氨氮污染源区包气带剖面微生物生态分布特征的研究_程雅楠.pdf

2013 年 4 月 April 2013 岩矿测试 ROCK AND MINERAL ANALYSIS Vol． 32，No． 2 296 ～305 收稿日期 2012 －03 －07; 接受日期 2012 －07 －24 基金项目 国家自然科学基金项目面上基金 51078338 ; 中央高校基本科研业务费自由探索项目 2010ZY05 作者简介 程雅楠， 硕士研究生， 从事地下水及土壤污染微生物修复技术研究。E- mail ptinny_5696163． com。 通讯作者 陈鸿汉， 教授， 主要从事地下水科学与环境工程教学与科研工作。E- mail chenhonghan cugb． edu． cn。 文章编号 02545357 2013 02029610 氨氮污染源区包气带剖面微生物生态分布特征的研究 程雅楠1， 2，关翔宇1，曲文龙3，陈鸿汉1*，刘菲1，谢宇轩1，朱玲玲1 1． 水资源与环境工程北京市重点实验室，中国地质大学 北京 ，北京100083; 2． 中交铁道勘察设计院有限公司，北京100088; 3． 沈阳水务集团，辽宁 沈阳 110003 摘要 包气带土壤中氨氮污染迁移规律已成为近年来国内外学者研究的重点， 目前在氨氮污染迁移规律研 究中采用柱实验模拟以及软件模拟的方法较多， 土壤生物技术则广泛应用于污染物降解领域， 而在污染物迁 移规律研究中应用较少。本文采用变性梯度凝胶电泳 DGGE 技术、 16S rRNA 序列分析技术以及典范对应 分析相结合， 对华北平原 3 个典型氨氮污染区土壤表层至包气带剖面微环境的细菌垂直分布特征及群落结 构进行研究。结合污染区土壤理化性质分析， 认为包气带土壤剖面的细菌群落中存在着与氮循环、 硫酸盐代 谢等过程偶联的优势细菌类群， 说明土壤微环境中细菌群落分布明显受氨态氮、 硝态氮、 亚硝态氮和硫酸盐 的分布影响， 进一步表明污染土壤优势菌群的群落结构信息是描述包气带土壤环境氨氮污染物迁移规律的 重要参数。 关键词 包气带; 氨氮污染; 微生物群落; 变性梯度凝胶电泳; 16S rRNA 中图分类号 S151． 93; X820． 4文献标识码 A 包气带作为全球生物地球化学循环的重要地质 介质， 对地下水生态系统影响显著 ［1 ］， 其理化因素 的空间特异性能够使相应土壤环境中微生物群落发 生改变， 进而影响氨氮污染物在包气带土壤生态系 统中的运移， 以及氨氮污染降解菌的分布 ［2 ］。近年 来， 现有的物理化学技术对处理大面积的土体和地 下水污染已不具优势， 污染土壤生态环境的研究重 点已开始转向分子生物修复领域。采用 PVA1799 冷冻改良技术固定的优势菌群， 能够使浓度为 565 mg/L 的苯酚去除率达到 94 以上 ［3 ］。在硝化性能 明显的氮污染土壤中分离得到的一种微生物 Bacillus sp． LY 能够在有机物去除的同时， 将氨氮 转化为氮气， 并能以多种有机污染物［ 包括壬基酚 聚氧乙烯醚 NPEOs 、 邻苯二酚及苯酚等］为唯一 碳源生长， 是新型高效生物脱氮联合去除有机污染 物技术的重要突破 ［4 ］。土壤环境中分离出具有特 殊作 用 的 微 生 物，一 株 鉴 定 为 Ochrobactrum intermedium DN2 的烟碱降解细菌经证实， 能够去除 或减少烟草废弃物中烟碱 ［5 ］。在苯乙酸废水污染 的高盐土壤分离出的中度嗜盐菌 Halomonas sp． BYS －1 中分离提取的耐盐基因片段， 为耐盐遗传机 制的研究提供了高质量实验材料， 在盐污染土壤治 理中得到有效利用 ［6 ］。 反渗透等物理方法以及化学还原脱氮法是去除 包气带土壤氨氮污染的传统方法。但是， 这些方法 并非完全将硝酸盐降解为无毒的气态氮化合物和氮 气， 仅为硝酸盐的转移， 还会产生二次污染问题。近 年来， 生物脱氮技术尤其是分子生物技术在土壤氨 氮污染去除中逐渐得到关注。变性梯度凝胶电泳 简称 DGGE 技术能够直接利用 DNA 及 DNA 对微 生物遗传特性进行表征， 不但避免了耗时的传统菌 种分离， 更可鉴定出无法利用传统方法分离的菌种， 它的分辨精度相比琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝 胶电泳更加精确， 可以检测到一个核苷酸水平的差 异 ［7 ］。