中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂.pdf

第6 0 卷第3 期 20 08 年8 月 有 色金属 N o n f e l - r o u sM e t a l s V 0 1 ．6 0 ．N o ．3 A u g u s t 20 08 中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂 周洪波，曾伟民，李莹，刘晰，邱冠周 中南大学资源加工与生物工程学院，长沙4 1 0 0 8 3 摘 要通过正交试验结果直观分析、因素指标分析和方差分析，研究真空冷冻干燥保藏法中保护剂的作用。结果表明，保 护剂的最佳组合类型为甘油1 2 ％、蔗糖6 ％、脱脂牛奶4 ％、海藻糖1 0 ％。保护剂种类对提高存活率的影响依次为甘油 海藻糖 脱脂牛奶 蔗糖。使用最佳保护剂组合可使冷冻干燥中度嗜热茵的存活率达到8 3 ．7 ％。 关键词冶金技术；中度嗜热菌；冷冻干燥保藏；保护剂；正变试验 中图分类号T F l l l ．3 1 1文献标识码A文章编号1 0 0 1 一0 2 1 1 2 0 0 8 0 3 0 0 8 0 0 4 中度嗜热菌 M o d e r a t et h e r m o p h i l i em i c r o o r g a n ． i s m s 作为一类特殊的微生物类群，在微生物浸出硫 化矿工艺中发挥着重要的作用。应用中度嗜热菌浸 出硫化矿相对中温菌具有反应快、浸出周期短、持续 浸出部分难溶硫化矿如黄铜矿等优点[ 卜3 | 。喜温 硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l u sc a l d u s 作为中度嗜热浸 矿菌的重要一员，在浸矿体系中为硫的代谢、矿物表 面钝化膜的消除、体系低p H 值的维持等发挥着重要 作用【4 j 。然而，该菌具有难纯化、难培养等特点，因 此，系统地开展中度嗜热菌的保藏研究，对促进该菌 的研究和在微生物冶金中的应用有非常积极作用。 目前国内外对中度嗜热菌多采用常规传代保藏 和冰箱低温保藏，容易产生变异失活，甚至死亡【5J 。 冷冻干燥作为当今微生物保藏的一种较好方法[ 6 】6 ， 是否对嗜热茵同样有效，国内外尚未有相关的报道。 这主要是因为嗜热菌独特的生理结构和生长特性， 使得该类菌无法适应冷冻干燥中的各种苛刻条件。 特别是无法承受冷冻时巨大的冷冻压力。导致细胞 膜通透性的改变和代谢损伤【7 1 。因此，选择适宜的 冷冻温度，加入合适的保护剂减少细胞膜在冷冻干 燥中的损伤，是提高菌存活率的关键。 研究了在冷冻干燥前合适的预冻温度，然后以 甘油、蔗糖、脱脂牛奶、海藻糖为保护剂，采用正交试 验设计，优化组合，筛选出冷冻干燥保藏中度嗜热菌 J ．1 菌的最佳保护剂组合，最后通过与常规冷冻方法 收稿日期2 0 0 6 0 8 3 1 基金项目国家自然基金刨新研究群体科学基金资助项目 5 0 3 2 1 4 0 2 ；国家重点基础研究项目 2 0 0 4 C B 6 1 9 2 0 4 作者简介周洪波 1 9 6 9 一 ．男，湖南湘潭市人，教授，博士。主要从 事微生物及生物冶金等方面的研究。 比较验证该保护剂组合在冷冻干燥中的可行性，为 该类菌种保藏存活率的提高提供了新途径。 1实验方法 1 ．1 试验材料 1 ．1 ．1 菌种。喜温硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l u s c a l d u s J ．1 G e n b a n k 登陆号D Q 3 6 4 6 0 1 ，从江西德 兴铜矿某矿坑分离得到。 1 ．1 ．2 培养基。A N H 4 2 S 0 43 ．0 9 ，N a 2 S 0 4 2 。l g ，M g S 0 4 ．7 H 2 00 ．5 9 ，，K 2 H P 0 40 ．0 5 9 。K a 0 ．1 9 ，c a N 0 3 20 ．0 1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m L ，p H 值调至 2 ．0 ，高压灭菌2 0 m i n 。B 单质硫粉高压灭菌 2 0 m i n 。将B 硫粉以1 ．5 ％的量加入到A 培养基中， 作为中度嗜热菌的培养基。 