耐高矿化度浸矿菌的驯化及浸铀效果.pdf

有色金属 冶炼部分 2 0 0 5 年5 期 4 3 耐高矿化度浸矿菌的驯化及浸铀效果 刘艳1 ，刘亚洁2 ，陈功新2 ，郑志宏2 ，李林2 1 ．中国石化胜利油田有限公司技术监测中心，山东东营2 5 7 0 0 0 ； 2 ．东华理工学院土木与环境工程系，江西省抚州市3 4 4 0 0 0 摘要从7 2 1 铀矿石样中分离出的一株氧化亚铁钩端螺旋菌 L e p t o s p i r i l l u m sf e r r o o x i d a n s 与氧化亚铁硫 杆菌 T h i o b a c i U u sf e r r o o x i d a a s 的混合菌株，经不同条件的驯化及紫外线诱变处理后，可在高矿化度 M 5 0 9 ／L 、低p H p H 1 ．4 的铀矿石酸化液中良好生长。实验室槽浸实验表明，这一混合菌株对低p H 、 高矿化度的浸出体系具有良好的适应性，仅用7 天时间，渣计浸出率达9 0 ．0 6 ％，浸出过程中未出现铁损 失。 关键词矿化度；诱变；驯化；氧化亚铁钩端螺旋菌；氧化亚铁硫杆菌 中图分类号T F 8 8 。Q 9 3 3文献标识码A文章编号1 0 0 7 7 5 4 5 2 0 0 5 0 5 0 0 4 3 一0 4 D o m e s t i c a t i o na n dE f f e c to fU r a n i u mB i o l e a c h i n g w i t haM i x e dS t r a i nT o l e r a t e dH i g hM i n e r a l i z a t i o n L I UY a n l ，L I UY a ．j i e 2 ，C H E N GG o n g ．x i n 2 ，Z H E N GZ h i h o n 9 2 ，L IL i n 2 1 ．T e c h n o l o g i cE x a m i n a t i o nC e n t e ro f S h e n g hO i lF i e l d ，S I N O P E C 。D o n g y i n g2 5 7 0 0 0 ，C h i n a ； 2 ．D e p a r t m e n to fC i v i la n dE n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n g ，E a s tC h i n aI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y ，F u * h o u 。J i a n g x i3 4 4 0 0 0 ，C h i n a A b s t r a c t Am i x e ds t r a i no fT h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sa n dL e p t o s p i r i l l u m sf e r r o o x i d a n sa r es e p a r a t e da n dd o m e s t i c a t e df r o m7 2 1u r a n i u mo r e ．M t e rm u t a g e n i z e ds e l e c t i o nw i t hu l t r a v i o l e t ，i t sa d a p t e dp Hd e c r e a s e sf r o m2 ．0t o 1 ．4 ，a n di t st o l e r a n c eo fs a l i n i t yi su pt o5 2 ．3g ／L ．T h el a b o r a t o r yl e a c h i n gt e s ti n d i c a t e st h em i x e ds t r a i nh a sa w e l la d a p t a b i l i t yt oal e a c h i n g s y s t e mw i t hl o wp Ha n dh i g hs a l i n i t y ．T h el e a c h i n gr a t er e a c h e s9 0 ．