紫金山铜矿浸矿微生物中一株硫杆菌的分子生物学鉴定.pdf

第5 9 卷第3 期 2007 年8 月 有色金属 N o n f e r r o u sM e t a l s V 0 1 ．5 9 ，N o ．3 A u g u s t20 07 紫金山铜矿浸矿微生物中一株硫 杆菌的分子生物学鉴定 武名麟1 ，阮仁满1 ，翟永功2 ，温建康1 1 ．北京有色金属研究总院，北京1 0 0 0 8 8 ；2 ．北京师范大学生命科学学院，北京1 0 0 8 7 5 摘要对福建紫金山铜矿生物堆浸系统中的浸矿微生物进行分离纯化，对得到的纯化培养物采用了多相分类与系统发育 分析方法。应用1 6 Sr R N A 基因全序列分析技术，进行分子生物学鉴定、微生物形态性征与生理生化代谢特征鉴定。结果表明，该 ， 菌株归属于硫杆菌 1 r I I I o b a c m ∞ 属，可认定为T h i o b a c i l 垴a l b e r t e m i s 菌株。 ， 关键词冶金技术；生物冶金；细菌鉴定；分子生物学；1 6 Sr R N A 基因；紫金山铜矿 中图分类号T F l l l ．3 1 1 ；Q 9 3 3 3 1文献标识码A文章编号1 0 0 1 一0 2 1 1 2 ∞7 0 3 0 0 4 3 一嘶 生物冶金技术具有能耗低，投资省，流程短，污染 小的优势，近年来在国内外广泛应用于低品位、难处 理矿石的金属提取。位于福建上杭的紫金山铜矿是 国内最早进行生物冶金工程化实践并取得成功的矿 山之一，其万吨级生物提铜矿山已经建成投产[ 1 】。 用于生物冶金的微生物主要包括氧化亚铁硫杆 菌、氧化硫硫杆菌、铁氧化钩端螺旋菌以及嗜酸性硫 杆菌等化能自养菌，还包括一些异养菌，甚至一些真 菌、酵母菌和藻类。多种微生物独立或协同作用促 进浸矿反应的进行，构成一个完整的微生态系 统[ 2 1 。如何驾驭这些微生物，使它们在不同的矿物 环境中充分发挥作用就成为生物冶金技术发展的关 键问题之一。要解决这个难题，首先就要对浸矿微 生物的分类归属情况进行鉴定，进而建立生物冶金 微生物资源库，达到能够针对不同的矿石类型采用 相应微生物来进行处理的目的。所以微生物鉴定工 作是生物冶金技术中合适菌种选择应用的基础。 随着现代生物技术的发展，微生物的鉴定手段 得到了不断完善，特别是分子生物学技术的发展，使 微生物的分类鉴定达到了分子水平，鉴定结果更为 快捷、准确。在国际上，有一些学者应用分子生物学 鉴定方法对浸矿微生物进行了一些鉴定研究。如 P a u lRN o r r i s [ s ] 。G o l y s h i n aOV [ 4 l ，P a s c a l eD eW u l f 收稿日期2 0 0 5 1 2 0 6 基金项目“9 7 3 ”国家重点基础研究发展规划课题资助项目 2 0 0 4 C B 6 1 9 2 0 6 作者简介武名辟 1 9 7 4 一 。男。天津市人，工程师，硕士，主要从事 矿物加工与生物冶金技术等方面的研究。 一D u r a n d [ 5 ] ，M o n i c aV a s q u e z [ 引，J a i m eR o m e r 0 [ 7 1 ， G e o b e lBM 和ES t a c k b r a n d t [ 耵，PP a t t n a p i p i t p a i s a l [ 9 ] 及J o a n n eMS a n t i n i [ 1 0 】都进行过这方面的研 究。目前国内有关这方面的研究尚未见公开报道。 研究中，采用了分子生物学鉴定、微生物形态性 征测定与微生物生理生化代谢特征测定相结合的鉴 定方法，对经过分离纯化的紫金山浸矿微生物进行 了多相分类鉴定。 1实验方法 1 ．1 混合菌群的分离与纯化 采用稀释平板、多种筛选性培养基及平板划线 分离相结合的方法分离出了纯化培养物。同时对纯 化培养物进行了生长行为研究。其中所选筛选性培 养基配方为来自D S M Z G e r m a nN a t i o n a lR e s o u r c e C e n t r ef o rB i o l o g i c a lM a t e r i a l 德国国家生物材料资 源中心 的M 8 8 2 、M 7 0 9 异养型、M 7 0 9 自养型、 M 1 3 5 、M 7 0 、M 1 5 0 、M 1 5 0 a 、M 8 8 共8 种，分别编号 为1 ～8 号。 首先将培养于9 K 培养基中的混合菌原液转接 入1 ～8 号液体培养基中，观察其生长情况，若在该 培养基中有浸矿菌生长，则在培养继代后进行稀释 平板涂布法操作，接人固体斜面培养基后观察生长 情况。若有必要则再采用平板划线分离法操作。如 此反复，直至分离到纯化菌株为止。然后将该菌株 转接至液体培养基中进行扩大培养。 试验中液体培养基接种量均为1 0 ％ 1 0 m L ／ 1 0 0 m L ，细菌计数均采用光电比浊法，试验中同步 测量培养液的p H 值及电位值。 万方数据 有色金属第5 9 卷 I ．