高效液相色谱-质谱法测定不同产地不同部位烟叶中茄尼醇_柳先平.pdf

第 26 卷第 2 期 2007 年 4 月 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 26，No． 2 April， 2007 文章编号 0254- 5357 2007 02- 0105- 04 高效液相色谱 － 质谱法测定不同产地不同部位烟叶中茄尼醇 柳先平1，陈军辉2，李磊1，王小如1*，黎先春1 1． 国家海洋局第一海洋研究所，青岛市现代分析技术及中药标准化重点实验室，山东 青岛266061; 2． 中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛266003 摘要 对不同产地、 不同品种和不同部位烟叶中茄尼醇的含量进行测定比较， 以考察烟叶产 地、 品种及部位与茄尼醇含量的关系。烟叶样品进行皂化及超声提取处理后， 采用反相高效液相色 谱法 RP －HPLC 、 大气压化学电离质谱法 APCI － MS 进行定性、 定量测定。方法测定茄尼醇的 线性范围为41．2 ～6180 ng 相关系数为0．9999 ， 0．412 g/L 的茄尼醇标准溶液 5 次重复测定的保 留时间的精密度 RSD 为0．08， 峰面积的精密度为0．20; 方法回收率为83．1 ～103．9， 波长 211 nm 处的检测限为3．72 ng。样品测定结果显示， 不同部位烟叶的茄尼醇生产能力明显不同， 同 一烟叶自上而下各部位中茄尼醇含量逐渐降低， 烟梗中茄尼醇含量极低。在以烟叶为原料生产茄 尼醇时， 应去除烟梗; 并考虑选择烟叶中茄尼醇含量高的产区作为原料供应基地。 关键词 茄尼醇; 高效液相色谱 － 质谱法; 烟叶 中图分类号 O632． 31; O657． 72文献标识码 B 收稿日期 2006- 05- 18; 修订日期 2006- 07- 28 基金项目 青岛 “2004 将才计划” 资助项目 04 －3 － J． J －11 作者简介 柳先平 1972- ， 女， 山东即墨市人， 在读硕士研究生， 主要从事海洋化学及天然产物分析。 E- mail xianpingliu126． com。 通讯作者 王小如 1949- ， 女， 辽宁大连市人， 教授， 博士生导师。E- mail mt2elp fio． org． cn。 Determination of Solanesol in Different Parts of Tobacco Leaves from Different Breeds and Planting Areas by High Perance Liquid Chromatography- Mass Spectrometry LIU Xian- ping1，CHEN Jun- hui2，LI Lei1，WANG Xiao- ru1*，LI Xian- chun1 1． Qingdao Key Laboratory on Analytical Technology Development and Standardization of Chinese Medicines，First Institute Oceanography，State Oceanic Administration Peoples Republic of China，Qingdao266061，China; 2． College of Chemistry and Chemical Engineering，Ocean University of China，Qingdao266003，China Abstract In this article，the contents of solanesol in different parts of tobacco leaves，from different breeds and different planting areas were determined． The solanesol was extracted from tobacco leaves via saponification and ultrasonic- assist extraction and determined by RP- HPLC and APCI- MS with linear range of 41． 2 ～ 6 180 ng R20． 9999 ． The precision of the retention time is 0． 08 RSD n 5 and the precision of the peak area determination is 0． 20RSD n 5 ． The recovery of the is 83． 1 ～103． 9 with the detection limit of 3． 