氧化铁硫杆菌的亚硝酸化学诱变及对黄铜矿的生物浸出.pdf

2 0 有色金属 选矿部分2 0 0 4 年第6 期 氧化铁硫杆菌的亚硝酸化学诱变 及对黄铜矿的生物浸出 徐晓军，1 ，2宫磊2 ，赵丙辰1 ，孟云生2 1 ．青岛理工大学环境与市政工程学院，青岛2 6 6 0 3 3 ；2 ．昆明理工大学环境科学与工程学院，昆明6 5 0 0 9 3 摘 要报道了亚硝酸化学诱变原理、对一株优势氧化铁硫杆菌T ．f 菌的诱变作用和诱变T ．f 菌对低品位黄铜 矿的生物浸出研究结果。结果表明，T ．f 菌亚硝酸化学诱变后，诱变T ．f 菌和原始T ．f 菌相比，活性提高了4 1 ．0 3 ％， 对黄铜矿的浸出率提高了1 3 ．3 ％，达到浸出终点的时间比原始菌减少了5 ～l O d 。诱变后的T ．f 菌对黄铜矿比原始 T ．f 菌具有更好的浸出效果。 关键词氧化铁硫杆菌；亚硝酸；化学诱变；生物浸出；黄铜矿 中图分类号T D 9 5 2 ．1 ；T D 9 2 5 ．5文献标识码A文章编号1 6 7 1 9 4 9 2 2 0 0 4 0 6 ～0 0 2 0 0 5 生物湿法冶金是以微生物或其代谢产物溶浸矿 石中有用金属的一种新工艺，现已成为生物科学和 矿冶工程研究的焦点。其最大特点是适用于传统冶 金方法难以处理的矿石，并具有工艺简单、易操作、 投资少、能耗小、成本低和对环境友好等优点，已成 为资源加工的主要技术之一uJ 。虽然用嗜热嗜酸 高温菌氧化浸出硫化矿在国内外已得到了研究和应 用，但由于嗜热嗜酸菌自身和工艺等方面的问题，目 前氧化铁硫杆菌仍是一种最重要的、已被广泛研究 和应用的生物浸出细菌1 2 , 3 j 。现在所采用的氧化铁 硫杆菌菌种大都是从自然界分离驯化获得的，存在 浸矿周期长、生长速度慢、氧化能力弱、适应力差等 问题，这影响了细菌浸矿的进一步应用和发展，因此 如何对氧化铁硫杆菌菌种进行改良和育种已成为目 前亟待解决的问题。 由于菌体成长时的培养条件直接影响生物浸出 效果和作用机理，因此，近年来生物湿法冶金方面的 研究主要集中在提高或强化细菌活性及选育新型菌 种、研究不同条件细菌浸矿的作用机理及最佳条件， 对浸矿细菌育种方面的研究报道还较少见。浸矿细 菌的育种方法主要有驯化育种、物理和化学诱变育 种以及基因工程育种三种l2 | 。由于驯化育种的耗 时和低效性，以及基因工程的复杂性和处于技术开 发初始阶段，因此诱变育种手段便成为目前对浸矿 菌种进行性能改良的首选方法，有可能获得技术突 破。由于浸矿细菌发现较晚，加上这类细菌生长速 度慢、不易获得足够的细胞材料对其进行生化及遗 传理论研究，国内外在诱变育种方面的研究仍不充 分。 黄铜矿 C u F e S 2 属于原生硫化铜矿物，是最难 溶浸的铜矿物。我国低品位铜矿资源较为丰富，适 合生物浸出。例如云南省蕴藏大量的低品位铜矿资 源，易门矿务局大红山铜矿就有2 9 ．1 万t 金属量， 其它如景谷、滨中、保山、腾冲还有近6 0 0 万t 的金 属量，其中含有大量的原生铜矿l4 | 。本文试图通过 对一株优势氧化铁硫杆菌T ．f 菌采用亚硝酸诱变 提高其浸矿特性，以提高氧化铁硫杆菌T ．f 菌浸出 黄铜矿的效果，为细菌浸铜技术更好地应用于工业 生产提供更好的基础，同时为其它浸矿细菌的改良 和优化提供新的方法。 1 细菌亚硝酸化学诱变育种的遗传学 原理及机理 1 ．1 亚硝酸化学诱变育种的遗传学原理 细菌体内的每一步生化反应过程的正常运转都 要依赖于生物体内高效的生物催化剂一酶的作用， 而每种催化酶又是由生物体的特定的基因来编码 的，基因可能发生变异，既可以是基因突变引起的又 可以通过体内重组或附加体等外源物质的整合引起 D N A 改变，从而创造新基因引起体内生化途径的改 变，产生新型菌株。 基因突变是诱变育种的理论基础，基因突变的 原因是多种多样的，它可以是自发的或诱发的，同 时，诱变又可以分为点突变和畸变。基因突变的具 体类型可概括如下倒5 1 碱基的置换对于微生物体内的遗传物质 收稿日期2 0 0 4 0 7 一0 1 作者简介徐晓军 1 9 6 0 ～ ，男，浙江杭州人，教授，博士生导师，博士，副院长。 