1 ．1 ．3 保护剂系统。预冻试验保护剂甘油5 ％， 1 0 ％，1 2 ％。正交试验保护剂组合甘油 6 ％，1 2 ％， 1 8 ％ ，蔗糖 6 ％，1 2 ％，1 8 ％ ，脱脂奶粉 4 ％，6 ％， 8 ％ ，海藻糖 2 ％，6 ％，1 0 ％ 。 1 ．2 试验过程 1 ．2 ．1 冷冻干燥制备活菌粉剂工艺流程。菌种活 化一液体扩大培养一菌种收集一 保护剂一 细菌悬 液一冷冻干燥一活菌粉。 1 ．2 ．2 菌种的培养和牧集。从新鲜的J ．1 菌株固 体平板上挑取单菌落，接种于含3 0 0 m L 培养基的 5 0 0 m L 的锥形瓶中，于4 5 ℃，1 7 0 r ／m i n 摇床振荡， 活化并扩大培养。培养3 d 后，细菌生长达到稳定 期，取样计数。同时等量分装于5 0 m L 的离心管中， 4 “ C ，1 0 0 0 0 r ／m i n ，离心1 5 m i n 。弃上清，用等量的不 同种类的保护剂重新悬浮菌体，充分混匀，分装于自 制的冻干安培管中。 万方数据 第3 期 周洪波等中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂8 1 1 ．2 ．3 预冻试验。由于国内外应用冷冻干燥法保 藏高温菌的例子很少，而且高温茵的细胞壁很薄，不 宜承受较大的外界压力。所以采用一1 9 6 ℃，一 7 0 ℃，一2 0 ℃三种温度梯度对J 一1 菌进行预冻，以便 得出最佳预冻效果。取9 支冻干安培管，编号1 ～ 9 ，将菌悬液分别装入安培管中。1 ～3 号加入5 ％的 甘油、4 - 6 号加入1 0 ％的甘油、7 ～9 号加入1 5 ％的 甘油作为保护剂。每3 支分别置于液氮 一1 9 6 ℃ 、 冷冻箱 一7 0 ℃ 、冰箱下层 一2 0 ℃ 预冻1 0 h 。 1 ．2 ．4 冷冻干燥。将预冻效果最好的菌样按常规 方法在真空冷冻干燥机中冷冻干燥1 5 h ，得到冻干 粉，安培封口，并于4 ℃保藏。 1 ．2 ．5 存活指标测定【8 】。采用U V ．9 2 0 0 分光光度 计，在6 0 0 n m 处测量J 一1 菌的O D 值 相对细胞生 长量 ，具体操作根据预冻和冷冻干燥有两种。 1 取出预冻后的安培管，置于3 8 ℃水浴锅中 加热、溶解，充分摇匀，待活性恢复。从中分别取出 1 m L 接种于含2 0 m L 培养基的3 个5 0 m L 锥形瓶 中，取一瓶4 ℃下放置作为对照，其余2 瓶4 5 ℃， 1 7 0 r ／m i n 下培养3 d 。测量生长菌和对照菌的O D 值，其O D 差值即为存活指标存活指标 O D 生长茁 一O D 对照茁 1 0 0 。 2 取冷冻干燥后的菌种安培 冻干粉 ，每管加 3 m L 的培养基，恢复活性和相对存活率的测定如 1 所述。 1 ．2 ．6 存活率测定。存活率的验证试验采用血球 计数板计数法测定活茵数。冷冻干燥前用于计数的 活菌为刚培养至稳定期的J - 1 菌，冷冻干燥后用于 计数的菌是冻干粉在3 8 ℃下恢复活性4 h ，再用培养 基稀释到5 0 m L 量之后的J ．1 菌 不经过培养 。 2 试验结果与分析 2 ．1 预冻试验结果 为了提高冷冻干燥的效果，选择最佳预冻温度 显得很重要。针对中度嗜热菌这一类特殊的微生 物，设计试验分析不同预冻温度对保藏效果的影响。 由于该菌在不加任何保护剂的情况下，冷冻干燥后 的存活率很低，所以加入5 ％，1 0 ％，1 5 ％三种浓度 的甘油进行预冻试验。一1 9 6 ℃，一7 0 ℃，一2 0 ℃三 种温度和5 ％，1 0 ％，1 5 ％三种甘油浓度对菌J 一1 预 冻后相对存活率如表1 所示。 由表1 看出，在温度一7 0 ℃、甘油浓度1 0 ％时， J - 1 菌的存活率最高，为1 2 ．7 。而其他组合。则相对 要低的多。所以采用该预冻组合，进行后续的冷冻 干燥试验。 表1 预冻温度和甘油浓度对相对存活率的影响 T a b l e1E f f e c to fp r e - f r e c z e nt e m p e r a t u r ea n d g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o nO ni n d e x 2 ．