氨浸膨爆预处理玉米芯的酶解.pdf

第6 0 卷第4 期 2008 年11 月 有色金属 N O n f e l T O I ．I SM e t s i s V 0 1 ．6 0 ，N o ．4 N o v e m b e r2 008 氨浸膨爆预处理玉米芯的酶解 孙大为，熊代余 北京矿冶研究总院，北京，1 0 0 0 4 4 摘要采用扫描电镜定性观测预处理效果，采用正交实验方法确定最佳酶解工艺条件，研究氨浸膨爆玉米芯试样的酶水解 行为。结果表明，氨浸膨爆预处理方法，能够改善玉米芯试样的膨化裂解预处理效果，有利于后续酶水解，最佳工艺条件为p H 4 ．8 ，温度4 5 ℃，时间4 8 h ，底物浓度7 5 9 L ～。酶用量6 0 I U g 一1 0 玉米芯试样经过酶解可得还原糖0 ．5 9 ／g 以上。 关键词化学工程；纤维素；预处理；酶解；炸药膨爆 中图分类号T O _ 3 5 2 ．6 2 ；T Q 3 1 4 ．1文献标识码A文章编号1 0 0 1 0 2 1 1 2 0 0 8 0 4 0 0 9 5 0 5 利用天然木质纤维素生产燃料乙醇，已成为可 再生生物质能开发利用的一个重要方向。天然木质 纤维素是地球上最丰富的可再生资源，利用纤维素 酶可以将纤维素水解为葡萄糖单糖，再经进一步发 酵即可制取乙醇。这一技术对我国生物质能开发利 用意义重大。 天然木质纤维素开发利用一般包括三大技术步 骤，即原料预处理、水解和发酵制取乙醇。原料预处 理的主要目的是提高纤维素对酶催化剂可及性、反 应活性，从而提高酶解效率。 目前，纤维素原料预处理方法可大致分为物理 法、化学法、生物法L l q J 。兼具物理和化学作用的 蒸汽爆破法是现行比较有效的预处理方法【3 叫J 。 炸药膨爆预处理技术是在分析、研究蒸汽爆破法作 用机理基础上，结合炸药爆炸产生冲击波的特点，利 用爆轰冲击波作用实现纤维素原料膨化裂解的预处 理方法[ 5 6 1 。 以玉米芯作为研究对象，利用经改进的炸药膨 爆技术一 氨浸 炸药膨爆技术进行预处理，对处理 后物料进行酶水解研究，为炸药膨爆预处理技术进 一步开发应用奠定理论及技术基础。 1实验方法 1 ．1 试验材料 玉米芯采自东北辽宁地区，收集后风干备用。 T r i c h o d e r m aV i r i d e 纤维素酶，酶活约1 0 0 0 0 u ／g ， F P A 约为4 0 0 I U ／g 。所用化学药剂均为分析纯。 收稿日期2 0 0 8 0 l 1 0 作者简介孙大为 1 9 8 2 一 ，男，辽宁北宁市人，硕士，主要从事炸 药及新能源开发利用等方面的研究。 1 ．2 试验用仪器 所用仪器设备主要有膨爆釜，容积0 ．2 m 3 ，设 计压力7 0 k g ／c m z ；K Y K Y E M 3 9 0 0 型扫描电子显 微镜，分辨率3 ．5 n m ；S H Z 一8 8 型台式水浴恒温振 荡器，室温～9 9 ℃可控，精确度0 ．5 ℃；D F l l 0 型分 析天平，精确至0 ．0 0 0 1 9 ；U N I C A M 型分光光度计； 1 0 1 A 一2 型干燥箱。 1 ．3 试验步骤 1 ．3 ．1 预处理。将一定量破碎至粒径1 ～2 c m 的 玉米芯用浓度约1 0 ％氨水浸泡2 0 h ，然后经清水清 洗后装入膨爆釜中，按文献[ 5 ] 中所述方法进行预处 理，处理后所得物料再次经清水清洗，防止残存氨水 对后续酶解产生影响。水洗风干后过1 ．6 5 1 m m 筛， 用烘箱于7 5 ℃下烘至质量恒定，密封贮藏。 1 ．3 ．2 酶水解。称取1 ．0 0 9 精确到小数点后2 位 玉米芯试样，置于2 5 0 m L 锥形瓶中，按实验设计 要求加入一定量、一定p H 值柠檬酸一柠檬酸钠缓 冲液，加入一定量纤维素酶，设定温度，转速1 2 0 r ／ m i n ，在恒温水浴振荡器中反应一定时间。水解液 经过滤定容，测其还原糖含量，糖化率 所得糖质 量／试样质量 1 0 0 ％。 1 ．3 ．3 分析方法。玉米芯经氨浸膨爆后微观形貌、 物理结构变化利用扫描电镜观测。酶解实验采用正 交实验设计，进行方差分析。还原糖含量采用D N S 法测定￡7 | 。 2 试验结果与讨论 2 ．1 膨爆处理效果的扫描电镜分析 图1 a 是未处理玉米芯试样的管腔状纤维组 织结构形貌，可以看到未处理玉米芯具有规则的管 万方数据 有色金属 第6 0 卷 腔结构，纤维素组分基本没有暴露出来，图中所示的 管腔，即为由木质素、半纤维素交结而成的纤维束骨 架，而纤维素则掺杂其中受其保护。图l b 和图1 c 分别为经氨水浸泡后膨爆，经清水浸泡后膨爆的 玉米芯试样形貌，可以看到膨爆预处理使玉米芯试 样的变化极其显著，原本规则的管腔结构被破坏，原 有的纤维束骨架发生断裂、变为不规则结构，整体呈 膨化疏松状态。