低残油土壤中高效降油菌的筛选分离及其营养平衡.pdf

生 化 技 术 低残油土壤中高效降油菌的筛选分离 及其营养平衡 ＊ 黄廷林 柴蓓蓓 宁亚平 西安建筑科技大学环境与市政工程学院 , 陕西 710055 摘要 为了更有效地修复被石油污染的土壤, 以低残油土壤为菌源, 原油为唯一碳源, 经反复驯化筛选后得到降解石 油的高效菌, 初步鉴定其为动胶菌属 Zoogloea sp. 。 并对该菌种的营养平衡条件进行了初探。 试验筛选出优势氮源 为NH4NO3, 氮磷比应控制在 4∶ 1左右。 关键词 低残油土壤 高效降解菌 筛选分离 营养平衡 ＊国家自然科学基金项目 编号 50378077 0 引言 随着西北黄土地区石油工业的发展 ,受石油污染 土地面积不断扩大, 污染环境的修复成为当前亟待解 决的问题 。而生物修复技术由于其经济高效 、 操作简 单、 无二次污染 [ 1] 等优点近年来备受关注。 本研究以西北黄土地区长庆油田采油井井台周 围低残油土壤中的土著微生物为菌源, 以原油为唯一 碳源 ,反复筛选 、 分离得到降解石油的高效优势菌 ,鉴 定后, 对其营养平衡条件进行了初探, 以期对西北黄 土地区油污土壤生物修复提供科学依据和理论参考。 1 材料与方法 1. 1 菌源与碳源 土样取自延安长庆油田采油井井台周围低残油 土壤 , 经 测定土样中 石油污染 物的质量分 数为 4. 8～ 5. 3,土壤 pH 值为 8. 4。用灭菌蒸馏水将土 样浸泡并曝气 24h, 静止沉淀 2h ,上清液外观为棕褐 色液体,以此上清液作为菌源 。 细菌驯化用碳源取自长庆油田脱水原油 ,为黑色 粘稠液体 。 1. 2 高效降油菌的驯化、筛选与分离 将采集的油污土样置入驯化筛选培养基中, 在 30 ℃ 恒温振荡器上培养7 d, 移取一定量富集培养液 接入新鲜油培养基 驯化筛选培养基 中 ,在相同条件 下培养 7 d,重复 3 次 。最后一次结束后的驯化液用 于菌种的划线分离 [ 2] 。将典型菌落在分离培养基的 平板上反复划线纯化后得到单一菌落 ,将其接种至保 存培养基的斜面上,4 ℃保存于冰箱中。菌株的鉴定 依据一般细菌常用鉴定方法 [ 3] 进行 ,初步鉴定到属。 1. 3 营养平衡条件实验 以降油培养基为基础 ,分别改变初始 pH 值 、 N 源 及N 、 P 元素的添加比例等因素,控制温度30 ℃, 在恒 温摇床上进行振荡培养。连续培养一定时间后,取样 观察 ,检测并分析其细菌生长量及石油烃含量 。 2 结果与讨论 2. 1 高效菌株的筛选 通过富集培养以及分离 、纯化等步骤得到 14 株 单菌株,进一步驯化得到 3 株优势菌 。在此基础上以 低残油土壤为碳源进行石油降解试验,每两天取 1 次 样,测石油烃含量, 直至其石油烃含量不再有明显变 化,试验结果如图 1、 图 2所示。 图 1 石油烃含量变化趋势 图 2 受试菌对石油的最终降解率 由图 1、 图2 可见 ,受试3 株菌对低残油污土壤的 7 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 石油烃降解率在 40左右 ,其中 1①的降解率略高 于50,是所筛选出优势菌中的高效菌。 2. 2 高效菌株的鉴定 菌株形态观察和生理生化试验鉴定 ,结果如表 1 所示,可初步确定1① 属于动胶菌属 Zoogloea sp. 。 表 1 高效菌的形态学及生理生化特征 鉴定特征菌落形态菌落颜色菌体形态革兰氏染色糖或醇类发酵油脂水解柠檬酸盐利用产吲哚 鉴定结果圆形, 半透明, 边缘整齐乳白色短杆G - 产酸不产气阳性7 d 阳性 2. 3 高效菌营养平衡条件研究 土壤中氧、氮、磷元素的缺乏最可能成为微生物 降解石油的限制因素 [ 4 -7] 。为此本文选取几种典型的 氮源进行试验对比其降解效果 ,并通过调节氮磷元素 的比值来初探受试高效菌营养元素之间的平衡关系。 由于氮、磷营养盐的加入会使降解体系的 pH 值发生 变化 [ 8] , 并影响到优势氮源的选择 。 2. 3. 1 初始 pH 值对高效菌降解石油的影响 保持其它条件相同, 调节初始 pH 值分别为 3、 5、 7、 9 、 11, 连续振荡培养一定时间后, 取样观察, 检测并 分析其细菌生长量及石油烃含量, 结果见表 2。 表 2 不同初始 pH 值对降解的影响 初始 pH 值终了pH值OD 值 光密度降解率 33. 50. 15827. 3 56. 10. 33434. 4 77. 20. 65965. 7 97. 90. 79053. 3 119. 40. 32132. 4 表2 中分析结果表明,不同的初始 pH 值下, 石油 的生物降解率相差 2 倍以上 ,菌体生长量也有大幅度 变化 0. 154～ 0. 790 , 说明 pH 值是影响微生物生长 的一个重要环境因素 。不同微生物其生长最适 pH 值常在一个较小范围内 , 低 pH 值会影响 N 的转化, 当 pH 稍高于中性时,对硝化作用及 N 的进一步转化 均有利,而 P 的有效性在 pH 6 ～ 9 时很高 [ 9] 。由表 2 可以看出 ,此株高效菌在 pH 值为 7～ 9 时对石油的降 解效果最好, 达 50以上 53. 3～ 65. 7 , 而此时 的菌体富集程度也较高 0. 659 ～ 0. 790, 为最低时的 4～ 5倍 ,且降解基本达平衡后体系 pH 值基本稳定 在7～ 9之间, 由此表明, 该株菌的适宜 pH 值范围为 7～ 9, 与受污染原生土壤的环境 pH 值 pH 8. 4 较 吻合 ,这正说明烃类污染物能引导具备降解能力的微 生物产生诱导酶 ,在降解烃类的过程中逐渐被驯化接 受自然选择而富集成为优势菌 。 2. 3. 2 优势氮源选择 添加营养盐有利于促进土壤中石油污染物的生 物降解 ,在诸多因素中起着主要作用 [ 8,10-12] 。而微生 物对氮源的作用较敏感, 故在此对不同氮源的影响进 行试验 比 较。 