石油污染土壤的生物降解实验.pdf

第 3 3 卷第 1 0 期 2 0 1 4 ． 1 0 试验 研究 石油污染土壤的生物降解实验 李亚龙 杨琦 王士东 李博 张帆 中国地质大学 北京水资源与环境学院北京水资源与环境工程重点实验室 摘要 筛选石油污染土壤 中的专一性降解萘菌株 Rh o d o c o c c u 与菲菌株 No c a r d i o i d e ，研 究分 离菌株对不同浓度 下萘、菲的降解，并运 用抑制动力学相关模型 H a l d a n e 模型 进行模拟 。菌 株 Rh o d o c o c c u s 降解萘时萘的最佳初始浓度为0 ． 4 3 mg ／ L ，降解效率为9 6 ％，其 菌株对低浓度萘的 降解效果较为明显；菌株 N o c a r d io i d e s 降解菲时菲的最佳初始浓度为0 ．2 3 m g ／ L ，降解效率约为 4 3 ％，其菌株对菲的降解效果不是很明显，浓度梯度对其降解效率影响不大。对菌株R h o d o c o c C U S 降解萘过程进行 Mo n o d 方程模拟相 关系数达 0 ． 9 5 2 ，相关性 良好 ；对菌株 No c a r d i o i d e s 降解菲 过程进行 Mo n o d 方程模拟相关 系数为0 ． 8 8 9 ，符合 Mo n o d 方程 。 关键词土壤 ；抑制动力学 ；萘 、菲 ；降解 ；浓度 d o i l O ． 3 9 6 9 ／ j ． i s s n ． 1 0 0 6 - 6 8 9 6 ． 2 0 1 4 ． 1 0 ． 0 1 3 1 实验与方法 筛选石油污染土壤 中的专一性降解萘菌株 R h o d o c o c c u 与菲菌株 N o c a r d i o i d e ，研究分离菌株对 不同浓度下萘 、菲的降解 ，并运用抑制动力学相关 模型 Ha l d a n e 模 型进行模拟。 1 ． 1 萘、菲测定方法 以高效液相色谱定量测定萘、菲浓度，色谱柱 为C 一1 8 反相色谱柱，紫外检测波长2 5 4 n m，流动 相为甲醇 水 9 0 1 0 ，以1 ．0 m L ／ m in的流速等度 淋洗 。 1 ． 2 降解实验 向无菌的5 5 0 m L 血清瓶中加入少量萘一丙酮 或菲一丙酮储备液，待丙酮挥发掉后向其中加入无 菌无机盐 ，调节 p H值 。迅速封住瓶 口，将血清瓶 放人 1 5 0 r ／ m in 的摇床中，振荡一段时间，以使反 应瓶 内温度达到预定值 ，并使萘 、菲充分溶解 。取 出血清瓶 ，分别加入菌株 R h o d o c o c c u s 和菌株 No c a r d i o i d e s 菌悬 液 5 mL ，使溶 液总体 积 为 5 5 0 mL 。 迅 速封住瓶 口，开始计 时 ，并 将反应 瓶放 回 3 0。 C、1 5 0 r ／ m i n的摇床 中，取样时间分别为0 、 0 ． 5 、2 、4 、8 、1 2 和 2 4 h 。样 品经 0 ． 4 5 i x m聚 四氟 乙烯滤膜过滤后分析。 2 结果与讨论 2 ． 1 菌种特征和鉴定 基上各菌落的大小、颜色、透明度等形态，对菌株 进行编号并记录其菌落特征，结果见表 l 。 表 1 菌落特征 菌 种 曩 誊 誓 ll _ 蓦 薯 特 征 R h o d o c o c c u s 小，约为0 ．5 m m；不透明；白色；圆形；湿润；边缘整齐 N o c a r d io i d e s 小，小于0 ．5 m m；不透明；白色；圆形；较湿润；边缘整齐 分别对菌株进行革兰氏染色 ，结果显示菌株均 为革兰氏阳性菌。 