然而，图1 ． b 和图1 c 又有不同之 处，图1 b 中玉米芯的“内瓤”即纤维素组分暴露较 图1 C 更充分，这说明采用氨水浸泡比采用清水浸 泡的膨爆预处理效果更好，这是因为氨浸不仅能够 对物料起到有效润胀作用，还能够对半纤维素及木 质素组分产生一定程度地分解破坏，使纤维素、半纤 维素、木质素的分离更加显著，从而更加有利于纤维 素水解进行。 a 一束处理； b 一氨水浸泡膨爆后； c 一清水授泡膨爆后 图1预处理前后玉米芯试样的S E M 照片 F i g ．1 S E Mp i c t u r eo fc o r nc o bb e f o r ea n da f t e rp r e t r e a t m e n t 通过对以上S E M 照片对比分析，可以看到氨纤维素酶为绿色木霉 T r i c h o d e r m aV i r i d e 产“R 一 浸膨爆预处理除具有使纤维物料膨化裂解的作用1 0 ”纤维素酶。表l 为正交实验因素水平表，表2 为 外，还能够去除部分半纤维素与木质素，更加有利于正交实验数据，表3 为方差分析结果。 纤维物料的后续水解。 表1正交实验因素水平表 2 ．2 膨爆玉米芯的酶解正交实验T a b l e 1 E l e m e n tc l a s st a b l eo fo r t h o g o n a ld e s i g n 影响酶水解效果的主要因素有反应系统p H 值、温度、反应时间、底物浓度以及酶的用量。考虑 上述5 因素对酶水解的影响，以糖化率衡量酶水解 效果，以经氨水浸泡膨爆的玉米芯为底物，设计了5 因素4 水平正交实验，每个实验重复两次。采用的 表2 玉米芯酶解实验结果 T a b l e2E x p e r i m e n tr e s u l t so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fa o r r lc o b 3 2 ．4 3 4 ．8 3 5 ．1 1 5 ．2 5 3 ．5 4 5 ．8 3 1 ．1 7 ．1 4 6 ．5 4 1 ．2 3 3 ．2 7 ．3 4 7 ．5 4 2 ．3 3 5 ．2 9 ．8 3 4 ．8 3 6 ．0 3 4 ．3 1 6 ．6 5 2 ．7 4 7 ．6 3 3 ．3 8 ．8 4 7 ．3 4 0 ．2 3 2 ．2 5 ．7 4 6 ．7 4 4 ．5 3 5 ．4 1 1 ．2 6 7 ．2 7 0 ．8 6 9 ．4 3 1 ．8 1 0 6 ．2 9 3 ．4 6 4 ．4 1 5 ．9 9 3 ．8 8 1 ．4 6 5 ．4 1 3 ．0 9 4 ．2 8 6 ．8 7 0 ．6 2 1 ．0 ●2 3 4 5 6 7 8 9 加儿￡j n H 2 万方数据 第4 期孙大为等氨浸膨爆预处理玉米芯的酶解9 7 由表2 正交实验数据表以及表3 方差分析数据 表所示，系统温度对糖化率的影响最大，底物浓度、 酶用量、p H 值影响较大，酶解时间影响较小。直观 观察表2 中序号为5 的实验糖化率最高，其工艺条 件为A 2 8 1C 2 D 3 E 4 ，由正交实验数据计算出的最优 工艺条件为A 2 B l C 4 D 4 E 4 ，即延长反应时间C ，增 大底物浓度D 可提高糖化率，这一结果与推测相 符，因为反应时间增加到4 8 h ，酶解反应更加充分， 而将底物浓度增大到7 5 9 L _ 1 使酶浓度相对增大， 利于作为催化剂的酶与底物接触。经实验验证，在 由正交实验数据计算出的最优条件下糖化率为 5 5 ．2 ％，稍高于5 号实验结果，与理论相符。所以酶 水解最佳条件为p H 值4 ．8 ，温度4 5 ℃，时间4 8 h ， 底物浓度7 5 9 L ～，酶用量6 0 ，【，g ～。 温度对酶催化反应的影响非常复杂，是影响酶 解效果的重要因素之一。一般而言，温度主要影响 酶的稳定性，酶蛋白的热变性，酶和底物的结合以及 反应系统内各种平衡。各种酶都有适宜其生长的温 度范围，酶对高温的敏感性十分明显，随着温度的升 高酶可能遭受不可逆性破坏。就某一酶催化反应而 言，只有通过实验才能确定最适宜温度。由表2 正 交实验数据及其表3 方差分析可以看出，温度是影 响酶解糖化率高低的最重要因素。在4 5 ～6 0 ℃范 围内，糖化率随温度的升高而逐渐降低，4 5 ～5 0 ℃是 其适宜温度范围，4 5 ℃是酶解最佳温度，6 0 ℃条件下 酶活性被破坏，酶解糖化率大幅下降。 表3 方差分析 T a b l e3V a r i a n c ea n a l y s i s 来源S 自由度平均平方F 值显著性 A 1 2 7 ．