2 保护剂组合类型对菌种存活率的影响 选择L n g 3 4 正交表，对甘油、蔗糖、脱脂牛奶、 海藻糖四种保护剂的组合开展冷冻干燥试验，将冷 冻干燥后菌的相对存活率取3 次试验的平均值，填 入到正交试验表的相应位置，对数据进行分析，如表 2 所示。 表2L n 9 3 4 正交表与试验结果 T a b l e2 岫 3 4 o r t h o g o n a le x p e r i m e n tt a b l e ‘ a n de x p e r i m e n t a Ir e s u l t s 2 ．2 ．1 直观分析。从表2 的结果中均值K 可以看 出，甘油1 2 ％ A 2 、蔗糖6 ％ 马 、脱脂牛奶4 ％ C 1 、海藻糖1 0 ％ I h 组合为A 2 8 1 C 1 D 3 为J 一1 菌 冷冻干燥的最佳保护剂组合。 2 ．2 ．2 因素指标分析。 1 甘油、蔗糖、脱脂牛奶、海藻糖4 种因素对菌 株J l 冷冻干燥后指标有不同影响，见图1 。由表2 和图1 可以看出，甘油为1 2 ％时，J - 1 茵存活率要明 显高于甘油浓度为69 6 和1 8 ％时，指标达到 1 6 ．7 0 2 。蔗糖6 ％，1 2 ％和1 8 ％三个水平中6 ％更 合适。脱脂牛奶浓度为6 ％时，菌存活率最低，4 ％ 时的指标相对8 ％时要高。J ．1 菌存活率随海藻糖 浓度的提高而提高，1 0 ％时最佳。 2 极差R 反映各因素作用的大小。极差大的 意味着该因素对测定指标的影响大，反之影响小。 万方数据 有色金属 第6 0 卷 根据表2 中极差R 的大小，可以看出各因素的主次 关系为甘油 海藻糖 脱脂牛奶 蔗糖。 1 6 鋈t t 1 2 6 1 21 861 21 8 468 2 61 0 保护枘浓度，％ 图1因素与指标关系 F i g ．1R e l a t i o n s h i po ff a c t o r sa n di n d e x 2 ．2 ．3 方差分析。对表2 中各因素进行方差分析， 计算结果表明甘油、海藻糖对菌株j - 1 冷冻干燥存 活率有非常显著的影响，如表3 所示。F 01 0 F F 0 ．0 5 时，对应因‘素为显著因素，记为* ，F F o ．0 5 时，对应 因素为高度显著因素，记为* * 。 方差分析结果表明，甘油和海藻糖的F 值明显大 于临界值F 0 ．1 0 ，说明甘油和海藻糖对菌株j - 1 冷冻干 燥存活率的影响高度显著。脱脂牛奶的F 值介于 F 0 ．1 0 和F 0 ．0 5 之间，说明脱脂牛奶对该菌冷冻干燥存活 率影响显著。蔗糖的F 值小于临界值F o ．0 5 ，说明蔗 糖对该菌冷冻干燥存活率的影响不显著。 表3 冷冻保藏保护剂试验结果方差分析表 T a b l e3V a r i a n c ea n a l y s i so fe x p e r i m e n t a lr e s u l t so nc r y o p r o t e c t a n t su s e di nf r e e z e - d r yp r e s e r v a t i o n 2 ．3 最优化组合结果的检验 采用正交法筛选出的保护剂的最优组合为 A 2 B lC l D 3 ，郎甘油1 2 ％ A 2 、蔗糖6 ％ B 1 、脱脂牛 奶4 ％’ c 1 、海藻糖1 0 ％ D 3 。为验证该组合的可 行性，采用A 2 8 1c 1 D 3 保护剂组合与空白样和只加 1 0 ％甘油作为保护剂的样品 传统的冷冻保藏中以 1 0 ％甘油为保护剂 进行冷冻干燥，用血球计数板计 数法测定冷冻干燥前后活菌数，计算其存活率。结果 如表4 所示。 表4 三种试验条件下的存活率测定 T a b l e4 L i v a b i h t yd e t e r m i n a t i o nu n d e rt h r e e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s 从表4 可以看出，以A 2 B lC lD 3 组合的保护剂用 于J ．1 菌的冷冻干燥，其存活率达8 3 ．7 ％，明显高于 以1 0 ％甘油作为单一保护剂 3 7 ．2 ％ 和不加任何 保护剂的空白实验 2 ．1 ％ 的存活率。 3讨论 冷冻干燥可以从微生物细胞中除去大部分水 分，使细胞的生理活动降至最低水平，从而达到长期 保藏的目的。