0 6 ％w i t hn o i r o nl o s i n gd u r i n gt h el e a c h i n gp r o c e s so n l yi n7d a y s ． K e y w o r d s S a l i n i t y ；M u t a g e n i z e ；D o m e s t i c a t i o n ；L e p t o s p i r i U u m sf e r r o o x i d a n s ；T h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s 在生物浸出初期，体系的矿化度很高 一般可高 达5 0 9 ／L 以上 ，为了避免铁损失，p H 亦较低 p H 1 ．6 。未经专门驯化的浸矿菌很难适应这种体系， 氧化作用不明显，待漫矿菌适应了这种矿石体系后， 金属浸出高峰已基本过去。因此，选育在较低p H 条件下耐受高矿化度的具有强氧化能力的浸矿菌对 提高浸矿效率和缩短浸矿周期具有重要的经济意 义[ 1 | 。 1实验材料与方法 1 ．1 实验材料 1 ．1 ．1 菌株 自7 2 1 矿沙洲坝矿区矿石样富集分离得到的最 适p H 2 ．0 ～2 ．5 、最适温度3 0 ～3 5 ℃氧化亚铁钩 端螺旋菌 L ．F 与氧化亚铁硫杆菌 T ．F 的混合 菌株0 0 3 5 。 1 ．1 ．2 培养基 基金项目江西省教育厅科技项目 赣财教2 0 0 3 9 7 号 和东华理工学院院长开发基金资助项目 2 0 0 2 一l l 号 作者简介刘艳 1 9 8 0 一 ，女，甘肃兰州人，硕士研究生 万方数据 4 4 有色金属 冶炼部分 2 0 0 5 年5 期 1 9 K 培养基。A 3 9 ／L N H 4 2 S 0 4 、0 ．1 9 ／L K C l 、0 ．5 9 ／LK 2 H P 0 4 、0 ．5 9 ／LM g S 0 4 。7 t - 1 2 0 、 0 ．0 1 9 ／LC a N 0 3 2 ；B 2 5 9 ／LF e S 0 4 ‘7 H 2 0 。A 、B 分别灭菌，用时混合后以浓硫酸调p H 1 ．4 ～1 ．4 5 。 2 矿石培养基。试验用混合铀矿石，酸化至 2 4 h 内p H 维持在1 ．4 ～1 ．4 5 ，按液固比5 1 配制， 调节p H 2 ．0 ，1 2 1 ℃灭菌1 5 m i n ，备用。 3 酸化液培养基。试验用混合铀矿石，用硫酸 酸化至2 4 h 内p H 维持在1 ．3 5 ～1 ．4 0 时，将整个酸 化过程中所换出的液体混合，调节p H 1 ．4 ～1 ．4 5 ， 1 2 1 ℃灭菌1 5 m i n ，备用。 1 ．1 ．3 混合铀矿石 “7 2 1 矿”沙洲坝、山南和邹家山三矿区的混和 矿石，矿石粒度小于0 ．5m m ，主要成分 ％ F e 2 0 ， 1 ．4 8 、，F e O1 ．6 3 、F 一1 ．1 3 ％、U Ⅳ 0 ．3 5 1 、U W 1 0 ．0 1 0 。 1 ．2 实验方法 1 ．2 ．1 菌种分离及驯化 1 菌种分离 利用p H 3 ．5 的选择性9 K 培养基、2 0 ％接种 量、5g ／L 的F e 2 从“7 2 1 矿”沙洲坝矿区矿石样中 分离并转代培养得到最适p H 2 ．0 - - 2 ．5 、最适温度 3 0 ～3 5 ℃的L ．F 与丁．F 混合菌株0 0 3 5 。 2 0 0 3 5 菌株对矿石的适应性驯化 0 0 3 5 菌株在5 0 ％矿液 5 0 ％9 K 作为培养基， 按液固比1 0 l 、5 1 、2 1 、1 1 逐步增加试验用铀矿 石，接种量2 0 ％、p H 2 ．0 、3 5 ℃、转速1 6 0r ／m i n 条 件下培养，直至0 0 3 5 在液固比1 1 时生长良好。 3 0 0 3 5 菌株紫外线诱变驯化[ 2 ] 1 5 W 紫外灯，预热2 0 m i n ，将盛有1 0 m L 对数期 的0 0 3 5 活性菌液的直径为9 c m 的培养皿置于距紫 外灯1 5 c m 处，照射2 5 m i n 后，按2 0 ％接种量接种入 矿石培养基中，用稀硫酸调节p H 1 ．4 。在3 5 ℃， 1 6 0 r ／m i n 条件下振荡培养，p H 始终维持在1 ．4 左 右，定时观测F e z 、F e 3 及F 一。