因可能是实验初期到中 期 ， 易降解的石油组分已被快速降解 ， 剩余的一些较 难降解的有机物微生物利用率低 ， 故后期呈现相对 稳定的平缓期⋯ 。 2 ． 3 微 生物 降解 优化 条件 2 ． 3 ．1 营 养 物 配 比 对 降 解性 能 的 影 响 以 N H S O 和 K H 2 P O 为 N源和 P源， 调节不 同 N 与P配比后， 接种， 于 2 9 1 oc、 1 2 0 r ／ m i n 摇床培 养2 5 d 。测定培养液萃取液中石油烃 的质量浓度 ， 根据培养基中石油烃的初始质量浓度计算降解率。 每个样品设 3个重复组。 不同营养物配比下石油烃 降解率及实验数据 t 其降解率仅 5 2 ． 1 ％。混合菌在第 5 d的率低于 X 9 检验 样本数 ， n n 2 3 结果见表 3 。 表 3 不 同营养物配比对降解性能的影响 T a b l e 3 Effe c t o f d i f f e r e n t n u t r i e n t s r a t i o s o n d e g r a d a t i o n p e r f o m a n e e 注 l 司一列数据中相l 司字母表不数值间在 0 【 0 ． 0 5水平上无显著差异 ， 不 f司字母 表示在 d0 ． 0 5水平上有显著差异。下表相 同。 由表 3可知 ， 在 P源一定的条件下 ， 随着 C N C N P 6 0 3 1 。 由 5 0 1 调整为 2 0 1时， 3种菌 的除油率均有显著 2 ． 3 ． 2添加电子 受体对降解性能的影响于含原 提高； 继续添加 N源至 C N为 1 0 1时， 各菌的降解 油1 0 0 0 0 m g ／ L的液体 培养基 中， 添加不 同质量 的 率有所增加， 但无显著变化。当 C N比为 2 0 1 时 ，H 0 溶液后 ， 接种 ， 2 91 ℃下培养 1 5 d 。测得 x 6 、 X 4 、 x 9降解率随 P源营养物的补充而提高 ； 当 未接种对照组和不同 H 0 溶液添加量实验组石油 N P比减小到 3 1 时 ， 再添加 P源营养物至 N P为 烃的降解率及实验数据 t 检验 样本数 n ， n 3 2 1 ， 降解 率有所 提 高 ， 但 与 前 者无 显 著 差 异 。3种 结果见 表 4 。 微生物在降解石油烃过程 中的最佳营养物配 比为 旃 矮灶 第 1 期 陈涛等 石油 污染 物的微生物降解研究 3 7 由表 4可知， 未接种对 照组降解率 随 H O 添 加量 的增加而增大， 3种菌培养液中的生物降解 率 随电子受体 H O 的添加 出现先 明显提高后显著 降低的变化趋势。当累计添加量达到 1 2 0 0 0 mg ／ L 时 ， 3种菌的生物 降解率 降解率与对照值之差值 最高 ， 分别为 3 6 ． 6 7％ ， 2 3 ． 7 l％ 和 6 0 ． 7 2％ ， 较对 照依次提高了 7 6 ． 8 9％ ， 1 4 ． 3 8％和 1 9 2 ． 9 0 ％。继 续增加电子受体添加量达到 1 5 0 0 0 mL时， 3种菌 培养液中的生物降解率较 1 2 0 0 0 mg ／ L添加量依次 降低 2 0 ． 6 7 ％ ， 2 0 ． 7 5％和 1 9 ． 8 8％。表明在石油污 染物微生物降解过程 中， 添加适量 H O 对降解有 明显的强化作用。因为 H O 既可作为微生物氧化 有机质的电子受体 ， 又可以直接氧化一 部分有机污 染物， 但过多的 H O 会对微 生物产生毒 性。添加 电子受体 H 0 适宜累计添加量为1 2 0 0 0 m g ／ L 或 1 2 0 0 0 mg ／ k g。 3 结论 1 分离筛选 出 3 株石油降解菌 X 4 ， X 6 ， X 9 ， 摇 床培养 2 5 d对石油烃 的降解率依次达到 5 2 ． 1 4 ％ ， 8 7 ． 6 9 ％ ， 9 2 ． 0 2 ％。经初步鉴定 ， 3株菌分别为不动 细菌 属 A c i n e t o b a c t e r s p ． 、 芽 孢 杆 菌 属 B a c i l l u s ． 、 节细菌属 A r t h r o b a c t e r s p ． 。 2 3株菌混合培养 ， 降解效率显著提高 ， 摇床 培养 2 5 d对石油烃的降解率达到 9 3 ． 2 ％ ， 均超过各 单菌的降解率 。 3 营养物质、 电子受体对石 油污染 物生物降 解影响显著。营养物质 N与 P比为 2 1 、 电子受体 H O 累计添加量为 1 2 0 0 0 m g ／ L时 ， 3株菌利 用 石油 污染物 的能力最 强 。 参考 文献 [ 1 ] 刘其友， 赵东风， 张云波． 石油污染土壤生物修复技术 的研究 进展 [ J ] ． 油气 田环境保护 ， 2 0 0 5 ， 1 5 4 1 4 1 6 ． [ 2 ] 李 春荣 ， 王文科 ， 曹玉清． 石 油污染土壤 的生物修复研 究[ J ] ． 农业环境科学学报， 2 0 0 9 ， 2 8 2 2 3 4 - 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