然而，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和 干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡 及某些酶蛋白分子的钝化旧J 。因此为了提高微生 物真空冷冻干燥后细胞的成活率及稳定性，常在冷 冻时加入各种保护剂来保护活细胞【1 0 1 。保护剂的 使用不仅能够通过使悬浮微生物冷冻时形成完全或 几乎完全玻璃化态，消除冰晶的机械应力和冰晶脱 水可能导致的膜相转变，达到保护的目的，而且干燥 时在水分子脱去后，能取代水分子的作用，维持生物 分子的结构和功能不受损伤[ 1 1 - 1 2 I 。冷冻干燥常用 的保护剂有甘油、脱脂乳、海藻糖、蔗糖等L l3 J ，但是 不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的。单 一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以抗冻 保护剂一般是按～定比例混合使用【1 4 I 。 通过正交试验，得出中度嗜热菌J ．1 菌冷冻干 燥的最佳保护剂组合为A 2 B ，C 1 D 3 甘油1 2 ％、蔗糖 6 ％、脱脂牛奶4 ％、海藻糖l O ％ 。并通过验证试验， 中度嗜热菌j - 1 菌冷冻干燥后的存活率达8 3 ．7 ％，相 比单一保护剂 3 7 。2 ％ 和不加保护剂 2 。1 ％ 时的存 活率分别高出2 倍多和4 0 倍。这说明，应用该保护 剂组合进行中度嗜热菌的冷冻干燥是可行的，为保证 冷冻干燥后保藏效果提高了可能。 万方数据 第3 期周洪渡等中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂8 3 参考文献 [ 1 ] R i v e r a ．S a n t i l l a nR ，B a l l e s t e rP e r e zE ，B l a z q u e zA ．B i o l e a c h i n go fac o p p e rs u l p h i d ef l o t a t i o nc o n c e n t r a t eu s i n gm e s o p h i l i ca n d t h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m 【C ] ／／B i o h y d r o m e t a l l u r g ya n dt h eE n v i r o n m e n tT o w a r dt h eM i n i n go ft h e2 1 s tC e n t u r y ．A m s t e r d a m E l s e v i e r ，1 9 9 9 1 4 9 1 5 8 ． [ 2 ] S a n d s t o r mA k e ，P e t e r s s o nS t i g ．B i o l e a e h i n go fac o m p l e xs u l p h i d eo r ew i t hm o d e r a t et h e r m o p h i l i ea n de x t r e m et h e r m o p h i l i cm i ． c r o o r g a n i s m [ J ] ．H y d r o m e t a l l u r g y ，1 9 9 7 ，4 6 1 ／2 1 8 1 1 9 0 ． [ 3 ] G o l n 凹E ，B a l l e s t e rA ，G o n z a l e zF ，e ta 1 ．L e a c h i n gc a p a c i t yo fan e we x t r e m e l yt h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m ，S u l f o l o b u sr i v o t i n e ． t i [ J ] ．H y d r o m e t a l l u r g y ，1 9 9 9 ，5 2 3 3 4 9 3 6 6 ． [ 4 ] D o p s o nM a r k ，L i n d s t r o mEB o r i c ．