待二价铁完全氧化 后立即接种入相同矿石培养基中同等条件下培养至 活性最佳 F e z 完全氧化所需时间在2 5 h 以内 。 该菌株命名为U 0 0 3 5 。 1 ．2 ．2U 0 0 3 5 适应高矿化度酸化液的驯化 取U 0 0 3 5 活性菌液按2 0 ％接种量依次接种到 含酸化液量分别为5 0 ％、7 5 ％和1 0 0 ％的9 K 酸化 液无菌培养基中，U 0 0 3 5 在前一个梯度的培养基中 应培养至二价铁完全氧化所需时间在2 5 h 以内，再 接种入下一个梯度的培养基中。最后得到完全能够 适应高浓度酸化液的菌株。 1 ．2 ．3 铀矿石细菌槽浸实验 1 矿样酸化 先用1 0g ／L 的硫酸溶液进行酸化3 ～4 d ，后用 5g ／L 硫酸酸化2 ～3 d ，使其p H 在2 4 h 内维持在 1 ．4 ～1 ．4 5 ，酸化结束。 2 菌浸阶段 向酸化好的矿石中加8 0 0 m L 、p H 1 ．4 的 U 0 0 3 5 活性菌液，在3 5 ℃、9 0L ／h 充气条件下进行 槽浸，每2 4 h 换液一次，检测其F e z 、F e 3 、p H 、E h 、 u 6 、F 一等参数。共换液7 次。 1 ．3 分析方法 溶液中的F e 2 、F e 3 用E D T A 滴定法[ 3 ] 测定， p H 由3 2 0 一S 型精密酸度计，E h 由P H S 一3 C 电位 仪测定，铀浓度用N H 4 V 0 3 滴定法[ 2 ] 测定，F 一用氟 电极和p H S 一3 C 电位仪测定，菌密度用B X 5 1 型 O L Y M P U S 光学显微镜下血球记数板观测记数， 7 2 1 型分光光度计测O D 值，溶液离子浓度利用D X 一6 0 0 型离子色谱仪测定。 2 结果与讨论 2 ．1 驯化诱变 2 ．1 ．10 0 3 5 菌株对矿石的适应性驯化 为了得到既能够耐受低p H ，又能在高矿化度条 件下具有强活性的浸矿菌，我们采用先进行矿石适 应性驯化，后进行低p H 诱变的方法处理原种子菌 液 表1 。 表1 矿石培养基离子浓度 T a b l e1T h ei o nc o n c e n t r a t i o no fm i n e r a lc u l t u r em e d i u m ／ g L 一1 项目F C I S 0 4 2 ‘N 0 3 一P 0 4 ”L i N a K 。 M 矿 C a 2 N I L , U 6 C t 0 ．2 20 ．6 01 3 ．7 61 ．0 40 ．4 20 ．0 11 ．0 80 ．2 50 ．2 21 ．0 80 ．0 60 ．4 0 C 20 ．3 60 ．5 61 4 ．7 80 ．9 60 ．8 50 ．0 11 ．1 00 ．2 6 0 ．1 9 0 ．9 3 0 ．1 2 0 ．6 2 c 3 0 ．9 20 ．4 31 7 ．6 60 ．8 4 1 ．0 6 2 ．3 81 ．1 0 70 ．1 30 ．3 30 ．7 90 ．0 20 ．9 8 已1 ．4 80 ．6 03 4 ．6 20 ．8 41 ．0 32 ．6 60 ．9 20 ．3 10 ．1 90 ．9 10 ．3 61 ．0 2 F e矿化度 5 ．1 62 4 ．3 0 5 ．2 52 6 ．O O 5 ．2 63 1 ．9 0 6 ．2 25 1 ．2 0 注C 1 、c 2 、C 3 、C 4 分别为矿液中液固比为1 0 1 、5 1 、2 1 、1 1 时的离子浓度。 万方数据 有色金属 冶炼部分 2 0 0 5 年5 期 4 5 图1 为0 0 3 5 在不同液固比的矿石培养基中培 养时二价铁完全氧化时所需时间情况。由图1 可 见，驯化过程中每种液固比均转接四代，在液固比为 1 0 1 时，第一代铁氧化速率较高，随着液固比增加， 第一代铁氧化速率明显减慢，但经几代转接后，在液 固比1 1 条件下能够在2 3 ．5 h 将F e 2 完全氧化，几 乎和液固比1 0 1 时的氧化速率相当。 ∈ 童 富 长 隳 裂 釜 6 0 5 0 “ 3 0 2 0 l O 0 1 0 】5 l2 ll l 液固比 图1不同液固比时F e 2 完全氧化所需时间 F i g ．1 T i m eo ff e r r o u so x i d i z e d c o m p l e t e l ya td i f f e r e n tL ／S 微生物个体微小，代谢速度快，当外界环境改变 时对环境具有极强的适应性。