2 ． 2 菌对萘 、菲的降解 1 实验 p H值及温度的选 定。初始萘浓度为 2 4 mg ／ L，初始菲浓度为 0 ． 6 mg ／ L，菌悬液接种量为 1 ％ 5 m L ／ 5 5 0 mL 时 ，研 究 了不 同初始 p H值和 不同温度状况下降解菌对萘、菲的影响， 不同初始 p H值和温度条件下萘、菲降解菌的降解曲线见图 1 、图2 。萘 、菲降解菌在p H值为4 1 0 范围内均可 降解 目 标底物，但降解效果随p H值的升高先增加 趔 进 控 蒜 鞭 两种菌株3 O 。 C 恒温培养8 d 后，观察固体培养 图1 菌株在不同p H 值下 对萘、菲的降 解 基金论文重点防控重金属汞 、铬 、铅 、镉 、砷便携／ 车载／ 在线 监测仪 器开发与应用示范 2 0 1 2 Y Q 0 6 0 1 1 5 ；中央高校基本科研业务费专 项资金 2 6 5 2 0 1 3 1 0 1 、2 6 5 2 0 1 3 0 8 6 、2 6 5 2 0 1 3 0 8 7 资助。 { 油 气 田 地 面 工 程 h t t p ／ ／ r．y q t d m g c ． c 。 m 一 2 3 第3 3 卷第 l 0 期 2 0 1 4 ． 1 0 试验研究 捌 丑 爱 j 是 弧 爱 簸 霜 T ／ ℃ 图2 菌株在不同温度下对萘、菲的降解 后降低 ，萘 、菲降解菌在 p H值分别为8 和 7 时达到 最大降解率。温度的变化对萘、菲降解菌降解萘的 影 响较大 ，反应 2 4 h 后 ，1 5。 C时的萘 、菲去除率 仅 为 2 9 ． 3 ％和 2 3 ． O ％，而 3 0。 C时萘 、菲去除率则高 达8 6 ． 6 ％和9 8 ．4 ％，在3 0 。 C 时降解效果最佳。综上 所述，确定后续的实验温度为3 0。 C，萘 、菲降解 菌p H值分别为 8 和7 。 2 初始浓度对于萘降解菌的影响。从菌株 R h o d o c o c c u s 在不同萘初始浓度下对萘的降解曲线 可以看 出，当初始浓度为 0 ． 4 3 mg ／ L时 ，菌株 R h o - d o c o c c u s 对萘的降解效果最为理想，在2 4 h 内降解 率为 9 6 ％。这说 明菌株 R h o d o c o c c u s 对低浓度萘 的 降解效率较高 。实验 中，除了在萘初始浓度为 2 7 ． 1 0 mg ／ L时 2 4 h 降解率较差 3 0 ％ ，其他几个浓 度梯度均达到4 0 ％以上。存在高初始浓度萘降解效 率低的实验现象，可能是在高浓度下萘与菌体内的 酶底物复合物结合生成不具有催化反应活性并且不 能进一步分解 的三元复合物 ，从而降低 了降解效 率。1 2 h 后降解效果 明显 ，可能是细菌的生长进入 了对数期 ，细菌浓度增大从而使降解效率有了明显 的提高。 3 初始浓度 对于菲降解菌 的影响 。由菌株 N o c a r d io i d e s 在不同菲初始浓度下对菲的降解曲线 可看 出 ，在 2 4 h内菌株 N o c a r d i o i d e s 对菲的降解效 率不是很高 ，在初始浓度为 0 ． 2 3 m g ／ L时处理效果 最好 ，降解率为4 3 ％。在初始浓度为0 ．7 9 m g ／ L 时 效果最差 ，2 4 h降解率为2 6 ％，考虑高浓度的菲对 该菌株产生抑制 。在对菲的降解过程 中，降解随时 问波动较大 ，但 各初始浓度下反应在 0 ． 5 h处降解 效率较高，0 ．5 h 后降解波动较大 。 2 ． 