万方数据 2 0 0 4 年第6 期徐晓军等氧化铁硫杆菌的亚硝酸化学诱变及对黄铜矿的生物浸出 2 1 D N A 来说，碱基的置换属于一种微小的损伤，一般 称为点突变，它只涉及一对碱基被另一对碱基所置 换。置换又可分为两个亚类一类为转换，即D N A 链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一 个嘧啶所置换；另一类叫颠换，即一个嘌呤被一个嘧 啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。 2 移码突变是指诱变剂使D N A 分子中的一个 或少数几个核苷酸的添加或缺失，从而使该部位后面 的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。 3 染色体畸变染色体结构上的变化可分为染 色体内畸变和染色体问畸变两类。染色体内畸变只 涉及一条染色体上的变化，例如发生染色体的部分 缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；如 发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变， 但数目却不改变。其中倒位是指断裂下来的一段染 色体旋转1 8 0 。后，重新插入到原来染色体的位置 上，从而使其基因顺序与其他的基因顺序方向相反； 易位则是指断裂下来的一小段再顺向或逆向地插入 到同一条染色体的其他部位。至于染色体间的畸 变，则是指非同源染色体间易位。染色体畸变属于 一种D N A 大损伤。 凡能够提高突变率的任何理化因子，都可称为 诱变剂。诱变剂的种类较多，作用方式也不同，即使 是同一种诱变剂也经常有几种作用方式。 1 ．2 细菌亚硝酸化学诱变育种的作用机理 亚硝酸对细菌的作用主要是直接与核酸的碱基 发生化学反应，它可与一个或几个核苷酸发生化学 反应，从而引起D N A 复制时碱基配对的转换，并进 一步使微生物变异。亚硝酸对D N A 碱基的作用主 要是氧化脱氨腺嘌呤 A 经氧化脱氨后成为次黄 嘌呤 H ，胞嘧啶 C 经氧化脱氨后变成尿嘧啶 U ，具体解释如图1 和图2 。 卜_C≤。一HN02卜_≮H卜∥c＼冬AC NC T CCC ／＼．’ ∥＼∥＼ r 7 、 H 一，H N HX 一并 一 ＼／＼／ u u ＼，1 由 O 由0U 、 图1 亚硝酸作用引起G C - A T 转换[ 6 ] F i g1 T h eG C - “ A Tc o n v e r s i o nc a u s e db yt h ea c t i o no fn i t r o u sa c i d 【6 J ∥＼／鼎∥N ＼／品 H CC CH - CC C ＼ ∥≮H N 0 2 ＼ ∥≮ ／卜C ＼∥百}／卜C ＼广 恃CN 兰C 腺嘌呤 A 、次黄嘌呤 H 、 H C 铲，绺 ①A 经氧化脱氨后变成H ；②H 因其6 位为酮基，故只与6 位为氨基的胞嘧啶C 配对； ③D N A 第5 5 ．次配对，实现了转换。同理，可解释图5 中G e A T 的转换。 图2 刖0 2 作用于A 引起A T ．一 ℃转换[ 6 ] F i g2T h eA T G Cc o n v e r s i o n si nt h eAc a u s e db yt h ea c t i o no fn i t r o u sa c i d [ 6 ] 万方数据 2 2 有色金属 选矿部分2 0 0 4 年第6 期 2 试验材料及方法 2 ．1 菌种与矿样 本实验所用菌种采于云南某铜矿的酸性矿坑 水，属氧化铁硫杆菌，具有良好的生物氧化活性，经 挑选、分离和耐铜离子培养后，选取优势菌为原始驯 化菌种，称为T ．f 菌。 实验中所用黄铜矿 C u F e S 2 和黄铁矿 F e 岛 取 自于云南某大型铜矿选矿厂，经多次手选，在双目镜 下精心挑选出黄铜矿和黄铁矿纯矿物颗粒。经化学 分析得黄铜矿中铜、铁、硫含量分别为3 3 ．3 1 ％、 2 8 ．6 5 ％、3 2 ．4 4 ％，黄铜矿纯度大于9 4 ％；黄铁矿中 铁、硫含量分别为4 3 ．6 8 ％和5 0 ．3 6 ％，黄铁矿纯度 大于9 4 ％。石英砂取自云南省彝良优质石英砂矿， S i Q 纯度大于9 9 ．6 ％。