634 2 ．51 1 ．9 ** B5 9 2 5 ．431 9 7 5 ．15 5 3 ．2 * ’ C 4 2 ．031 4 ．03 ．9 * D2 3 1 ．437 7 ．12 1 ．6 -* E 2 1 5 ．637 1 ．92 0 ．1 ** 误差6 0 ．6 71 63 ．7 9 一一 F o ．0 1 3 ，1 6 5 ．2 9 2 ，F 0 ．0 5 3 。1 6 3 ．2 4 ．F o ．1 0 3 ．1 6 2 ．4 6 p H 值对酶解过程也具有明显影响，主要影响酶 活性部分的解离状态。可使其不能与底物结合或不 能分解产物，还可影响底物的解离状态从而影响其 对酶催化剂可及性。酶解反应最适宜p H 值与酶最 稳定p H 不一定相同，前者与反应温度、底物浓度等 反应条件都有关系，需由具体的实验来确定，实验设 计p H 值在4 ．6 ～5 ．2 之间变化，p H 4 ．8 为最佳 p H 值。 底物浓度对酶水解反应速度、酶解效果具有显 著影响。浓度低将导致采用同样酶用量 I U 儋底物 计 情况下酶的浓度相对较小，而浓度较高将导致反 应体系内酶液流动性下降，这两种情况都会影响底 物与酶催化剂的接触而不利于水解进行。实验酶解 底物浓度在1 2 ．5 ～7 5 9 L _ 1 范围内变化，5 0 9 L - 1 ～7 5 9 L - 1 范围内糖化率较高，7 5 9 L - 1 为适宜底物 浓度。 在实际生产当中，酶的成本占纤维素酶解过程 总成本一半以上，选择比较适宜的酶用量以获得较 高投入产出比十分重要，而酶解时间长短将影响生 产效率，应在不显著影响糖化率前提下尽量缩短酶 解时间。对这两个因素采用q 检验进行多重比较， 考察是否可以减少酶用量以及缩短反应时间。 2 ．2 ．1 酶用量的多重比较。S e M S e ／a r 2 3 ．7 9 ／2 4 U 2 0 ．6 9 ，q o ．0 5 3 ．0 0 ，q o ．0 1 4 ．1 3 ， D o ．0 5 S e q o ．0 5 0 ．6 9 3 ．0 0 2 ．0 7 ，D o ．o l S e q o ．0 1 0 ．6 9 4 ．1 3 2 ．8 5 。 表4 表明，酶用量第3 水平与第4 水平 即 5 0 I U g - 1 与6 0 I U g - 1 糖化率均较好，而第4 水平 与第1 水平 3 0 I U g - 1 、第2 水平 4 0 I U g - 1 糖化 率差异均达到极显著水平，而与第3 水平糖化率差 异达到显著水平。考虑酶成本问题，在实际应用当 中以5 0 I U g q 底物较为适宜。 2 ．2 ．2 反应时间的多重比较。表5 表明，反应时间 各水平糖化率比较接近，第4 水平 即反应4 8 h 与 第1 水平 反应1 2 h 糖化率差异达到极显著水平， 万方数据 9 8有色金属 第6 0 卷 而与第2 水平 反应2 4 h 、第3 水平 反应3 6 h 糖化 率的差异均不显著。考虑生产效率问题，在实际应 用当中，反应2 4 h 即可停止。 表4 酶用量的多重比较 T a b l e4 M u l t i p l ec o m p a r i s o no fd o s a g eo fe n z y m e 表5 反应时间的多重比较 T a b l e5M u l t i p l ec o m p a r i s o no fr e a c t i v et i m e 2 ．3 不同预处理玉米芯酶解结果比较 在相似酶解工艺条件下。与相关试验研究结果 比较，可对所述氨浸膨爆预处理及其酶解糖化效果 做出初步评价。陈育如⋯8 采用蒸汽爆破法对玉米 芯进行预处理，然后采用里氏木霉产纤维素酶进行 水解，获得0 ．6 4 9 还原糖／g 一原料的试验结果 从其 糖化百分率换算得到 ，用8 ％～l O ％N a O H 对玉米 芯进行预处理，相应的试验结果为0 ．5 9 9 还原糖／g 一原料。杨小寒归J 采用机械粉碎方法预处理玉米 芯，过8 3 3 t - m 筛后利用C e l l u s o f t 纤维素酶进行水 解，糖化试验结果为0 ．2 2 9 还原糖／g 一原料。 参考文献 表6 为试验结果与文献报道的试验糖化效果对 比。可见，氨浸膨爆预处理效果略逊于蒸汽爆破与 N a O H 处理，这主要是由于氨浸膨爆技术研发还不 够成熟，尚需进一步加强针对不同物料氨浸膨爆技 术参数优化研究。与汽爆等预处理技术相比，氨浸 膨爆预处理工艺简单，设备投资小，综合能耗低，具 有性价比优势。还应进一步试验研究，提高其酶解 效率以及同步糖化发酵效果。 