3 H a I d a n e 方程模拟 采用 Mo n o d 模型进行模拟 ，以L i n e w e a v e r B u r k 双倒数做图进行线性回归分析，得出最大降解速率 ⋯和饱和常数 K 值 。 两株菌株的M o n d e 方程相关系数分别为O ． 9 5 2 和 0 ． 8 8 9 ，符合 Mo n d e 方 程 。 以Ha l e d a n方程 得 出 萘、菲降解菌方程常数分别为 0 ． 0 1 6 m in ～ ， 5 ． 5 4 mg ／ L ， K 8 9 ． 2 7 m g ／ L ； ⋯ 0 ． 0 0 5 4 m i n ～， K 0 ． 2 6 m g ／ L，K 2 ． 0 1 mg ／ L 。萘降解菌株 R h o d o - C O C C U S 和菲降解 菌株 N o c a r d i o i d e s 的 H a l e d a n e 方 程 分别为 mi n ． 5 ． 5 4 ． 一⋯ 一 ’ 可 0 ． ．0 0 5 。 4m i n - ] 0 2 6 S 1 1 ． I 一 半饱和常数反映的是微生物对污染物的亲和系 数。萘的半饱和常数 5 ． 5 4 m g ／ L 要大于菲的半饱 和常数 0 ． 2 6 mg ／ L ，可见菌株 R h o d o c o c c u s 对萘 的 亲和力要 大于菌株 N o c a r d i o i d e s 对 菲的亲和力 ，这 也与本 实验结 果相 符 。本 实验 中萘 的抑 制 常数 8 9 ． 2 7 m g ／ L 要远远大于菲的抑制常数 2 ． 0 1 mg ／ L ， 这说明萘对 菌株 R h o d o c o c c u s 的抑制作用要远远小 于菲对菌株 N o c a r d i o i d e s 的抑制作用。 3 结论 1 在本实验研究浓度 范 同内，菌株 R h o d o - C O C C U S 降解萘时萘的最佳初始浓度为 O ． 4 3 m g ／ L ，此 时降解效率为 9 6 ％，且菌株对低浓度萘的降解效果 较为 明显 ；菌株 N o c a r d i o i d e s 降解菲时菲的最佳初 始浓度为0 ．2 3 m g ／ L ，此时降解效率约为 4 3 ％，菌 株对菲的降解效果不是很明显，浓度梯度对其降解 效率影响不大。 2 对 菌 株 R h o d o c o c c u s降 解 萘 过 程 进 行 Mo n o d 方 程模 拟相关 系数 达 0 ． 9 5 2 ，相关 性 良好 ； 对 菌株 N o c a r d i o i d e s 降解菲过程进行 Mo n o d 方程模 拟相关系数为 0 ． 8 8 9 ，符合 Mo n o d 方程。 参考文献 ⋯ 郭 阴 ，邓 国志 ，张小 凡 ，等 ．壬 基酚 降解菌株 的降解 特性 [ J J ． 净水技术 ，2 0 1 1 ，3 0 3 2 7 ． [ 2 ] 毛莉．唐玉斌，陈芳艳，等．难降解有机物污染水体微生物修 复研究进展『 j ] _净水技术 ，2 0 0 7 ，2 6 1 3 6 [3 ] 张丹 ，李兆格 ，包 新光 ，等 ．细 菌降解 茶 、非 的代 酬途径 及相 关 基 因的研 究进 展 [ J 】 _ 生物 J 程 学 报 ，2 0 1 0 ，2 6 6 7 2 6 7 3 4 ． [ 4 1 白智勇，李博，杨琦，两株菌对萘的降解特性对It [ J 1 ．油气田 地面 1 二 程 ，2 0 1 3 ．3 2 3 4 8 4 9 ． 栏 目主持杨军 一 2 4一 油气田绣蕾工程 h t t p ／ ／ WWW． y q t d mg c ． c o rn