试验所用的低品位矿样为 ～7 4 肚m 人工混合矿样，其中黄铜矿黄铁矿石英 为1 l 1 8 。 2 ．2 实验及分析方法 i 菌种的培养本试验研究中所用的培养基为 9 K 培养基【7 j ，菌种的培养是将菌液和培养基装入 2 0 0 m l 的三角瓶中，置于振荡频率为1 2 0 r ／m i n 的 3 0 ℃恒温水浴振荡器中进行的。试验中细菌染色采 用革兰氏细菌染色法；灭菌采用干热灭菌法。 2 细菌的诱变实验由于亚硝酸很不稳定，易 水解为水及硝酸酐，硝酸酐继续分解放出N O 和 N C h 。所以采用在临用前将亚硝酸钠在p H 4 ．5 的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法。 选用原始菌中活性较高、生命力较强的细菌，接 种到固体9 K 培养基上，恒温3 0 ℃培养，待其长出菌 落后，挑出单菌落分别将其接入装有1 0 m l9 K 培养 基的小试管中，恒温培养至细菌生长达到对数期， 对菌液进行离心，得到无铁细胞悬液，将悬液用生理 盐水进行稀释，用显微镜进行计数，调整细胞浓度约 为1 0 8 个／m l ，将菌体重新悬浮于p H 7 - - - - 4 ．5 的缓冲 液中，然后加不同量的N a N 0 2 进行诱变试验，诱变 处理6 m i n 后，用稀释法终止反应。 3 细菌活性的测定菌种活性的测定采用亚铁 离子氧化速率法。将菌液恒温3 0 ℃充气培养2 h ，测 菌液中F e 2 浓度。细菌活性可按下式计算A C o C f ／2 ，其中A 为所测的细菌活性 g ／L ．h ， C o 为F d 初始浓度，C f 为F d 最终浓度。 4 浸矿试验本试验采用2 0 0 m l 的三角瓶，接 入5 0 m l 、p H 2 左右的无铁9 K 培养基，加入2 ．5 9 人工混合矿样，分别接入5 m l 耐铜离子的原始T ．f 菌或亚硝酸诱变后的T ．f 菌菌种，放置于频率为 1 2 0 r ／m i n 、温度为3 0 ℃的恒温振荡器上进行实验， 每天测一次溶液p H 值、细菌浓度，每五天测一次溶 液C u 2 浓度。 5 分析方法细菌计数采用显微镜直接计数 法1 7 1 ；亚铁离子浓度用邻菲罗林分光光度法恻；测 铜离子浓度用铜试剂法[ 9 J 9 。所用试剂均为分析纯。 3 试验结果与讨论 3 ．1 亚硝酸诱变对T ．f 菌的影响 N a N 0 2 诱变处理6 m i n 后，按不同的稀释度进 行涂布，7 d 后对所形成的菌落进行计数。挑选出生 长比较健壮的菌落于9 K 液体培养基中振荡培养 4 8 h 后测定其活性，不同剂量的亚硝酸对T ．f 菌的 致死率和诱变后T ．f 菌的活性见图3 和图4 。 图3 亚硝酸浓度对细菌致死率的影响 F i g3 T h ei n f l u e n c eo fn i t r o u sa c i dc o n c e n t r a t i o n s o nt h eb a c t e r i u mT ．ff a t a l i t yr a t e ， 一 一 3 ．＼ o 氲 翅 蝗 亚硝酸浓度 t o o l L 。 图4 亚硝酸浓度对T ．f 细菌活性的影响 F i g4 T h ei n f l u e n c eo fn i t r o u sa c i d c o n c e n t r a t i o n so nt h eb a c t e r i u mT ．fa c t i v i t y 由图3 和图4 可以看出，亚硝酸在低剂量时对 T ．f 菌的致死率已经很高，当浓度为0 ．O l r m l ／L 时，细 菌的致死率达到了9 0 ％左右；随着剂量的增加，亚硝 酸对细菌的致死作用也逐渐加强，当浓度达到0 ．0 3 万方数据 2 0 0 4 年第6 期徐晓军等氧化铁硫杆菌的亚硝酸化学诱变及对黄铜矿的生物浸出 2 3 m o l ／L 时，细菌几乎全部死亡。亚硝酸对T ．f 菌有一 定程度的诱变性，不同的亚硝酸剂量，对诱变T ．f 菌 的活性影响也有所不同，当亚硝酸浓度在0 ．0 1 m o l ／L 以下时，诱变剂对细菌活性的提高并不显著，细菌的 潘眭提高了不到1 0 ％，但当亚硝酸浓度为0 ．