本 试 验选 取 NH4NO3、 NH42SO4、 NaNO3、 尿素 CO NH22 4 种有代表性的氮源进行比 较,结果如图 3 所示。由图可见, 几种氮源对细菌生 长的促进作用大小依次为 NH4NO3 NH42SO4 NaNO3尿素 CO NH22 。其中以 NH4NO3为首选, 作用机理有待进一步探讨 。相对而言,无机氮源比有 机氮源好, 从理论上讲,有机氮源同时作为碳源,将优 先于石油烃被利用, 从而妨碍了石油烃的降解 。所以 选择NH4NO3为优势氮源进行下一步研究 。 图 3 不同氮源对菌体生长量的影响 2. 3. 3 氮磷的供给与平衡对高效菌降解石油的影响 Dibble 等人 [ 13] 研究表明, C∶ N 为 60∶ 1、C∶ P 为 800∶ 1时微生物降解石油的效果最好 。而 Borger 等人 发现 [ 14] ,C∶ N∶ P 为 100∶ 10∶ 1 时 , 石油的降解率最高 。 可见不同菌株对于营养元素所需的配比不尽相同。因 此,本试验在确定优势碳源的基础上,对于N 、 P 元素的 高效配比进行了试验研究 ,结果如图 4、 5 所示。 图4 不同N 元素含量对菌株生长的影响 由图 4、 5 可见 ,固定磷含量不变, 改变氮的投加 量,经计算当氮 、 磷比 质量比 为 4∶ 1左右时, 菌体富 8 环 境 工 程 2006年 6 月第24 卷第3 期 图 5 不同氮含量对降解率的影响 集程度较高 图 4 , 在该配比下优势菌对石油的降解 效果也相应最高 图 5 。可见, 投加氮量过多或过少 都会影响菌体的生长及降解效果。因此 ,确定该高效 菌株的优势氮、磷比为 4∶ 1, 营养元素的精确投量及 与菌体总数之间的定量关系有待进一步深入研究 。 3 结论 1 以低残油土壤中的土著微生物为菌源 ,原油 为唯一碳源经驯化筛选得到一株降解石油的高效菌, 降解率 原污染土样泥浆中 达 50以上, 初步鉴定 为动胶菌属 Zoogloea sp . 。 2 所得高效菌在 pH 值 7～ 9 范围内降解效果优 于其它 pH 值, 与污染原生土壤环境 pH 值基本相同 pH 8. 4 。进行生物修复时, 可以不调节土壤环境 的酸碱度 ,降低污染土壤修复的成本。 3 通过试验确定 NH4NO3为优势氮源 ,氮 、 磷比 为4∶ 1时 ,生物降解达到最佳效果 。 参考文献 [ 1] 任磊, 黄廷林. 石油污染土壤的生物修复技术. 安全与环境学 报, 2001,1 2 50 -54. 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Keywords soil lightly contaminated by oil, predominant bacteria to degrade oil, screening isolating and nutrient balance STABILITY ANALYSIS OF AOB COMMUNITY IN NITRIFYING SUSPENSION FILLER TOWER Wang Feng Xia Siqing Shi Yan et al 10 Abstract It was studied that ammonia -oxidizing bacteria AOBcommunity in a nitrifying suspension tower for biochemical flocculation process, using PCR -DGGE technique. The change in systematic AOB community structure was examined under the regulation of aeration strength and hydraulic residence time RHT. The biofilm sampleswere takendirectly from a nitrifying filler tower. MDS was used for the analysisof DGGE electrophoretogram, and the results were displayed by 2 -D pattern. The results show that the aeration strength and RHT have a certaineffect on AOB community. The main AOB strains remain unchanged in the process of running. Keywords polyase chain reaction, concentration gradient of gel electrophoresis and AOB THE FUNCTION OF PROTOZOA SARCODINA AS NITRIFICATION INDICATOR IN THE PROCESS OF SEQUENCING BATCH REACTORDing Guoji Li Jun 13 Abstract The analysis of relationship between the density of Sarcodina and the nitrification ratio in the process of sequencing batch reactor SBR under the control of aeration showed that Arcella gibbosa, Arcella vulgaris and Pyxidicula operculata were good nitrification indicator. However, A. gibbosa and A. vulgaris were better than P. operculata as the nitrification