在进行矿石适应性驯 化过程中，当逐步增加矿石时，体系矿化度增大，在 这种条件诱导下，0 0 3 5 细胞内产生适应酶以逐步适 应高离子浓度的体系，表现为驯化第一代时生长周 期明显延长 经测定迟滞期HJ 延长 ，当经过几代转 接之后，0 0 3 5 对该高矿化度条件适应，迟滞期缩短， 二价铁氧化时间亦显著减少。 2 ．1 ．2 紫外线诱变驯化 0 0 3 5 菌株在获得了耐受高离子浓度的性状后 采用紫外照射定向诱变法，可在较短时间内获得适 应极低p H 的性状。对原菌液进行2 5 m i n 的紫外照 射后测得致死率为7 5 ％。 化时间关系图。可见，经过7 代接种，其生长速度达 到最快 2 2 ．5 h 即可将F e 2 完全氧化 。0 0 3 5 诱变 后第一代将F e 2 完全氧化的时间很长 长达1 0 7 天，图中未附 。由于紫外诱变中，致死率较高时，正 突变率相对较低。本次试验中，紫外照射后所接种 的培养基为低p H 1 ．4 和高矿化度的极端环境条件 F 一≥9 0 0 r n g ／L ，铁、铀离子浓度见表1 ，极少的正 突变体在这种双重选择压力环境中有一个缓慢的适 应过程，因此，F e 2 完全氧化所需时间相当长。当 F e 2 完全氧化后，能够适应这种低p H 和高矿化度 环境的细菌数量显著增加 达1 0 5 “个c e l l ／m L 。 当第二代接种时其初始菌度约为1 0 4 - 5 个c e l l ／m L ， 氧化时间缩短到了1 2 天，到第8 代时则缩短到了 2 2 ．5 h ，表明诱变后存活下来的菌具有很高的氧化活 性，且后续接种性能稳定。 图2 接种代数与铁氧化时间 F i g ．2 T i m eo ff e r r o u so x i d i z e dc o m p l e t e l y w i t hi n o c u l a t eg e n e r a t i o n 2 ．2U 0 0 3 5 对酸化液的适应性 经过高矿化度驯化和低p H 定向诱变的U 0 0 3 5 在矿化度为5 2 ．3g ／L 的酸化液 表2 中进行转代 培养，图3 为转接4 代氧化全部二价铁所需时间，作 为对照同时进行了U 0 0 3 5 在基本培养基9 K 中的转 代培养。 图2 为紫外线诱变后接种代数与F e z 完全氧 表2 酸化液培养基和9 K 培养基离子浓度 T a b l e2T h ei o nc o n c e n t r a t i o no fa c i ds o l u t i o na n d9 Kc u l t u r em e d i u m ／ g L 一1 项目F C I S 0 4 。N O 】一P 0 4 3 一L i N a K M 9 2 C a z N I - hU 6 F e 矿化度 C 41 ．6 70 ．4 33 5 ．5 40 ．8 40 ．9 82 ．7 81 ．0 70 ．0 80 ．4 20 ．8 10 ．4 0 1 ．2 16 ．0 25 2 ．3 c 5 0 ．0 0 40 ．1 31 ．8 70 ．1 30 ．0 50 ．0 90 ．1 10 ．0 30 ．0 50 ．4 6 5 ．0 27 ．9 2 注C 4 、C ，分别为酸化液、和9 K 培养基中的离子浓度，“一”表示未检出。 由图3 可见，U 0 0 3 5 在一开始接种入酸化液培 养基中即需要5 0 h 才能将F e 2 完全转化，到了第3 代缩短至2 4 h ，第4 代2 2 h 即可转化完所有F e 2 。 说明该菌株在接种入高矿化度的酸化液中后，稍有 一个适应的过程，只经过2 代的适应，到了第3 代接 种就已经几乎和9 K 中的氧化速率差不多。有资料 报道[ 5 ] 一株在低矿化度时氧化活性很高的L f 菌在 p H 1 ．7 ，硫酸根浓度为3 0g ／L 时F e z 的氧化速率 p／暮譬鲁琢甜帐。出 万方数据 4 6 有色金属 冶炼部分 2 0 0 5 年5 期 仅为0 ．0 2 5g ／L h ，而从表2 也可以看出，U 0 0 3 5 菌 株在矿化度为5 2 ．3g ／L 、硫酸根浓度为3 5 ．5 4g ／L 、 p H 1 ．4 时F e 2 的氧化速率达到了0 ．2 0 9g ／L h ， 是前者的近1 0 倍，说明该菌株具有很好的适应高矿 化度的性能。 2 ．