0 3 m o l ／L 时，处理所得诱变T ．f 菌的活性显著提高，活性提高 达到4 0 ％以上，而随着亚硝酸浓度的继续增加，对细 菌活性的提高呈下降趋势，故可推断亚硝酸浓度为 0 ．0 3 m o l ／L 时可以有效地用于T ．f 菌的诱变，使其具 有更高的氧化F d 的活性。 3 ．2 诱变菌对黄铜矿的浸出 以原始T ．f 菌为对照，采用经过亚硝酸诱变后 筛选出的活性最好的诱变T ．f 菌来进行浸矿试验， 试验过程中菌体的生长情况如图5 。诱变菌对于黄 铜矿的浸出效果如图6 。 2 ．T ．f 菌菌种经亚硝酸诱变后，浸矿性能有较 明显的提高，诱变菌种对黄铜矿的浸出率比原始菌 提高了1 3 ％以上。同时该菌具有较高的浸出速率， 到达浸出终点的时间比原始菌提高了5 ～1 0 d ，更加 适合作为黄铜矿生物浸出的浸出菌种。 3 ．亚硝酸引起微生物变异作用是由于直接与核 酸的碱基发生化学反应，从而引起D N A 氧化脱氨 和复制时碱基配对的转换，从而引起细菌体内D N A 的变形而引起变异。 图6 不同T ．f 菌对低品位黄铜矿的浸出效果 F i g6B i o l e a c h i n ge f f e c t so fI o w g r a d ec o p p e r o r ew i t ht h em u t a t e da n do r i g i n a lb a c t e r i u mT ．f 1 一原始菌种；2 一亚硝酸诱变菌 1 5 ’时赢2 0 2 53 0 [ 1 ] 时阔／d “o 图5T ．f 诱变菌和原始菌的生长曲线 F i g5 T h eg r o w t hC H I V E So ft h em u t a t e d 『2 ] a n do r i g i n Mb a c t e r i u mT ．f 1 一原始菌种；2 一亚硝酸诱变菌 由图5 和6 可以看出，经过亚硝酸诱变后的菌 [ 3 ] 种，在浸出黄铜矿过程中的生长比原始菌有所加快， 当培养时间为2 0 d 时，诱变菌菌数就达到了1 0 8 个／ 。1 4 』 r n l 以上，超过了原始菌菌数一个数量级。对铜离子 的最终浸出率相对于原始菌分别提高了1 3 ．3 ％，浸 ⋯ 出时间也缩短了5 ～1 0 d 。可以推断，亚硝酸作用该 ⋯ 菌种后，引起了较大程度的变异，使T ．f 菌浸出铜矿 k ] 的性能有较明显的提高。 4结论 H 1 1 ．亚硝酸能够引起浸矿细菌T ．f 菌菌种产生明 [ 8 ] 显的变异，提高了T ．f 菌的活性。诱变T ．f 菌的活 性比原始T ．f 菌提高了4 0 ％以上，对浸矿细菌的生 L 刈 长起到了一定的促进作用。 参考文献 王淀佐．生物工程与矿物提取技术[ A ] ．1 9 9 8 中国科学 技术前沿 中国工程院版 [ M ] ．北京高等教育出版 社，1 9 9 9 ，1 5 5 1 7 4 ． 张在海，王淀佐，胡岳华，等．硫化矿细菌浸出的菌种选 育研究进展[ J ] ．有色金属 选矿部分 ，2 0 0 1 ， 5 3 5 4 0 ． 邹平，杨家明，周兴龙，等．嗜热嗜酸菌生物浸出低品位 硫化铜矿[ J ] ．有色金属 季刊 ，2 0 0 3 ，5 5 2 2 1 2 4 ． 周廷熙，徐晓军编著．有色金属矿产资源的开发及加工 技术 选矿部分 [ M ] ．昆明云南省科技出版社，2 0 0 0 ， 9 7 ～1 0 0 ． 周德庆．微生物学教程[ M ] ．北京高等教育出版社， 1 9 9 3 ．6 8 7 5 ． 微生物诱变育种编写组．微生物诱变育种[ M ] ．北京 科学出版社，1 9 7 3 ，2 5 ～3 2 ． 周群英．高廷耀编著。环境工程微生物学[ M ] ．北京高 等教育娃；版社，2 0 0 0 第2 版 ，1 2 1 ，2 9 2 3 1 8 ． 陈国珍．亚硝酸一可见分光光度法[ M ] ．北京原子能 出版社，1 9 8 7 ，6 0 6 5 ． 成都科技大学，浙江大学分析化学教研室．分析化学实 验[ M ] ．北京高等教育出版社，1 9 8 9 ，5 3 5 8 ． 9 5 8 5 7 5 8 7 ＆ 乏暑I籁灰餐逝叛粗导 万方数据 ．2 4 ．