表6 不同预处理玉米芯酶解结果 T a b l e6E n z y m a t i ch y d r o l y s i sr e s u l t so fc o r nc o b w i t hd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n t 3结论 1 氨浸膨爆预处理技术是一种有效的天然木 质纤维素预处理手段，经其处理后，玉米芯变得膨化 疏松，纤维素组分暴露更加充分，纤维束产生不同程 度破坏甚至断裂，从而有利于后续的酶水解。 2 玉米芯经氨浸膨爆后，利用绿色木霉产纤维 素酶水解，最优条件为p H 4 ．8 ，温度4 5 ℃，时间 4 8 h ，底物浓度7 5 9 L - 。，酶用量6 0 I U g ～。 3 经过氨浸膨爆预处理后，经酶解可得还原糖 0 ．5 9 ／g 一玉米芯试样以上，略低于蒸汽爆破处理玉 米芯0 ．6 4 9 糖／g 一原料，但是预处理环节更具成本优 势，性价比较高。 [ 1 ] 于斌，齐鲁．木质纤维素生产燃料乙醇的研究现状[ J ] ．化工进展，2 0 0 6 ，2 5 3 2 4 4 2 4 9 ． [ 2 ] 罗鹏，刘忠．用木质纤维原料生产乙醇的预处理工艺[ J ] ．酿酒科技，2 0 0 5 ， 8 4 2 4 7 ． [ 3 ] N u n e sAP ，P o u r q u i eJ ．S t e a me x p l o s i o np r e t r e a t m e n ta n de n z y m a t i ch y d r o l y s i so fe u c a l y p t u s 、∞o d [ J ] ．B i o r e s o u r e eT e e h n o l o g Y ，1 9 9 6 ， 5 7 1 0 7 1 1 0 ． [ 4 3 徐勇，勇强，单谷，等．汽喷玉米秸秆纤维素酶水解的研究[ J ] ．林产化工通讯，1 9 9 9 ，3 3 6 1 5 一1 8 ． [ 5 ] 熊代余，秦虎，花宝玲，等．炸药爆炸膨化裂解植物纤维试验研究[ J ] ．有色金属，1 9 9 7 ，4 9 4 8 2 8 7 ． [ 6 ] 熊代余，汪旭光，田瑞齐，等．木质纤维物料的爆炸冲击裂解预处理新方法[ J ] ．纤维素科学与技术，1 9 9 8 ，6 4 2 2 2 7 ． [ 7 ] 栾雨时，包永明．生物工程实验技术手册[ J ] ．北京化学工业出版社，2 0 0 5 3 7 ． [ 8 ] 陈育如，夏黎明，岑沛霖．蒸汽爆破预处理对植物纤维素性质的影响【J ] ．高校化学工程学报，1 9 9 9 ，1 3 3 2 3 4 2 3 9 ． [ 9 ] 杨小寒，周美华，黄爱玲．废弃纤维材料的酶水解[ J ] ．东华大学学报 自然科学版 ，2 0 0 5 ，3 1 1 1 2 0 1 2 3 ． 下转第1 0 4 页，C o n t i n u e do nP ．1 0 4 万方数据 1 0 4有色金属 第6 0 卷 [ 3 7 ] 陈祖耀，张国春，朱玉瑞．金属C o 超细粉的7 射线辐照制备[ J ] ．金属学报，1 9 9 7 ，3 3 1 0 1 1 1 0 1 1 1 4 ． A d v a n c e si nR e c y c l i n gT e c h n o l o g yR e s e a r c hf o rS p e n tS e c o n d a r yB a t t e r i e sa sR e s o u r c e S U NX 协谢1 ，X US h e n g - r n i 以9 1 ，L IL i n ．y a n l ，X UG a n 9 1 ．，W A N GC h e n g - y a n 2 ，O I UD i n g - f a n l 2 1 ．I n s t i t u t eo fN u c l e a ra n dN e wE n e r g yT e c h n o l o g y ，T s i n g h u aU n i v e r s i t y ，B e i j i n g1 0 0 0 8 4 ，C h i n a ； 2 ．B e i j i n gG e n e r a lR e s e a r c hI n s t i t u t eo fM i n i n ga n dM e t a l l u r g y ，B e i i i n g1 0 0 0 4 4 ，C h i n a A b s t r a e t S p e n ts e c o n d a r yb a t t e r i e sb e c o m ei m p o r t a n tr e s o u r c e sf r o mw h i c hm e t a le l e m e n t sc a nb er e c o v e r e d ．