中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件优化研究.pdf

5 7 9 硕士学位论文 学校代码 Q 圣3 密级公珏 中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件优化研究 O p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n sf o rm o d e r a t et h e r m o p h i l e C O - c u l t u r es y s t e m 作者姓名 学科专业 研究方向 学院 系、所 指导教师 吴俊子 生物工程 微生物冶金 资源加工与生物工程学院 周洪波教授 论文答辩日期j 吐龇 答辩委员会主 中南大学 二O 一三年五月 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南 大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本 研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名．喜缸日期崞年L 月1 日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权 保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位 论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用 复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所 将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 作者签名艇导师签名蚴期季年上月{ 日 硕士学位论文摘要 中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件优化研究 摘要中等嗜热菌不仅热力学效率比较高，而且可以耐受更高的金属离 子浓度和矿浆浓度。也有大量的研究表明，单一菌株浸矿存在一定的局限 性，不同代谢类型的微生物混合浸矿可以明显提高浸出率，所以中等嗜热 混合菌在工业上具有广阔的应用前景。生物冶金技术在工业应用中需要接 种大量的浸矿微生物，获得大量的中等嗜热混合菌是迫切需要解决的技术 难题。 本研究首先构建一个含有铁氧化代谢和硫氧化代谢、自养菌和兼性自 养菌、细菌和古菌的中等嗜热浸矿菌共培养体系，包括S u l f o b a c i l l u ss p ． T P Y 、L e p t o s p i r i l l u mf e r r i p h i l u m Y S K 、A c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2 和 F e r r o p l a s m at h e r m o p h i l u mL 1 四株菌。本研究考察了初始p H 值、温度、 F e S 0 4 “ 7 H 2 0 添加量、硫粉添加量和酵母粉添加量等五个因素对中等嗜热 浸矿菌共培养体系的菌体浓度和群落结构的影响，采用响应面分析法进一 步优化该共培养体系的培养条件探究了影响共培养体系微生物生长的显 著性因素及不同因素之间的交互作用。 初始p H 值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的生长具有明显的影响，初 始p H 为1 ．5 时菌体浓度在第2 2 小时已达到了最大值4 ．8 1 0 8 个／m L ，该 条件下S u l f o b a c i l l u ss p ．T P Y 一直是体系中的优势种群。F e S 0 4 “ 7 H 2 0 添加 量为4 0g ／L 时，共培养体系的最大菌体浓度可以达到5 ．2 1 1 0 8 个／m L ， 硫养菌A c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2 也占有2 0 ．18 ％。硫粉添加量为8g m 和 1 0g m 的情况相差不大，但更加节省能源物质。温度过高或过低都不利于 共培养体系微生物的生长，温度为4 5 0 C 的实验组的菌体浓度的最大值为 5 ．8 0 1 0 茜个／m L 。酵母粉添加量选择0 ．0 2 ％更为合理，此条件的菌体浓度 在第5 8 小时可以达到5 ．6 8 1 0 嚣个／m L ，A c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2 的所占 的比例为1 7 ．5 5 ％，S u l f o b a c i l l u ss p ．T P Y 占4 4 ．6 8 ％，而L e p t o s p i r i l l u m f e r r i p h i l u mY S K 占3 6 ．9 ％。 P l a c k e t t - B u r m a n 实验结果表明初始p H 值、温度和M g S 0 4 7 H 2 0 添加 量三个因素对中等嗜热菌共培养体系的微生物生长的影响最显著。通过最 陡爬坡实验和中心组合实验得到这三个最显著因素的最优值为初始p H 值1 ．3 8 ，温度4 4 0 C ，M g S 0 4 7 H 2 0 添加量0 ．5 5 2g ／L 。在最优的条件下进 行验证实验，在第5 8 小时所获得的微生物浓度为7 ．5 5 x 1 0 8 个／m L ，且体 系中的微生物群落结构情况为S u l f o b a c i l l u ss p ．T P Y 2 2 ．3 3 ％ ， L e p t o s p i r i l l u mf e ∥i p h i l u mY S K 3 7 ．5 3 ％ ，A c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2 3 6 ．8 ％ ，F e r r o p l a s m at h e r m o p h i l u mL 1 3 ．3 4 ％ 。 Ⅱ 硕士学位论文摘要 初始p H 值和温度两个重要因素对中等嗜热混合菌共培养体系微生物 生长的交互影响显著，在一定范围的初始p H 值 1 ．3 8 ．1 ．5 2 内，初始p H 值越大，微生物生长的最优温度越低；且随着初始p H 值的增大，温度对 中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长影响越来越大。