72 ng at 211 nm for solanesol． The results indicate that the contents of solanesol in different parts of tobacco leaves are distinctly different． The content of solanesol in a single tobacco leave drops from the top part to the nether part． The content of solanesol in the peduncle is very low． In order to increase the production and cut the cost，the tobacco leaves with higher solanesol should be selected for solanesol production． Key words solanesol; high perance liquid chromatography- mass spectrometry; tobacco leave 501 ChaoXing 茄尼醇 Solanesol 是一种不饱和聚异戊二烯 醇， 属萜类化合物， 相对分子质量为 631。纯的茄 尼醇为白色或淡黄色蜡状固体， 易溶于正己烷、 丙 酮、 汽油等有机溶剂， 难溶于水。茄尼醇以游离态 和化合态形式广泛存在于高等植物、 哺乳动物和微 生物体内， 化合态的茄尼醇主要以脂肪酸的形式存 在。茄尼醇吸收自由基的功能较强， 具有抗菌、 消 炎、 止血的功效和较强的抗癌生物活性， 是合成治 疗心血管病、 癌症和溃疡等药物的中间体， 是泛醌 类药物合成不可替代的关键中间体， 即辅酶 Q10和 维生素 K2的侧链， 在医药工业上应用十分广泛。 由于茄尼醇是长链半萜烯醇化合物， 合成难度很 大， 目前只能依赖于从植物叶中提取。烟草是获得茄 尼醇的主要来源， 其中茄尼醇的含量 质量分数 w 大 致在0．3 ～3［ 1 －2 ］。从烟叶中提取茄尼醇的研究较 多， 皂化、 萃取等提取方法均较成熟 ［ 3 －4 ］。茄尼醇的 分析测定主要采用正相液相色谱法 ［ 5 －6 ］， 也有报道用 气相色谱法 ［ 7 －8 ］和薄层色谱法［ 9 －10 ］。正相液相色谱 法检测结果准确、 重现性好， 是分析检测茄尼醇较为 常用的方法。武永昆等 ［ 11 ］研究利用反相高效液相色 谱法 HPLC 测定烟叶提取物中茄尼醇的含量， 认为 该方法操作简便， 灵敏度高， 基线平稳， 更适合于茄尼 醇的测定研究。本文利用反相 HPLC －质谱法测定不 同产地、 不同品种及不同部位烟叶中茄尼醇的含量， 为工业生产茄尼醇提供很好的原料分析数据。 1实验部分 1． 1仪器及测定条件 Agilent 1100 液相色谱仪、 VWD 检测器、 Agilent 1100 LC/MSD 液相色谱 － 质谱 单级四极杆 联用 仪 美国 Agilent 公司 ; AS 5150A 超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 ， TurboVapⅡ氮气 浓缩工作站 美国 Caliper Life Science 公司 。 色谱条件 Alltima C8色谱柱 4． 6 mm 250 mm， 大连依利特分析仪器有限公司 ; 流动相 V甲醇∶ V水98 ∶ 2， 流速1．0 mL/min， 检测波长211 nm。 质谱条件 大气压化学电离 APCI 源， 正离子 模式检测， 破碎 Fragmentor 电压 120 V， 毛细管电 压3000 V， 雾化室温度350℃， 喷雾气压1． 72 105 Pa 25 psi ， 干燥气 N2 流速 4． 0 L/min， 干燥气体 温度 300 ℃， 电晕放电电流 4． 0 mA， 全扫描 Full Scan 质荷比范围为 m/z 250 ～700。 1． 2主要试剂与原料 甲醇 色谱纯， 德国 Merck 公司 ， 正己烷、 乙醇、 KOH 均为分析纯; 茄尼醇标准品 纯度 w 为 98， 美国 Sigma 公司 ; 实验中所用溶液均用超纯 水配制， HPLC 用所有试剂均经过 0． 45 μm 微孔滤 膜过滤及超声脱气处理。 1． 3标准溶液的配制 准确称取茄尼醇标准品10．3 mg， 置于25 mL 容 量瓶中， 用甲醇定容至25 mL， 得到浓度为0．412 g/L 的茄尼醇标准储备液。取少量茄尼醇标准储备液， 用0．45 μm 针管式微孔滤膜过滤后备用。 1． 4供试品溶液的制备 准确称取干燥至恒重的烟叶/烟梗2 g， 置于100 mL 烧杯中， 加入乙醇 20 mL， 烟叶加入 KOH 0． 4 g， 烟梗加入 KOH 0．2 g， 置于水浴锅中 60℃恒温加热 回流4 h， 冷却至室温， 抽滤， 滤液置于分液漏斗中， 用正己烷萃取4 次 正己烷用量分别为20、 20、 15、 15 mL ; 滤渣中加入 20 mL 正己烷， 超声波提取两次 20 min/次 。将各次正己烷萃取液、 提取液合并， 置于氮气吹扫浓缩仪中浓缩至干， 用甲醇溶解并定 容至25 mL， 0．45 μm 微孔滤膜过滤后待测。 2结果与讨论 2． 1定性分析 根据色谱峰保留时间及质谱分析进行定性。 按 1． 1 节色谱条件测定标准品及烟叶提取物的色 谱图， 并将烟叶提取物测定的色谱图与相应的已知 标准品色谱图进行比较印证， 以确定茄尼醇的相应 峰位。