T h e r e c y c l i n gp r o c e s so f t h r e et y p e so fs e c o n d a r yb a t t e r i e sa n dv a r i o u sp r e p a r a t i o nm e t h o d so fs e v e r a lk i n d so f e l e c t r o d em a t e r i a l sa r er e v i e w e d ． K e y w o r d s m e t a l l u r g i c a lt e c h n o l o g y ；s p e n ts e c o n d a r yb a t t e r i e s ；r e v i e w ；u l t r f i n ec o b a l tp o w d e r ；L i C 0 0 2 ； L i M n l 。v N i 。C o y C h ；N i C oa l l o yp o w d e r ． 上接第9 8 页，C o n t i n u e df r o mP ．9 8 E n z y m a t i cH y d r o l y s i so fC o r nC o bP r e t r e a t e db yA m m o n i aM a r i n a t i n ga n dE x p l o s i o nD i l a t a t i o n S U ND a w e i ，X I O N GD a i y u B e O i n gG e n e r a lR e s e a r c hI n s t i t u t eo fM i n i n ga n dM e t a l l u r g y ，B e i j i n g1 0 0 0 4 4 ，C h i n a A b s t r a c t T h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc o r nc o bp r e t r e a t e db ya m m o n i am a r i n a t i n g e x p l o s i o nd i l a t a t i o ni si n v e s t i g a t e d b vp r e t t e a t e dm a t e r i a lm i c r o s t r u c t u r eo b s e r v a t i o nw i t hs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y S E M ，a n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o nd e t e r m i n a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i st h r o u g ht h eo r t h o g o n a ld e s i g n ．T h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e A E Mc a nd i l a t a t ea n ds e p a r a t el i g n o c e l l u l o s ee f f e c t i v e l y ．T h eo p t i m a lp r e t r e a t m e n tc o n d i t i o no fA E M i sp H2 4 ．8 ，4 5 “ C ，4 8 h ，7 5 9c o r nc o b ／La n d6 0I Ue n z y m e ／g c o r nc o b ．M o r et h a n0 ．5g s u g a r ／奢- c o r nc o bc a nb e o b t a i n e db ye n z y m a t i ch y d r o l y s i su n d e ro p t i m a lc o n d i t o n ． K e y w o r d s c h e m i c a le n g i n e e r i n g ；c e l l u l o s e ；p r e t r e a t m e n t ；e n z y m a t i c ；e x p l o s i v ed e t o n a t i o n 万方数据