2 微生物鉴定 对纯化培养物采用了多相分类与系统发育分析 方法，进行了分子生物学鉴定、形态学与生理生化代 谢特征鉴定。 1 ．2 ．1 分子生物学鉴定。r R N A 分子存在于所有 生物中，具有相同的生物学功能，r R N A 分子中既包 括高度保守区又包含高度可变区，这些特征使 r R N A 分子成为适宜于细菌系统发育研究的“进化 钟”I n 】。1 6 Sr R N A 普遍存在于原核生物和真核生 物细胞之中，为蛋白质合成的必要场所，其生理功能 重要而恒定。在细胞中1 6 Sr R N A 大量存在，易于 提取，基因稳定，分子量适中 核苷酸数量为1 4 7 5 ～ 1 5 4 4 个 [ 1 2 - 1 引，且信息量大而易于分析。更为重要 的是1 6 Sr R N A 基因分子序列变化缓慢，具有分子 计时器的特点，其中的某些碱基顺序非常保守，以致 在3 0 多亿年的生物进化过程中仍保持着原始的状 态，而不像另一些基因序列那样变化很大，由于1 6 S r R N A 基因分子中含有进化速度不同的区域，可用 于进化程度不同的生物之间的系统发育研究。1 9 7 7 年W o e s e 等首先选择它作为研究生物进化的大分 子。现在1 6 Sr R N A 基因全序列分析已经成为细菌 鉴定的常规方法之一L 1 4 ] 。 研究中，以来源于大肠杆菌1 6 Sr R N A 基因序 列的保守区域为引物，利用P C R 技术，扩增待测菌 株的1 6 Sr R N A 基因，然后将扩增产物直接测序，从 而获得1 6 S r D N A 序列。通过相应的分子生物学软 件，对所测得的序列与相关数据库中已知菌种的 1 6 Sr D N A 序列进行比对，计算聚类相似值，计算进 化距离，根据相似性矩阵作出系统发育树，分析菌株 系统发育地位L 1 3 - 1 4 ] 。 由形态及菌落观察结果初步认定该纯化培养物 为细菌，将其于适当培养基上进行继代扩大培养，采 用水平空气浴摇床，1 5 0 r ／m i n ，3 0 ℃，生长至该细菌 的对数生长期时取样镜检，确定无杂菌后离心收集 菌体。提取总D N A ，制备成模板D N A ，电泳检查其 纯度和浓度，并调整模版D N A 浓度约为2 5 g ／m L ， 进入P C R 扩增反应。。 P C R 反应是多聚酶链式反应 P o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n 的简称，是近年来发展起来的一种体外扩 增特异性D N A 片段的技术I t 3 】。该技术实际上是在 模板D N A ，引物和4 种脱氧核糖核苷酸 d N T P 存 在的条件下依赖于D N A 聚合酶的酶促反应，其特 异性取决于引物和模板的特异性。 在试验中，采用了引物P 1 和P 6 ，它们来源于大 肠杆菌1 6 Sr R N A 基因序列的保守区域，并分别在5 ， 端引入了B a m H I 酶切位点和两个保护碱基，为1 6 S r R N A 基因P C R 反应的通用引物。引物配制成 5 0 n m o l ／L 的浓度储存。 依次在0 ．5 m L 的P C R 用薄壁管中加入 d d H 2 0 、1 0 扩增缓冲液、M g C l 2 、1 0 m m o l ／Ld N T P 、 P 1 、P 6 、模板D N A 、T a q D N A 聚合酶，建立扩增体系。 混匀后速离心置于P C R 仪中，进行P C R 扩增反应。 取5 t a L 扩增产物，分别与5 肛L 无菌水和2 止上 样缓冲液混合均匀后，在0 ．7 ％的琼脂糖凝胶上进 行电泳，以2 0 0 b pL a d d e rM a r k e r 为标准D N A 分子 量对照物。电泳后经过E B 染色，于A l p h a l m a g e r 2 2 0 0 凝胶成像系统下观察，检测扩增片段的长度和 浓度。于一2 0 ℃下保存扩增产物。 P C R 扩增产物委托上海生工生物工程技术服 务有限公司进行测序。测序引物为引物P 1 和P 6 ， 测通。所用测序仪器为A B IP R I S M3 7 7 9 6 ，测序 试剂为B i g D y et e r m i n a t o rv 2 ．0 0 采用D N A m a n 软件对多个菌株1 6 Sr D N A 序 列测序结果进行碱基差异性分析，并建立1 6 Sr D N A 序列同源树。 利用B L A S T 软件，将所测得的1 6 Sr D N A 序列 与G e n B a n k 数据库中的已知菌株的1 6 Sr D N A 序列 进行比较，依据比较结果选择相关菌株的1 6 Sr D N A 序列 同时选用E ．e o l i1 6 Sr D N A 序列，以衡量发育 树的准确性 ，使用在线软件c l u s t a l x 和P h y l o g e n e t i e T r e eP r e d i c t i o n 及p h y h p 构建系统发育树。 1 ．2 ．2 细菌的形态学与生理生化代谢特征鉴定。 