indicator considering the relativity with nitrification ratio and the convenience of observation. Keywords SBR process, Sarcodina, nitrification and indicator PRIMARY STUDY ON PHYTOREMEDY OF CONTAMINATED WATERWITH PCOPs Wan Dajuan Chen Xian Jia Xiaoshan 16 Abstract Phytoremediation of contaminated water with PCOPs 1, 2, 4-TCB and pp ′ -DDTwere studied by the of water -culture medium. Results showed that ryegrass could absorb and degrade 1, 2, 4 -TCB and pp′ -DDT, reduce the content of PCOPs in water. The growth of ryegrass was affected by the variety and concentration of PCOPs. The absorption capability of ryegrass inwater was lower than in soil. Keywords plant, absorb, degrade, water and PCOPs EFFECTS OF PLANT SELECTIONON THE NITROBACTERIA DENSITY IN RHIZOSPHERE AND NITROGEN REMOVAL IN CONSTRUCTED WETLANDS Zhou Wei Huang Minsheng Nian Yuegang 18 Abstract Effects of plant selection on the nitrobacteria density in rhizosphere and nitrogen removal in constructed wetlands had been presented. Experimental results showed that there were very high density of nitrobacteria in the rhizospheres of wetlands planted with Zizania caduciflora, Scirpus validus, Iris pseudacorus under appropriate DO and pH conditions. Nitrobacteria density in the rhizosphere is always higher than that in the substrate of the wetlands which is due to the difference of DO levels. And the nitrogen removal efficiencies are related positively to the nitrobacteria density and water temperature, which indicates nitration of microbes and assimilation of the plants played important roles in the nitrogen removal of wetlands. Keywords constructed wetlands, rhizosphere, ntrobacteria, nitrogen removal and experimentation DEGRADATIONOFORGANOCHLORINEPESTICIDESINAMERICANGINSENGBY BIOLOGICAL WAYWang Likun Pang Jinzhao Liu Wenzhi et al 21 Abstract The bacterial strain which can degrade organochlorine pesticideswith high effect was isolatedfrom soil planted American ginseng. The solid preparation made by the strain applies to field experiments via three -year -old ginseng in one year, indicating the degradation rate of the strain for total amount of BHC up to 36. 27～ 49. 90, the degradation rate of the strain for total amount of DDT up to 25. 19～ 35. 61. Keywords organochlorine pesticides, degrading bacterium and American ginseng EXPERIMENT ON THE COUPLING BIOREACTOR FOR THE DOMESTIC WASTEWATER TREATMENT OF LOW C N RATIO IN DIFFERENT OPERATING MODES Li Jun Zhang Ning Yang Haiyan et al 23 2 ENVIRONMENTAL ENGINEERING Vol. 24,No. 3, Jun. , 2006