如图 1 所示， 在本文选定的色谱条件下， 茄 尼醇色谱峰对称性好， 与其他组分达到基线分离， 可准确测定其峰面积。 图 1茄尼醇标准品及烟叶提取物色谱图 Fig． 1Chromatograms of solanesol standard and solanesol extracted from tobacco leaves 601 第 2 期 岩矿测试 http ∥ykcs． i3t． com． cn/ 2007 年 ChaoXing 用 APCI 电离源， 在正离子模式下扫描得到茄 尼醇标准品及烟叶提取物的质谱图。对比分析茄 尼醇标准品及烟叶提取物的质谱图， 质荷比 m/z 613． 5 的离子峰是茄尼醇分子 相对分子质量为 631 失去一个水分子、 添加一个 H 形成的离子 峰。在 1． 1 节质谱检测条件下茄尼醇分子没有其 他的离子峰形成 图 2 。 图 2茄尼醇质谱图 Fig． 2APCI- MS spectrum of solanesol 2． 2标准曲线的线性范围 采用外标法对烟叶中茄尼醇进行定量分析， 用 色谱峰面积对质量作图绘制工作曲线， 由试样色谱 峰面积求出其实际含量。 按 1． 1 节色谱条件， 取少量茄尼醇标准储备液 用自动进样器进样 0． 1、 0． 2、 0． 6、 1． 5、 5． 0、 15 μL， 相应进样量为 41． 2、 82． 4、 247． 2、 618、 2060、 6180 ng， 以测定的峰面积 AP 为横坐标、 标准品中茄尼 醇的质量 m/ng 为纵坐标绘制标准曲线， 线性回 归方程为 AP 0． 000 1m 0． 004 6， 相关系数为 0． 9999， 说明本方法测定茄尼醇含量在 41． 2 ～ 6180 ng线性关系良好。 2． 3精密度 按 1． 1 节实验色谱条件， 取一定量的 0． 412 g/L茄尼醇标准储备液， 5 次重复测定茄尼醇保留 时间和峰面积 进样量为 0． 4 μL ， 计算获得保留 时间的精密度 RSD 为 0． 08， 峰面积的精密度 为 0． 20， 表明用本方法检测茄尼醇精密度较高。 2． 4稳定性和重现性 准确吸取供试品溶液， 按 1． 1 节液相色谱条 件， 分别在 0、 24、 48、 72、 96、 148 h 进样测定， 结果 显示， 测得的茄尼醇峰面积和保留时间在 148 h 内 无明显变化， 峰面积和保留时间的精密度 RSD 分 别为 0． 96和 0． 44， 说明样品溶液在 148 h 内 其化学性质稳定。 准确称取同一样品 6 份， 按 1． 4 节方法处理将 其制成供试品溶液， 分别进样测定各色谱峰的保留 时间和峰面积 表 1 ， 计算获得保留时间的精密 度 RSD 为 0． 30， 峰面积的精密度为 1． 54， 表明方法重现性良好。 2． 5回收率 准确称取已知含量的同一烟叶样品 6 份， 分别 加入一定量的茄尼醇标准品， 按 1． 4 节供试品溶液 制备方法处理， 用1．1 节色谱条件测定加标回收率。 表2 结果表明， 方法回收率为83．1 ～103．9。 表 1方法的重现性 Table 1The repeatability test of the 样品 编号 保留时间 tR/min 峰面积 AP 样品 编号 保留时间 tR/min 峰面积 AP 19．20184．349．22192．3 29．16186．559．19188．0 39．21185．669．15189．5 表 2茄尼醇加标回收率试验 Table 2Recovery test for solanesol 样品 编号 m茄尼醇/mg 样品含量加入量测定值 回收率 R/ 112．03．0115．05101．3 212．02．8514．96103．9 37．503．5410．9597．5 47．353．0010．2897．7 53．803．527．2999．1 63．803．316．5583．1 2． 6检测限 将标准溶液稀释进样， 测定其峰高响应值及基 线噪音强度， 以三倍信噪比计算检测限， 获得检测 波长为 211 nm 时的检测限为 3． 72 ng。 3实际样品分析 取不同产地、 不同部位的烟叶和烟梗样品， 按 1． 4 节处理方法将其制备成供试品溶液， 测定茄尼 醇的峰面积， 代入回归方程计算茄尼醇的含量。 3． 1不同产地烟叶中茄尼醇含量的测定 表 3 结果显示， 5 个产地烟叶中茄尼醇含量 差异明显， 山东胶南产烟叶中茄尼醇的含量最高 1． 30 ， 而福建产烟叶中茄尼醇的含量较低， 仅 为 0． 57， 胶南产烟叶中茄尼醇的含量是福建产 烟叶的 2． 28 倍。说明烟叶产地对烟叶中茄尼醇含 量有影响， 在以烟叶为原料生产茄尼醇时， 应选择 701 第 2 期柳先平等 高效液相色谱 － 质谱法测定不同产地不同部位烟叶中茄尼醇第 26 卷 ChaoXing 茄尼醇含量高的烟叶为生产基料。 表 3不同产地烟叶样品中茄尼醇的含量① Table 3Contents of solanesol in tabacoo leaves from different planting areas 样品 编号 产地 w茄尼醇/RSD/ 样品 编号 产地 w茄尼醇/RSD/ 1山东胶南1．302．424山东莱西0．841．81 2山东烟台1．