根据参比菌株的特征，选择等相关的生理生化测得 项目对纯化菌株细胞的形态学特征和生理生化代谢 特征进行测定。 形态学鉴定包括菌体形状、细胞排列方式、运动 性、芽孢形状、芽孢着生方式、鞭毛着生方式、革兰氏 染色、菌落特征、液体培养特征的观察和生长p H 值 范围、生长温度范围的测定。 生理生化代谢特征鉴定包括了碳源利用测定、 氮源利用测定、N a 2 S 2 0 3 氧化能力测定、H 2 S 氧化能 力测定、氧化酶测定、淀粉水解试验及D N A 酶活性 检测等，具体方法如下。 碳源利用测定。被测底物为蔗糖、麦芽糖、D 一 葡萄糖、甘露醇、乙醇、丙三醇。过滤灭菌，培养基中 底物终浓度为0 ．5 ％。培养基中加入灭菌S 粉l O g ， 以菌悬液接种，连续转接培养三代，生长者为阳性。 氮源利用测定。将磷酸氢二铵、碳酸铵、硝酸钾 万方数据 第3 期武名麟等紫金山铜矿浸矿微生物中一株硫杆菌的分子生物学鉴定4 5 加到基础培养基中，浓度均为0 。1 ％。另做一份不 加氮源的空白对照。培养基中加入灭菌S 粉1 0 9 。 分别调节p H 为适当值，分装试管，每管内培养基约 4 - - 5 c m 高。1 1 2 ℃灭菌2 0 ～3 0 m i n 。制备好的培养 基要求无沉淀。用接种环接种处于生长对数期的菌 液于培养基中。3 0 ℃培养5 d 和1 0 d ，与接种的对照 管比较浑浊度，比对照管浑浊者为阳性反应，如难以 判断时，可用该培养基连续转接培养3 次，如仍明显 生长则肯定阳性。 N a 2 S 2 0 3 氧化能力测定。将N a 2 S 2 0 31 0 9 加入 培养基中，培养基中加入灭菌S 粉1 0 9 。以菌悬液 接种，连续转接培养三代，生长者为阳性。 H 2 S 氧化能力测定。采用纸条法，培养基中加 ．人灭菌S 粉1 0 9 ，分别调节p H 为适当值，分装试管， 每管内培养基约4 ～5 e m 高。1 1 2 ℃灭菌2 0 ～ 3 0 m i n ，制备好的培养基要求无沉淀。将普通滤纸 剪成0 ．5 ～l e m 宽的纸条。长度根据试管与培养基 高度而定。用1 0 ％的醋酸铅将纸条浸透，然后烘 干，放于培养皿中灭菌备用。用新鲜培养物分别接 种于该培养基。接种后，用无菌镊子夹取一条醋酸 铅纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接近培养基 表面，不接触液面，适温培养。于接种后第5 ，l O ， 1 5 d 观察。纸条变黑色者为阳性，不变者为阴性。 另制作空白对照和阴性对照。 氧化酶测定。在干净培养皿中放一张滤纸，滴 上二甲基对苯撑二胺的1 ％水溶液，仅使滤纸湿润 即可，不可过湿。用白金丝接种环取1 8 ～2 4 h 的菌 苔，涂抹在湿润的滤纸上，在1 0 s 内涂抹的菌苔显红 色者为阳性， 四甲基对苯撑二胺为蓝色 1 0 ～6 0 s 显红色者为延迟反应。6 0 s 以上显红色者不计，按 阴性处理。 淀粉水解试验。在适当培养基中加入0 ．2 ％可 溶性淀粉，分装三角瓶，高压湿热灭菌2 0 m i n ，冷却 至4 5 ～5 0 ℃，倒平板，在3 7 ℃放置过夜备用，将供试 菌株点种在平板上 每个平板点种5 株 ，在3 0 ℃培 养形成菌苔后，在平板上滴加L u 【l g a l 碘液 同革兰氏染 色的碘液 ，使碘液覆盖在平板表面。如在菌苔周围 或菌苔下 将菌苔移去后观察 的培养基由蓝色变为 透明，为淀粉水解阳性。如在菌苔周围或菌苔下的培 养基都为深蓝色，则说明该菌株为淀粉水解阴性。 D N A 酶活性检测。分别在培养基中加入2 ‰ D N A 和0 ．1 ％o 的甲苯胺兰 T o I u i d b l u e ，制成平板 培养基。接种，3 0 ℃培养3 ～5 d ，若茵落周围出现粉 红色晕圈则为反应阳性，反之为阴性。 2 试验结果与分析 2 ．1 分子生物学鉴定结果 2 ．1 ．1 D N A 提取物的电泳检测。采用上述方法提 取细胞总D N A 。取5 t a L 提取物，分别与5 t t L 无菌水 和2 t t L 上样缓冲液混合均匀后，在0 ．3 ％的琼脂糖 凝胶上进行电泳，上样量5 肛L 。电泳凝胶经1 0 m g ／ m LE B 染色3 0 m i n ，放入A l p h a l m a g e r2 2 0 0 凝胶成 像系统，由波长为3 0 2 n m 的紫外光激发荧光。摄录 成像，结果见图l 。在图l 中，在凝胶上出现明亮的 D N A 条带，表明D N A 提取试验结果良好。在上样 孔中仍残留有D N A 物质，这可能是所提细菌中存 在质粒，在D N A 提取过程中未予去除，或是D N A 提取过程中有部分蛋白质没有去除干净，造成的轻 微污染。但该残留不影响试验结果。 图1 细菌总D N A 提取物的电泳检测结果 F i g ．1 P r o f i l e so fd e e t r o g h o t e t i ea n a l y s i st o e x t r a c to ft o t a lD N Ai ns t r a i n 2 ．