初始p H 值和 M g S 0 4 7 H 2O 添加量这两个重要因素之间只有略微的交互作用，而温度 和M g S 0 4 7 H 2O 添加量两个重要因素交互作用则不显著。 关键词中等嗜热菌；共培养体系；条件优化；响应面分析；实时定量 P C R ；交互作用 分类号T F l8 ；Q 9 3 9 ．9 7 Ⅲ 硕士学位论文A b s W a c t O p t i m i z a t i o no f c o n d i t i o n sf o rm o d e r a t et h e r m o p h i l e s C O c u l t u r es y s t e m A b s t r a c t M o d e r a t et h e r m o p h i l e sc a nn o to n l ya c h i e v er e l a t i v e l yh i g h e r t h e r m o d y n a m i ce 伍c i e n c y , b u tc a na l s o t o l e r a t eh i g h e rc o n c e n t r a t i o no f m e t a li o n sa n dp u l p ．I nr e c e n ty e a r s ，t h em a j o r i t y r e s e a r c h e sh a v ef o u n d t h a tm i x e dc u l t u r e so f a c i d o p h i l e s w e r e f r e q u e n t l y m o r er o b u s t a n d e f f i c i e n ti no x i d i s i n gs u l f i d em i n e r a l s t h a nc o r r e s p o n d i n g p u r ec u l t u r e s ． T h e r e f o r e ，m o d e r a t et h e r m o p h i l e sh a v eg r e a t e ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n p o t e n t i a l ．H o w e v e r , al a r g en u m b e ro fm i c r o o r g a n i s m sw e r en e e d e di n b i o l e a c h i n g i n d u s t r i a la p p l i c a t i o n ．S oi ti s i m p e r a t i v et o s o l v et h e t e c h n i c a lp r o b l e mo fo b t a i n i n gal o to fm o d e r a t et h e r m o p h i l e s ． I nt h i sp a p e r , am i x e dC O c u l t u r e m o d e r a t e l yt h e r m o p h i l i cc o n s o r t i u m i n c l u d i n gf o u rs t r a i n sS u l f o b a c i l l u ss p ．T P YL e p t o s p i r i l l u mf e r r i p h i l u m Y S K ，A c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2a n dF e r r o p l a s m at h e r m o p h i l u mL 1w a s c o n s t r u c t e dw h i c hc o n t a i n e dt h eo x i d a t i v em e t a b o l i s mo fi r o na n ds u l f u r , a n de x i s t e db o t ha u t o t r o p h i ca n df a c u l t a t i v ea u t o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m ， a n dw e r eb o t hb i o l e a c h i n gb a c t e r i u ma n da r c h a e a ．I nt h i ss t u d y , t h ee f f e c t o fs e v e r a lp a r a m e t e r so nt h ec e l ld e n s i t ya n dc o m I r l B n i t ys t r u c t u r eo ft h e C O ．c u l t u r e s y s t e m o fm o d e r a t e t h e r m o p h i l e s o fb i o l e a c h i n g w e r e i n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gi n i t i a lp H , t e m p e r a t u r e ，v o l u m eo fa d d i t i o no f e n e r g ys o u r c eF e S 0 4 ‘7 H 2 0 ，s u l f u r a n dy e a s te x t r a c t ．I na d d i t i o n , i t ’St h e f i r s tt i m e u s i n gr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g yt o o p t i m i z e c u l t u r e c o n d i t i o n so fC O - c u l t u r es y s t e mo fm o d e r a t et h e r m o p h i l e sa n dt oe x p l o r e s i g n i f i c a n ti n t e r a c t i o n sa m o n gd i f f e r e n t - v a r i a b l e s ． I n i t i a lp Hh a da g r e a ti n f l u e n c eo nM o d e r a t et h e r m o p h i l e sC O ．