251．965福建0．573．09 3山东平度0．962．97 ① 测定次数 n 3。 3． 2不同部位烟叶中茄尼醇含量的测定 表4 结果表明， 茄尼醇含量在1．06以上的均是 上部烟叶; 中部烟叶茄尼醇含量为 0． 408 ～ 0．638; 下部烟叶茄尼醇含量为 0． 204 ～0．409; 烟梗中茄尼醇含量在 0． 0025 ～0． 1410。显示烟 叶的不同部位对茄尼醇的富集或生产能力明显不同， 上部烟叶的茄尼醇含量最高， 中部、 下部烟叶的茄尼 醇含量依次降低， 烟梗最低。K326、 云烟85 两个品种 的烟叶中茄尼醇含量差异不大， 说明同一区域这两个 品种烟叶的茄尼醇生产能力相当。 表 4不同部位烟叶样品中茄尼醇的含量① Table 4Contents of solanesol in tobacco leaves from different plant parts 样品 编号 产地 w烟叶/ 上叶中叶下叶 w烟梗/ 上梗中梗下梗 K326 －1福建永安1．170．5010．4090．06560．01040．0074 K326 －2福建宁化1．060．4270．3270．02300．01220．0025 K326 －3福建邵武1．260．4080．2670．14100．0133ND 云烟85 －1 福建邵武1．210．6340．2040．02240．01040．0084 云烟85 －2 福建邵武1．500．6380．3400．12100．02930．0108 ① 测定次数 n 3; ND 表示未检出。 4结语 本文所用样品前处理方法简便易操作， 具有良 好的重现性和稳定性， 采用 C8色谱柱高效液相色 谱法分离测定烟叶中茄尼醇， 选用甲醇/水作为流 动相， 茄尼醇易与其他干扰组分分离， 且保留时间 较短， 可作为烟叶中茄尼醇含量的监测方法及用于 茄尼醇产品的质量控制。 对不同产地、 不同部位烟叶中茄尼醇的含量进 行分析研究， 发现产地对烟叶中茄尼醇含量影响明 显。我国是烟叶生产大国， 南方和北方地区均有大 面积种植， 区域差异较大， 在以烟叶为原料生产茄尼 醇时， 应选择茄尼醇含量高的烟叶为生产基料， 烟梗 基本应予以去除， 节省试剂和生产时间， 同时考虑选 择烟叶中茄尼醇含量高的产区作为原料供应基地。 致谢 衷心感谢青岛崂山区生物医药研发测 试中心、 厦门市倍尔思生化科技有限公司及厦门市 烟草专卖局对本工作的大力支持和帮助。 5参考文献 ［ 1］陶云海， 任周阳， 刘国清， 等． 云南废次烟叶茄尼醇的 提取及含量测定［J］ ． 云南大学学报， 2002， 24 2 151 －152． ［ 2］王非， 郑珩， 余永柱， 等． 高纯度茄尼醇的现状与市场 前景［ J］ ． 精细化工原料及中间体， 2005 6 12 －14． ［ 3］岑波， 段文贵， 赵树凯． 从废次烟草中提取茄尼醇的 新工艺研究［ J］ ． 广西大学学报 自然科学版， 2002， 27 3 240 －242． ［ 4］段文贵， 陈小鹏， 安鑫南． 从烟草中提取茄尼醇的 方法［ J］ ． 林产化工通讯， 2004， 34 2 21 －25． ［ 5］赵瑾， 王超杰， 孙心齐． 高效液相色谱法测定烟叶中 茄尼醇的含量［ J］ ． 色谱， 1997， 15 6 544 －545． ［ 6］张明时， 黄俊学． 高效液相色谱法测定烟叶提取物中 茄尼醇的含量［ J］ ． 色谱， 2001， 19 5 470 －471． ［ 7］Chaberlain W J，Severson R F，Chortyk O T，et al． Determination of Solanesol in Tobacco by Capillary Gas Chromatography［J］ ． Journal of Chromatography A， 1990， 513 55 －60． ［ 8］Severson R F，Ellington J J，Schlotzhauer P F，et al． Gas Chromatographic for the Determination of Free and Total Solanesol in Tobacco［J］ ． Journal of Chromatography A， 1977， 139 2 269 －282． ［ 9］刘快之， 李德亮， 陈伯森， 等． 薄层分离 － 库仑滴定法 测定茄尼醇［ J］ ． 分析化学， 1999， 27 1 34 －37． ［ 10］ Woollen B H，Jones D H． Analytical s for To- bacco Lipids 1- A Rapid for the Estimation of Solanesol by Thin- layer Densitometry［J］ ． Journal of Chromatography A， 1971， 61 180 －182． ［ 11］ 武永昆， 张征， 苏鹏娟， 等． 反相高效液相色谱法测 定烟叶中茄尼醇的含量［J］ ． 云南民族大学学报 自然科学版， 2005， 14 3 275 －277． 801 第 2 期 岩矿测试 http ∥ykcs． i3t． com． cn/ 2007 年 ChaoXing