1 ．21 6 S tD N AP C R 扩增产物的电泳检测。紫 金山浸矿细菌的1 6 S rD N A 序列的长度应该在 1 5 0 0 b p 左右。由图2 可见，P C R 扩增产物的条带大 小在1 4 0 0 b p1 6 0 0 b p 之间，这表明该扩增产物是目 的D N A 片段。 1 一面s 一1 ；2 ／3 一面5 3 ；4 一空白样品；5 ／6 2 0 0 b pl a d d e r 。 图2P C R 扩增结果 F i g ．2 P r o f i l e so f1 6 Sr D N AP C Rp r o d u c t s 万方数据 有 色金属 第5 9 卷 2 ．1 ．31 6 Sr D N A 扩增产物的测序结果。采用前 述方法进行D N A 测序，得到以下结果。纯化培养 物测序结果，序列长度为1 4 3 8 b p 。 C G G C A T G C C T AA C A C A T G C AA G T C G A A C G G T ． A A C A G G T C T T C G G A T G 汀G A C G A G T G G C G G A C G G G T G A G 曩A A l ’ [ ；T A G G A A T C T G T C T l v I ’G ． A J G T G C 8 G G A C AA C C C A G G G AAA C l v 】弋3 G G C 7 I A - A T A C C G C A T AA G C C C T G A G G 狮A A A G C G G 、- G G A T C r ] r C G G A C ∞C G C G C r o G AA G A G G A G 双K 帆吼G 獭娲双峨矾蹶僦氏氏～ G C ℃C T A C C AA G G C G A C G A l ’ ’ 二T A G C T G 6 T C ． 飞G K G 各￡G G 娥K 溉随＆忑G G G 夸O 己忑G 氏G ． A C A C G G C C C A G A C T C C r A C G G G A G G C A G C A G T ． G C ￡G AA 1 1 ] _ I ’T O G C AA 1 ．C ；G G G G C AA C C ℃T G A ． C G AA G C AA T G C C G C G T G A A T G A A G A A G G C C T T C G G G 仃v 】W AAA G T T C l v 】W G T G G A G G A C G A ． AAA G C 玎G G n 3 C T AA T AA C G C C T G C T G I 。r G A - C G T G A A T C C A A G A A G A A G C A C C G G C T A A C T C C G T G C C A G C A G C C G C G G T AA T A C G G o G G G T G A A G C G T T AA T C G G A A T C A C r G G G C G T A A A G G ． G T G C G T A G G C G G T G C A T T A G G T 玎G T C G T G A ． A A T C C C C G _ C K j 明C A A C C T G G G A A T G G C G G T G ． G AAA C C G G T G T A C T A G A G T A T G G G A G A K ；G T G G T G B AA ，I ] r C C A G G T G 弘G C G 瓢A A A T G C G 一 飞氏G 氏G 舡忑C 忑Q G 、G G p A C 叁飞c 争O 己弋G 忑C G 入套Q G ． C G G C C A C C 汀G G C C C AA T A C T G A o G C I T G A G G C A - 0 饼蒯G ∞佑G 矧G 翻一一翻G 翻翮翻劢一 C C C T G G T A G T C C A C G C C C T AAA C G A T G AA T A C T A G A T G T T T G G T G C C A A G C G T A C T G A G T G T G T A G C T A A C G C G A T A A G T A T T 0 0 G O C T G G G A ． A G T A C G G C C G C A A G G T T A A A A C T C A A A G G A A 一 1 T G A C G G G G G C C C G C A C A A G c G G T G G A G C A T ． G T G G 们AA T T C G A l I ￡AA C G C G A A G AA C C T T ． A C C T G