c u l t u r e s y s t e m ．t h ee e l ld e n s i t yc o u l dr e a c h4 ．8 0 x1 0 6 c e l l s ／m La f t e r2 2h o u r s u n d e ri n i t i a lp H1 ．5 ，a n dS u l f o b a c i l l u ss p ．T P Yw e r ep r e d o m i n a n ti nt h e s y s t e m ．W h e nF e S 0 4 ‘7 1 - 1 2 0d o s a g ew a s4 0 班，c e l ld e n s i t yc o u l dr e a c h 5 ．21 X10 6 c e l l s ／m La t5 8ha n dA c i d i t h i o b a c i l l u s c a l d u sS 2w a sa c c o u n t f o r2 0 ．18 ％．S i n c et h em a x i m u me e l lc o n c e n t r a t i o nw i t h10g ／Ls u l f u r d o s a g eW a s n o ta no b v i o u sd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eo n ew i t h8 轧d o s a g e ． F r o mt h e e n e r g y - s a v i n gp o i n t o fv i e w , 8e e Ls u l f u r d o s a g e w a s s u g g e s t e d ．T e m p e r a t u r e h a da no b v i o u se f f e c to nt h eM o d e r a t e I V 硕士学位论文A b s t r a e t t h e r m o p h i l e sC O - c u l t u r es y s t e m ．U n d e rt e m p e r a t u r e4 5o Ce e l ld e n s i t y r e a c h e dm a x i m u m5 ．8 0 x10 6 c e l l s ／m L ．I ti Sr e a s o n a b l et oc h o o s e0 ．0 2 ％ y e a s te x t r a c td o s a g e ，b e c a u s ei nt h i ss i t u a t i o nc e l lc o n c e n t r a t i o nC a l lr e a c h 5 ．6 8 x10 6c e l l s ／m La t5 8ha n d t h e c o m m u n i t ys t r u c t u r ei Sg o o d ． I tW a sf o u n dt h a ti n i t i a lp H , t e m p e r a t u r ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no f M g S 0 4 7 H 2 0w e r e t h et h r e em o s t s i g n i f i c a n t f a c t o r s a f f e c t i n g c o - c u l t u r eo fm o d e r a t e t h e r m o p h i l e sb y s t a t i s t i c a l m e t h o d s P l a c k e t t B u r m a n ．T h es t e e p e s ta s c e n te x p e r i m e n tw a sp e r f o r m e d t or e a c ht h eo p t i m u md o m a i no ft h em a x i m u mr e s p o n s e ．乃er e s u l t so f C e n t r a lC o m p o s i t eD e s i g n s h o w e dt h a tt h em a x i m u mc e l l d e n s i t yo f c o - c u l t u r es y s t e mw a s7 ．6 6 10 6c e l l s ／m Lw i t ht h ec o n d i t i o n so fi n i t i a l p H1 ．3 8 ，t e m p e r a t u r e4 4 ．0 0 ℃a n dM g S 0 4 。7 H 2 0O ．5 5g ／L ．T ov a l i d a t e t h ea d e q u a c yo ft h em o d e le q u a t i o n , f i v ea d d i t i o n a le x p e r i m e n t si ns h a k e f l a s k su n d e rt h eo p t i m u m m e d i u mc o m p o s i t i o n sw e r ep e r f o r m e d ．T h e m e a nv a l u eo fe e l ld e n s i t yo fC O ．c u l t u r ew a s7 ．5 5 10 芍c e l l s ／m La n dt h e s y s t e mh a dar e a s o n a b l ec o m m u n i t ys t r u c t u r e ，w h i c hW a si ng o o d a g r e e m e n tw i t h t h ep r e d i c t e dv a l u e ． I nt h i sp a p e r , R e s p o n s eS u r f a c eM e t h o d o l o g yW a su s e dt os t u d yt h e c u l t u r ec o n d i t i o n so fC O ．