P o t e n t i a lr o l eo fT h i o b a c i l l u se a l d u si na r s e n o p y r i t eb i o l e a e h i n g [ J ] ．A p p l i e da n dE n v i r o n m e n ． t a lM i c r o b i o l o g y ，1 9 9 9 ，6 5 1 3 6 4 0 ． [ 5 ] 施巧琴。吴松刚．工业微生物育种学[ M ] ．北京科学出版社，2 0 0 3 6 8 ． [ 6 ] 李华，骆艳娥，刘延琳．真空冷冻干燥微生物的研究进展[ J ] ．微生物通报，2 0 0 2 ，2 9 3 7 8 8 0 ． [ 7 ] M a r t hEH ．L o wT e m p e r a t u r eP r e s e r v a t i o no fF o o d sa n dL i v i n gM a t e r i a l [ M ] ．N e wY o r k M e r c e lD e k k e r ，1 9 7 3 1 2 8 ． 【8 ] 郑从义．嗜盐细菌冷冻干燥保护剂的正交法优化[ J ] ．武行大学学报，1 9 9 4 ，4 5 1 1 0 9 1 1 4 ． [ 9 ] 田洪涛，贾英民，马雯，等．嗜热链球菌真空冷冻干燥前后发酵活力变化[ J ] ，中国乳品工业，2 0 0 1 ，1 7 6 1 7 1 9 ． - 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d r yp r e s e r v a t i o n a r ei n v e s t i g a t e db yd i r e c t v i e w i n ga n a l y s i s ，f a c tt a r g e ta n a l y s i sa n dv a r i a n c ea n a l y s i so ft h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n tr e s u l t s ．T h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eo p t i m a lc o m b i n a t i o no ft h ef r e e d r yc r y o p r o t e c t a n t sc o n s i s t so f 1 2 ％g l y c e r o l ，6 ％s u c r o s e ，6 ％d e g r e a s e dm i l ka n d1 0 ％t r e h a l o s e ．T h ei m p o r t a n c eo fc r y o p r o t e c t a n t st o b a c t e r i as u r v i v a lr a t ed e c r e a s e sa sf o l l o w g l y c e r o l ，t r e h a l o s e ，d e g r e a s e dm i l k ，a n dS L I C I O S e ．T h es u r v i v a lr a t eo f t h em o d e r a t et h e r m o p h i l e si s8 3 ．7 ％b yu s i n gt h eo p t i m a lc o m b i n a t i o no fc r y o p r o t e c t a n t s ． K e y w o r d s m e t a l l u r g i c a lt e c h n o l o g y ； m o r d e r a t e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a ； f r e e z e d r yp r e s e r v a t i o n ； c r y o p r o t e c t a n t s ；o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 万方数据