DGGE 胶体图谱中出现的可见条带， 分别代 表土壤样品中优势细菌 16S rRNA 的目的片段， 条 带的数量反映出细菌群落组成中的优势群体的数 量， 条带的强度代表细菌种群中细菌的含量， 与模板 692 ChaoXing DNA 片段含量成正比 ［8 ］。然而该技术的缺点在于， 胶体条带的分辨率影响部分条带的生物信息， 不能 获取到全部的样品微生物信息。此外 16S rRNA 克 隆文库分析也是有效鉴定样品微生物分子生物技 术， 该方法能够详细地揭示样本中微生物的多样性， 能够将样品微生物分类鉴定至种的水平。具体过程 是将总 DNA 由样本中提取出， 应用通用引物对其进 行16S rRNA基因的扩增， 进而建立基因克隆文库， 再以限制性内切酶对其进行酶切自由， 通过对其 16S rRNA基因酶切图谱的分析鉴定微生物的具体 分类， 得到微生物群落多样性的信息。 针对 DGGE 技术有限分辨率造成的信息缺失 以及克隆文库分析的覆盖范围局限， 本文将 DGGE 技术与克隆序列结合， 对微生物群落丰富度的差异 进行深层研究， 同时通过典范对应分析对污染源区 微生物群落多样性及生态分布特征进行评估， 以期 揭示氨氮污染源区包气带土壤理化性质对其细菌群 落结构的塑造作用， 为通过细菌生态系统变化反映 污染物在包气带中的分布和迁移规律提供理论 依据。 1实验部分 1． 1仪器和装置 PCR 扩增仪 CFX9， 美国 Bio － rad 公司 ， 凝胶 成像分析系统 GelDoc XR， 美国 Bio － rad 公司 ， 变 性梯度凝胶电泳仪 DCode， 美国 Bio － rad 公司 ， 琼 脂糖凝胶电泳仪 DYCP － 44P， 北京六一仪器生产 公司 ， 小型高速台式离心机 5418 型， 德国 Eppdorf 公司 ， 高速冷冻离心机 3K30， 美国 Sigma 公司 ， － 80℃ 冰箱 美国 Thermo Electron Corporation 公 司 ， 高温高压灭菌锅 LDZM － 60KCS， 上海医疗器 械厂 ，旋 涡 混 合 器 Vortex － Genie 2T，美 国 Scientific Industries 公司 ， 洁净工作台 SW － CJ － 1FD， 苏州安泰 ， 恒温摇床 THZ － 82A 型， 苏州威 尔 ， 电热恒温水槽 DK8D， 上海风棱 ， 电热恒温培 养箱 DNP － 9052， 苏 州 威 尔 ， 电 子 分 析 天 平 AL204， 美国梅特勒公司 ， 哈纳多参数测定仪 HI8320 型， 意大利 Hanna 公司 。 1． 2主要试剂 去离子水 Millipore 纯化柱 ， 丙烯酰胺 纯度 ＞99． 0， 美国 Sigma 公司 ， 双丙烯酰胺 纯度 ≥99． 9，美 国 Promega 公 司 ，尿 素 纯 度 ≥99．5， 美国 Sigma 公司 ， Tris 碱 纯度≥99．9， 美国 Promega 公司 ， EDTA 二钠 EDTA － Na22H2 O， 纯度≥99． 9， 美国 Promega 公司 ， 去离子甲酰 胺 纯度 ＞99． 5， 美国 Amresco 公司 ， 甲酰胺 纯 度 ＞ 99． 5， 美国 Amresco 公司 ， TEMED 纯度≥ 99， 美国 Sigma 公司 ， 过硫酸铵 纯度≥99. 9， 美国 Promega 公司 ， CTAB 生化级， 纯度≥99. 0， 美国 Sigma 公司 。 乙酸 分析纯， 纯度≥99. 5 ， 乙醇 分析纯， 纯度≥99. 7 ， NaOH 分析纯， 纯度≥99. 5 ， 甲醛 分析纯， 纯度≥99. 5 ， NaCl 分析纯， 纯度 ≥99. 5 ， Na2HPO4 分 析 纯， 纯 度 ≥ 99. 5 ， KH2PO4 分析纯， 纯度≥99. 5 这些试剂均购自 北京化学试剂公司。 EB 10 mg/mL 母 液， 上 海 生 工 生 物 有 限 公司 ， FastDNA Spin Kit for Soil 美国公司 ， DNA 胶回收试剂盒 北京天根生化科技有限公司 。 Tris － 盐酸溶液 1 mol/L， pH 8. 0 称取 Tris 碱 6. 06 g， 加超纯水40 mL 溶解， 滴加浓盐酸约2. 1 mL 调 pH 至 8. 0， 定容至 50 mL。 EDTA 0. 5 mol/L， pH 8. 0 称取 9. 306 g 的 EDTA 二钠， 加超纯水 35 mL， 剧烈搅拌， 用约 1 g NaOH 颗粒调 pH 至 8. 