c u l t u r es y s t e mo fm o d e r a t et h e r m o p h i l e so f b i o l e a c h i n g ．T h er e s u l ts h o w e dt h a ti n i t i a lp Hv a l u ea n dt e m p e r a t u r eh a d s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n o fC O ．c u l t u r es y s t e mo fm o d e r a t et h e r m o p h i l e so f b i o l e a c h i n g ．W i t ht h ev a l u eo fi n i t i a lp H r a n g i n gf r o m1 ．38 - 1 ．5 2 i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e s h o w s m o r ea n dm o r es i g n i f i c a n te f f e c t ．T h i s s u g g e s t e dt h a ti nt h i sr a n g et h ec h a n g e so fi n f f i a lp Hw i l la u g m e n tt h e i m p o r t a n c eo ft e m p e r a t u r ec o n t r 0 1 ．M o r ea t t e n t i o ns h o u l db ep a i dt o i n t e r a c t i o n sa m o n gf a c t o r sd u r i n gt h eo p t i m i z a t i o no fC O c u l t u r es y s t e m o fm o d e r a t et h e r m o p h i l e so fb i o l e a c h i n g ，S Oa st om a k et h eb i o l e a c h i n g m o r ee c o n o m i c ．H o w e v e r , i n i t i a lp Hv a l u ea n dM g S 0 4 。7 1 - 1 2 0 ，a n d t e m p e r a t u r ea n dM g S 0 4 7 1 - 1 2 0d i dn o tm a n i f e s ts t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n ． K e yw o r d s m o d e r a t et h e r m o p h i l e s ； C O ．c u l t u r e s y s t e m ； c o n d i t i o n o p t i m i z a t i o n ；R e s p o n s eS u r f a c eM e t h o d o l o g y ；R e a l t i m eq u a n t i t yP C R ； i n t e r a c t i o n C l a s s i f i c a t i o n T F l8 Q 9 3 9 ．9 7 V 硕士学位论文目录 目录 原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I 摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I I 目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯V I 1 绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 1 ．1 生物冶金技术及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 1 ．2 浸矿微生物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 1 ．2 ．1 中温菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 1 ．2 ．2 极端嗜热菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 1 ．2 - 3 中等嗜热菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 1 ．3 微生物间的相互作用与混合菌浸矿⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 1 ．3 ．1 微生物间的相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 1 ．3 ．2 混合菌浸矿⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 1 ．4 微生物群落多样性分析的分子生物学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7 1 ．4 ．1 核酸杂交技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8 1 ．4 ．2 基因序列系统发育分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8 1 ．4 ．3 实时荧光定量P C R 分析法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9 1 ．5 本文的研究目的与研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9 1 ．5 ．1 本文的研究目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9 1 ．5 ．2 本文的研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9 1 ．