G K 耵G A C A T G T 了r G G AA T C C T G C A G ． A G A T G C G G G A G T G C C C T T C G G b A A T C A G AA ． C A C A G G T G C T G C A T G G C T G T C G T C A G C T C G T G T C G T G A G A T G T T G G G T T A A G T C C C G C A A C G A G ￡G C AA C C C l v r G l ℃I 耵A G T T G C C A G C G G T T ． C G G C C G G G C A C T C T A G G G A G A C T G C C G G T G A ．- C AAA C C G G A G G AA G G T G G ￡A T G A C G T C A A G T C C T C A T G G O e m A T G T C C A G G G C r A C A C A C ． G T G C T A C A A T G G C G C G T A C A G A G G G A A G C C A ． A ；C C G C G A G _ G T G G A G C A G A C C C C A G AAA G C G C G T C G T A G I T C G G A T r G C A 汀C T G C A A C r C G ． A C r G C A T G A A G ，r C o G AA T C o C T A G T AA T O G G G 瓠c 氏瓯峨议骰婀G 氏觚枝∞飞暇G ． G G C C r r C 汀A C A 巴舱C G C C C G ，r C A C A C C A T G G ≥ ．椒∞m 吼憾晦氏嫩￡m 撇K 心 C T T a G o G A G G o C G A ，r G A C C A c G G T A T G G T T D 1 G 入‘ 2 ．1 ．4 系统发育分析结果。利用B l a s t 软件，应用 D N A M A N 软件将所测定的1 6 Sr D N A 序列与G e n b a n k 中的已知菌株的1 6 Sr D N A 序列进行比 对[ i s - 1 6 J 。采用e l u s t a l x 和P h y l i p 软件对作该菌株 系统发育树状图，结果见图3 ，其中T A 代表 T h i o b a c i l l u s a l b e r t e n s i s ；1 9 3 7 7为T h i o b a e i l l u s t h i o o x i d a n s 的A T C C l 9 3 7 7 菌株；B 5 3 为T h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s 的s 3 菌株；W J s 0 为T h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s 的w J s 0 菌株；T 为T h i o b a c i l l u ss p 既某种未 鉴定的硫杆菌；T F 为T h i o b a c i i l u sf e r r o o x i d a n s 的 A T C C l 9 8 5 9 菌株；E 为大肠杆菌E c o l i ；Z J S - 3 为待 测菌株。 图3 以1 6 Sr R N A 序列为基础的系统发育树状图 F i g ．3 R o o t e dp h y l o g e n e t i ct r e ed e r i v e df r o mad i s t a n c e m a t r i xb a s e dO nac o m p a r i s o no f1 6 S r D N As e q u e n c e 由以上数据可知，待测菌株与T h i o b a c i l l u sa l b e r t e n s i s 的碱基序列基本一致，仅在第7 0 0 位碱基 上出现差异，其序列同源性高达9 9 ．9 3 ％。同时，该 菌株与T h i o b a c i l l 邺t h i o o x i d a 粥 A e i d t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s 的几个菌株1 6 Sr D N A 序列同源性也达 到了9 7 ％以上。由此可以认定该菌株归属于硫杆 菌 T h i o b a e i l l u s 。即为T h i o b a c i l l u sa l b e r t e n s i s 菌株。 T h i o b a c i L l u sa l b e r t e n s i s 又名T h i o b a c i l l u sa l b e r t i s 分 别由B r y a n t 等[ 1 7 】在1 9 8 8 年与K e l l y 和W o o d [ 1 8 】在 2 0 0 0 年公开报道。 ’ T h i o b a c i l l u sa l b e r t e n s i s 的已知系统归属情况 为细胞生物 c e l l u l a ro r g a n i s m s 界，细菌 B a c t e r i a 域，变形细菌 P r o t e o b a c t e r i a 纲，7 一变形细菌 嗡 一 一 ～ 弘 一 E 。 邗。 万方数据 第3 期武名媵等紫金山铜矿浸矿微生物中一株硫杆菌的分子生物学鉴定4 7 G a m m a p r o t e o b a c t e r i a 亚群，嗜酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i U a l e s 目．嗜酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l a c e a e 科，嗜酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l u s 属。N C B l 分类号 T a x o n o m y I D 为1 1 9 9 7 8 。 2 ．2 细菌的形态学与生理生化代谢特征鉴定结果 细菌的形态观察与生长条件的确定试验结果见 表1 ，形态特征见图4 。 表1 菌株的形态特征和生长条件 T a b l e1 m o r p h o l o g i cc h a r a c t e ra n dg r o w t hc o n d i t i o no fs t r a i n 测定项目结果测定项目结果 菌体形状 杆状蔗糖一 细胞排列方式单生麦芽糖 一 运动性可运动 D 一葡萄糖 一 芽孢形状 一 甘露醇 一 芽孢着生方式 一 乙醇 一 鞭毛着生方式 一 丙三醇 一 革兰氏染色阴性磷酸氢二饺 一 菌落特征然 碳酸饺 液体培养特征鬈娄 硝酸钾 生长p H 值范围 2 6 ’N a 2 S 2 0 3 4 - 生长温度范围 1 5 - - 4 0 ℃ 氧化酶活性 H 2 S 氧化能力 一 D N A 酶活性 淀粉水解能力 一 以上试验结果表明，该菌株细胞呈杆状，细胞单 生，可运动，革兰氏染色呈阴性，固体菌落不规则，有 凸起，显白色，菌落形态微小。该菌株不能以有机物 为碳源生长．能以碳酸铵、硝酸钾为氮源生长具有氧 化酶和D N A 酶活性。不能水解淀粉，不具有硫化氢 氧化能力。该菌株最佳生长p H 范围为2 ～6 ，最佳生 长温度范围为1 5 - - 4 0 1 2 ，为嗜中温嗜酸性自养菌。 图4 菌株形态 №．4A p p e a r a n c eo fs t r a i n 3结论 将细菌分子生物学鉴定方法引入生物冶金领 域，采用多相分类与系统发育分析方法，应用1 6 S r R N A 基因序列分析比对手段对对紫金山铜矿浸矿 微生物经纯化得到的一株菌株进行了分子水平上的 鉴定。结果表明，该菌株归属于硫杆菌 T h i o b a c i l ． 1 u s 属，可认定是T h i o b a c i U U Sa l b e n e n S i s 菌株，该菌 株又名T h i o b a c i l l u sa l b e r t i oT h i o b a c i l l u sa l b e r t e n s i s 的已知系统归属情况为细胞生物 c e l l u l a ro r g a n ． i s m s 界，细菌 B a c t e r i a 域，变形细菌 P r o t e o b a c t e r i a 纲，7 一变形细菌 G a m m a p r o t e o b a c t e r i a 亚群，嗜 酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l a l e s 目，嗜酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l a c e a e 科，嗜酸性硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l u s 属。其N C B l 分类号 T a x o n o m y I D 为1 1 9 9 7 8 。 参考文献 [ 1 】王淀佐，阮仁满，董清海．矿物生物提取技术的研究与进展【C ] ／／铜镍湿法冶金技术交流及应用推广会论文集．厦门 中国有色金属学会，2 0 0 1 2 9 ． [ 2 ] R a w l i n g sDE ．B i o m i n i n g T h e o r y ，M i c r o b e sa n dI n d u s t r i a lP r o c e s s ．S p r i g e r - V e r l a ga n dL a n d e sB i o s c i e n c e [ M ] ．