有色金属 选矿部分 加0 4 年第6 期 C H E M I C A L M U T A T I O NO FN n R O U SA C I DO N B A C T E R I U MT ．fA N DC H A I 【．C I P Y R I T EB I O L E A C H I N G X UX i a o J “祀1 ，一，G o n gL g i 2 , Z H A OB i n g c h e n l ，M E N Gg u n s h e n 9 2 1 ．Q i n g d a oT e c h n o l o g i c a lU n i v e r s i t y ，S c h o o lo f E n v i r o n m e n t a la n d M u n i c i p a lE n g i n e e r i n g ，Q i n g d a o2 6 6 0 3 3 ，C h i n a ；2 ．K u n m i n gU n i v e r s i t yo f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ，I n s t i t u t eo fE n v i r o n m e n t a lS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g ，K u n m i n g6 5 0 0 9 3 ，C h i n a T h ec h e m i c a l l ym u t a t i n gp r i n c i p l eo fn i t r o u sa c i da n di t sm u t a t i n go p e r a t i o n so no n es u p e r i o rb a c t e r i no ft h e t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，c a l l e da sb a c t e r i u mT ．f ，a n dt h eb i o l c a c h i n gr e s u l t so ft h el o wg r a d ec h a l c o p y r i t e w e r er e p o r t e di nt h i sp a p e r ．T h er e s u l t sh a v eb e e ns h o w nt h a tt h en i t r o u sa c i dC a ne f f e c t i v e l yp r o d u c et h ec h e m i e a l l ym u t a t i n ga c t i o no nb a c t e r i u mT ．ft oi m p r o v ei t sb i o a c t i v i t ya n dt or e f o r mi t sb i o l e a c h i n gp r o p e r t i e so n c o p p e rS U I r i d e s ．A f t e rb a c t e r i u mT ．fm u t a t e db yn i t r o u sa c i d ，t h eb i o a c t i v i t yo ft h eb a c t e r i u mT ．fa n di t sb i o l e a c h i n gr a t eo nc h a l c o p y r i tw e r er e s p e c t i v e l yi m p r o v e db y4 1 ．0 3 ％a n d1 3 ．3 ％r e s p e c t i v e l y ，a n dt h eb i o l e a c h i n gt i m eo ft h el o wg r a d ec h a l c o p y r i t ew a sr e d u c e db y5 - - 1 0d a y s ．T h e s er e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h e b a c 。 