3 铀矿石槽浸实验 酸化液 图3酸化液培养基和9 K 培养基中铁氧化时间 F i g ．3 T i m eo ff e r r o u so x i d i z e dc o m p l e t e l yi n a c i ds o l u t i o na n d9 Kc u l t u r em e d i u m 经过酸化和7 次活性菌液浸出，渣计铀浸出率 达到了9 0 ．0 6 ％。图4 为整个菌浸过程中原菌液和 浸出液中总F e 和菌密度的变化情况，可以看出只第 一次加菌液后有部分F e 损失现象，到了第二次以后 浸出液总铁始终大于原菌液，说明所加菌液到了第 二次浸出就已经适应了浸矿环境，矿石中的铁不断 溶解，总铁增加；同时从菌密度的变化也可看出，混 合菌液在第一次加入后稍有一定的适应期，因此第 一次浸出液中的菌密度低于原菌液，而到了第二次 浸出则可以看出混合菌已经很快适应了这种高矿化 ， j 阜 _ t 里 赵 稍 酒 图4 浸出前后菌密度与∑F e 变化 F i g ．4 T h ec h a n g eo fb a c t e r i ad e n s i t ya n d ∑F eb e f o r ea n da f t e rl e a c h i n g 度的浸矿环境，浸出液中总铁和菌密度都开始增加， 表明细菌活性较强，氧化作用显著，直到浸出结束。 从铀的渣计浸出率来看，其浸出速率也很快，经 过酸化和7 次混合菌液浸出，铀的渣浸出率达到 9 0 ．0 6 ％。这比相关资料所报道[ 6 】某铀矿石细菌柱 浸试验利用p H 2 ．0 的菌液经过1 0 天浸出其渣计 浸出率为6 0 ．9 ％的浸出率高，浸出速度快。因此， 该驯化混合菌株对于试验用铀矿石具有很好的适应 性，并能够缩短浸矿时间、提高浸出率。 3结论 1 分离驯化得出一株适应7 2 1 铀矿石环境的 0 0 3 5 L ．厂 T ．， 混合菌株。 2 以7 2 1 矿三矿区的铀矿石以及高离子浓度 矿石酸化液为驯化介质，紫外线为诱变剂进行诱变 选育，使其矿化度的耐受性达到5 2 ．3g ／L 、最适的 生长p H 从2 ．0 增宽到1 ．4 - - 2 ．0 ； 3 U 0 0 3 5 菌株在铀矿石的槽浸中初步解决了 生物浸铀过程中存在的浸矿速度慢、周期长、铁损失 等问题。该菌株有望用于铀矿生物浸出的半工业生 产中。 参考文献 [ 1 ] 王清良，刘迎九，杨金辉，等．7 2 1 铀矿石细菌渗滤浸出 及细菌的驯化培养研究[ J ] ．金属矿山，2 0 0 3 1 0 3 8 3 9 ． [ 2 ] 刘亚洁，李江，陈功新，等．适应铀矿石的耐极低p H 值 氧化亚铁硫杆菌的诱变育种[ J ] ．矿产综合利用，2 0 0 5 3 2 2 2 3 ． [ 3 ] 国家环保局编委会．水和废水监测分析方法[ M ] ．北 京中国环境科学出版社，1 9 8 9 1 6 9 2 0 1 ． [ 4 ] 张传福，闵小波，柴立元，等．氧化亚铁硫杆菌生长迟缓 期的影响因素[ J ] ．中南工业大学学报，1 9 9 9 5 4 8 9 4 9 2 ． [ 5 ] J a i m eR o m e r o ，C a r o l i n aY a n e z ，M o n i c aV a s q u e z ，e ta 1 ． C h a r a c t e r i z a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o fa ni r o n o x i d i z i n g ， L e p t o s p i r i l l u m l i k eb a c t e r i u m ，p r e s e n ti nt h eh i g hs u l f a t e l e a c h i n gs o l u t i o no fac o m m e r c i a lb i o l e a c h i n gp l a n t [ J ] ．R e s e a r c hi nM i c r o b i o l o g y ，2 0 0 3 1 2 3 5 6 3 5 7 ． [ 6 ] 胡凯光，黄仕元，杨金辉．铀矿石的细菌浸出试验研究 [ J ] ．湿法冶金，2 0 0 3 6 8 6 8 7 ． ∞ ∞ ∞ 鲫 舯 m o II，垦竹星球剞掀釜 万方数据