6 本论文课题资助情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 0 2 实验材料与研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 1 2 ．1 共培养体系的组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1 2 ．2 ．考察初始p H 值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1 2 ．3 考察F e S 0 4 “ 7 H 2 0 添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯1 2 2 ．4 考察硫粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 2 2 ．5 考察温度对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 2 2 ．6 考察酵母粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 2 2 ．7 响应面分析法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13 2 ．7 ．1 影响中等嗜热混合菌共培养体系细菌生长的显著因素筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1 3 2 ．7 ．2 最陡爬坡实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13 2 ．7 ．3 中心组合实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 4 2 ．8 实时荧光定量P C R ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1 5 V T 硕士学位论文目录 2 ．8 ．1 中等嗜热浸矿微生物共培养体系微生物总基因组的提取和纯化⋯⋯⋯⋯1 5 2 ．8 ．2P C R 特异性引物的设计及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 5 2 ．8 ．3 实时定量P C R 分析中等嗜热浸矿微生物共培养体系的群落结构⋯⋯⋯．．1 7 2 ．9 物理化学分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 8 3 中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件的初步优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 9 3 ．1 初始p H 值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 3 ．2F e S 0 4 “ 7 H E O 添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 4 3 ．3 硫粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 7 3 ．4 温度对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9 3 ．5 酵母粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 2 3 ．6 实时定量P C R 结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 5 3 ．6 ．1 引物的特异性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 5 3 ．6 ．2 实时定量P C R 的溶解曲线和标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 6 3 ．7 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 8 4 响应面分析法优化共培养体系的培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 0 4 ．1 影响中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长的显著因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 0 4 ．2 最陡爬坡实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 2 4 ．3 中心组合实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 2 4 ．3 ．1 中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长菌体浓度的二次多项式方程模型的 建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯■⋯⋯⋯．．4 5 4 ．3 ．2 构建的模型的适合性检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 6 4 ．3 ．3 构建的模型的可信度分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 0 4 ．4 优化后的培养条件验证实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51 4 ．4 ．1 优化后的培养条件下中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长情况⋯⋯⋯5 2 4 ．4 ．2 优化后的培养条件下中等嗜热混合菌共培养体系微生物的群落结构分析5 2 4 ．5 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 4 5 显著性影响共培养体系的因素之间的交互性作用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 5 5 ．