t e r i u mT ．fm u t a t e dc h e m i c a l l yb yn i t r o u sa c i dc a nb e t t e rb i o l e a c hc h a l c o p y r i t et h a nt h eo r i g i n a lb a c t e r i u mT ． f K E Y Ⅵ幻崛田I S t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s T ．f ；n i t r o u sa c i d ；c h e m i c a lm u t a t i o n ；b i o l e a c h i n g ；c h a l c o p y r l t e 仝全．舍今舍全含舍金巴舍S 舍舍舍舍舍仓 仝0 舍仓舍岔金芒金三仪合{ 岔芒詹专舍岔影N 一全詹影≈％吧全纠№信影N 绾吧全％心骨■“％呜全％乜 上接第2 8 页 R E S E A R C HO NT H E0 0 1 M P ] 刚既Ⅱ￡N S l V EU ⅡL I Z f 钔r I O NO F M A G N E T I CI R O NO R E Ⅵ唧L 1 0 WS U L I 哪之0 0 N T E N T 撇。渤。一s h e n 9 1 ，J I AZ e n g l i a n 9 1 ，S U NC h a n g q u a n 2 ，g a n g J i a n l ，W a n g X u n y a n l 1 ．L a i z h o uJ i n c a n gI r o nC o m p a n yL i m i t e d ，L a i z h o uS h a n d o n g2 6 1 4 0 0 ，C h i n a ； 2 ．Q i n g d a oU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ，Q i n g d a oS h a n d o n g2 6 6 5 2 0 ，C h i n a M a g n e t i cI r o no r ew i t hl i t t l es u l f u ro f t e nc o n t a i n ss u l f u ro fl O W g r a d ec o n t e n t ．I ft h es u l f u rh a s n ’tb e e n r e c y c l e dc o m p r e h e n s i v e l y ，t h eq u a l i t yo ft h ep r o d u c tw i l lb ea f f e c t e d ，a n dS Ot h ee c o l o g i c a le n v i r o n m e n t ．T h e r e f o r e ，f l o t a t i o n m a g n e t i cs e p a r a t i o nm e t h o dc a nb eu s e dt or e c y c l ei t ．H e n c e ，t h eq u a l i f i e dc o n c e n t r a t ec a nb e a t t a i n e d ．o fw h i c hF ei S6 7 ．8 8 ％w i t hl o w g r a d es u l f u r0 ．1 8 ％，a n dt h es u l f u rc o n c e n t r a t ei su po f3 5 ．0 4 ％． S ot h a tg o o de c o n o m i cp e r f o r m a n c ec a nb ea c q u i r e d ． K E Y W O R D S m a g n e t i ci r o no r ew i t h1 0 ws u l f u rc o n t e n t ；c o m p r e h e n s i v e u t i l i z a t i o n 万方数据