N e wY o r k S p r i g e r - V e r l a ga n dL a n d e sB i o s c i e n c e ，1 9 9 7 2 2 9 2 7 9 ． 【3 ] P a u lRN o r r i s ，D a r t e rAC l a r k ，J o m t h a nPO w e n ，e ta 1 ．C h a r a c t e r i z a t i o no fS u l f o b a c i U u sa c i d o p h i u ss p ．n O V ．，a n do t h e rm o d e r - a t d yt h e r m o p h ／l i em i n e r a l - s u l p h i d e - o x i d i z i n gB a c t e r i a [ J ] ．M i c r o b i o l o g y ，1 9 9 6 ，1 4 2 7 7 5 7 8 3 ． [ 4 ] G o 炳I l i l ∞OV ，P i v o v a r m , aTA ，K a r a v a i k oGI ，e ta 1 ．F e r r o p l a s m aa e i d i p h i l u r ng e n ．n o v ．，印．n o v ．，a na c i d o p h i l i c ，a u t o t r o p h i c ，f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g ，c e U - w a l l - h c k i n g ，m e s o p h i l i cm e m b e ro ft h eF e r r o p h s m a c e a er a m ．n o v ．，c o m p r i s i n gad i s t i n c tl i n e a g e o ft h eA r c h a e a [ J ] ．I n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo fS y s t e m a t i ca n dE v o l u t i o n a r yM i c r o b i o l o g y ，2 0 0 0 ，5 0 9 9 7 1 0 0 6 ． 【5 ] P a w ．a l eD eW u l f - D u r a n d ，L a l e t t eJB r y a n t ，L i n d s a yIS l y ．P C R - m e d i a t e dd e t e c t i o no fa c i d o p h i l i cb i o l e a c h i n g - a s s o d a t e db a c t e r i a [ 盯．A p p l i e da n dE n v i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y ，1 9 9 7 ，6 3 7 2 9 4 4 2 9 4 8 ． [ 6 ] M o I l i 龃V a s q u e z ，E d w a r dRBM o o r e ，R o m i l i oTZ s p e j o ．D c t e e t i o nb yp o l m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - a m p l L f i c a t i o na n ds e q u e n c i n go f a na r c h a e o ni nac o m m e r c i a l - s c a l ec o p p e rb i o l e a c h i n gp l a n t 【J ] ．F E M SM i c r o b i o l o g yL e t t e r s ，1 9 9 9 ，1 7 3 1 1 8 3 1 8 7 ． [ 7 ] J a i m eR o m e r o ，C a r o l i n aY a ∞，M 6 l l i ∞V 6 s q u e z ，e ta 1 ．C h a r a c t e r i z a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fa ni r o n - o x i d i z i n g ，L e p t o s p i r i U u m - 万方数据 有色金属第5 9 卷 l i k eb a c t e r i u m ，p r e s e n ti nt h eh i g hs u l f a t el e a c h i n gs o l u t i o no fac o m m e