1 初始p H 值和温度对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响⋯⋯⋯5 5 5 ．2 初始p H 值和M g S 0 4 7 H 2O 对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．。。．。。。．。．．。．．。。．。．。．。．．．．．．．．．．． ；7 5 ．3 温度和M g S 0 4 7 H 2 0 对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响⋯．5 8 5 ．4 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 0 6 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 1 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 2 V I I 硕士学位论文 目录 攻读学位期间主要的研究成果目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7 0 致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 V I I I 硕士学位论文l 绪论 1 绪论 1 ．1 生物冶金技术及其应用 生物冶金技术就是利用具有亚铁氧化能力或者还原态无机硫能力的嗜酸浸 矿微生物氧化分解原生矿石或者经处理后得到的精矿，以获得贵重金属如金，银 等其他金属【1 】。目前，生物冶金技术主要成功地应用于铜、铀、金和银等矿山的 工业化生产，应用范围逐步从堆浸法到地浸法和原地破碎浸矿法，几乎向铜、铀、 金、锰、铅、锌、镍、铬、钴、铁、砷、铝所有的硫化矿的浸出扩大【2 】。智利、 澳大利亚、南非、美国和日本等的产业化相对比较领先，而中国和欧盟近几年也 先后投入大量资金以开展生物冶金技术的研究【3 】。 1 低品位硫化铜矿的生物浸出 生物浸出技术最初主要应用于废石和低品位硫化矿中铜的提取，近年来这种 技术已经用于铜的品位高于1 ％的次生硫化矿的处理。目前，大约占世界总铜产 量2 5 ％的铜是采用生物冶金技术提取。 智利、美国、加拿大和澳大利亚等2 0 多个国家已经实现生物浸铜产业化。 美国K e n n e c o t t 公司首先生物浸铜技术工业化，并在1 9 5 8 年获得第一个与生物 浸出技术相关的专利【4 】。1 9 8 0 年，智利北部的M i n e r a lP u d a h u e l 矿山公司成功建 立了世界上第一个商业化规模的生物堆浸低品位铜矿厂。智利的奎布瑞达布兰卡 是世界上海拔最高的湿法冶炼铜矿厂，该厂用生物堆浸技术处理铜的品位平均为 1 ．4 ％的铜矿石，铜的浸出率能达到8 2 ％，年产量为7 ．5 万吨阴极铜。1 9 9 1 年， 澳大利亚n n d p o w e rM a m m o t h 铜矿厂建成并投产，设计的处理能力为1 3 0 0 0t ／a ， 1 9 9 3 年，智利的C e r r o rC o l o r a d o 铜矿厂建成，设计的预处理能力为6 0 0 0 0t ／a 。 我国在生物浸铜的研究和应用方面与国外相比还有一定的差距。1 9 9 7 年5 月，江西德兴铜矿建成设计年产阴极铜2 0 0 0 t 的湿法铜矿厂，萃取箱的处理能力 为3 2 0m 3 ／h ，非常接近国外的萃取箱的水平。该厂自投产以来，一直正常运转， 所生产的阴极铜的质量可以达到A 级水平【5 】。广东大宝山建成我国的第一个生物 浸铜的中试基地，福建的紫金山铜矿已经采用生物堆浸技术建成年产阴极铜3 0 0 t 的试验厂【o J 。 2 难处理金矿的生物预氧化 目前，世界上黄金矿藏资源的1 ／3 左右属于难处理金矿，而且随着易处理金 矿的日益减少，难处理金矿资源将会成为今后的黄金工业的主要原料[ 7 1 。生物冶 金在难处理金矿应用方面主要是预处理阶段，利用细菌等微生物氧化分解硫化物， 硕士学位论文 1 绪论 使包裹的金颗粒暴露出来，易于下一步金的浸出【8 】。难处理金矿的生物预氧化技 术正走向成熟，已经从试验阶段转化为工业生产阶段，并且在发展的过程中形成 了B I O X 、B a c T e c h 、G e o b i o t i c s 和N e w m o n t 四种工艺【9 J 。 迄今为止，国外有6 个生物预氧化处理金矿厂分别在南非、美国、澳大利亚、 巴西和加纳建立投产。1 9 8 6 年，南非建立了世界上第一个成功运用细菌氧化预 处理提金矿厂F a i r v i r w ，金的浸出率可以达到9 5 ％以上【l0 1 。1 9 8 9 年，美国T o m k i n S p y t i n s 细菌氧化提金厂建成投产，处理矿石能力为1 5 0 0t ／d 。1 9 9 2 年，澳大利亚 建立了H a r b o u rL i g h t s 金矿厂，日处理矿石4 0 吨。 我国在应用生物预氧化处理金矿方面虽然起步较晚，但也取得产业化的快速 发展。2 0 0 0 年，山东烟台黄金冶炼厂建成投产，该厂是我国第一个使用生物氧 化技术预处理金矿石的细菌氧化提金厂，生产能力为5 0t ／d ，金的浸出率可以达 到9 1 ．5 2 ％。2 0 0 1 年，山东天承黄金冶炼厂建成并投产，日处理金精矿1 0 0 吨。 采用生物氧化法预处理新疆包古图金矿，可使该矿金的浸出率达到9 7 ％t 1 1 】。 1 ．2 浸矿微生物 生物冶金技术所使用的浸矿微生物的主要类型是化能自养型，这些微生物通过氧 化亚铁或者硫元素来给自身的生长代谢提供所需的能量。根据这些微生物的最适 生长温度的不同，将其分为中温菌 M e s o p h i l e s 、中等嗜热菌 M o d e r a t e t h e r m o p h i l e s 和极端高温菌 E x t r e m et h e r m o p h i l e s 三种。 1 ．2 ．1 中温菌 中温菌最适合的生长温度为2 0 ．3 5 0 C ，主要包括嗜酸氧化亚铁硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i l l u s [ e r r o o x i d a n s 、嗜酸氧化硫硫杆菌 A c i d i t h i o b a c i U u st h i o o x i d a n s 和氧化亚铁钩端螺旋菌 L e t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a