0， 定容至 50 mL。 TAE 50 缓冲液 Tris － HCl 2 mol/L， CTAB 50 mmol/L， EDTA 0. 5 mol/L， pH 8. 0 20 mmol/L。 PBS 缓冲液 0. 01 mol/L， pH 7. 4 配方 NaCl 8 g/L， KCl 0. 2 g/L， Na2HPO41. 44 g/L， KH2PO4 0. 24 g/L。 TE 1 缓冲液 1 mol/L Tris － HCl pH 8. 0 1 mL， 0. 5 mmol/L EDTA 0. 5 mol/L， pH 8. 0 0. 2 mL。超纯水定容至 100 mL。 1． 3场地概况与样品采集 采样区位于华北平原温榆河畔与北京城区之 间， 区域平均海拔约 20 m， 上覆厚度为 10 ～15 m 黏 土层， 含水层为 4 ～ 10 m， 具体由埋深 0 ～ 2 m 的杂 性土壤层、 埋深为 2 ～10 m 的粉质黏土夹粉土层以 及埋深为 10 ～25 m 的粉砂 － 细沙层组成。取样区 域单层含水层厚度一般小于 5 m， 部分地区可大于 5 m， 累计厚度在 20 m 左右， 局部地段大于 30 m， 整 体渗透系数在 30 ～ 50 m/d 之间。土壤样品的采集 点 T1、 T2 和 T3 地处东经 11633， 北纬 3959范 围内， T1 位点位于靠近城区的生活潜在污染区， T2 位点位于市郊果蔬种植场地， T3 位点为靠近温榆河 岸及垃圾填埋厂的污染区域。 792 第 2 期程雅楠， 等 氨氮污染源区包气带剖面微生物生态分布特征的研究第 32 卷 ChaoXing 各站点土壤的野外采集完成后， 迅速将样品统 一置于无菌盒中， 贴好标签密封， 返回实验室后置于 －70℃超低温冰箱内长期保存， 用于后续微生物计 数和核酸提取。 1． 4样品环境因子测定 土壤样品 pH 值及电导率等参数利用哈纳多 HI8320 参数测定仪进行现场测定， 颗粒组成、 土壤 含水率、 三氮含量及其他化学成分由后期实验测定， 其他具体理化参数测定遵循表 1 所列的标准方法。 表 1土壤样品环境因子测定方法 Table 1Determination of environmental factors in soil samples 测试项目测试方法测试项目测试方法 土壤含水量质量法硝态氮、 总氮紫外分光光度法 pH 值电化学分析法 亚硝态氮 N － 1 － 萘基 － 乙二胺光度法 氧化还原电位电位法 颗粒组成比重计法 阳离子 电感耦合等离子体 发射光谱法 铵态氮纳氏比色法其他阴离子离子色谱法 1． 5荧光染料 DAPI 计数 取 0. 5 g 冻存土样和 3. 5 mL 无菌水， 用匀浆器 充分混匀， 再加 1. 5 mL 含有 0. 05 TritonX － 100 的 3 PBS 缓 冲 液， 750 g 离 心 1 min 约 2500 r/min ， 取 1 mL 上清液， 与 3 mL 4 多聚甲醛均匀 混合， 4℃放置过夜以固定细胞。1 mL 细胞固定液 中加染料 DAPI 至终浓度为 200 ng/mL， 染色 10 min 后用细菌滤器过滤， 使菌体集中在 0. 22 μm 聚碳酸 滤膜 Waterman 滤膜 上， 取下滤膜置于载玻片上迅 速进行镜检。随机计数 10 个视野中的菌体个数取 平均值， 计算出每克土样中菌体细胞总数 ［9 －10 ］。 1． 6样品中总 DNA 提取及细菌 16S rRNA － V3 可变区片段的扩增 取 5 g 冻存样品装入 10 mL 离心管中， 加入 4 mL裂解缓冲液［ 3 CTAB， 100 mmol/L Tris － 盐 酸 pH 8. 0 ， 100 mmol/L EDTA pH 8. 0 ， 1. 4 mol/L NaCl， 2 β 巯基乙醇 V/V ， 1 PVP］ ， 充分 研磨， 旋涡振荡仪剧烈振荡， 尽量使沉积物悬浮于裂 解缓冲液中。加入蛋白酶 K 至终浓度 1 mg/mL， 55℃温浴 1 h， 其间每 15 min 补充一次蛋白酶 K。 将裂解后的上清液分装到4 个1. 5 mL 离心管中， 加 入等体积的氯仿 － 异戊醇 体积比 24 ∶ 1 ， 以 12000 g 转速 4℃离心 10 min， 抽提两次。取上清液 加 1/10 体积 3 mol/L 醋酸钠和预冷的等体积异丙 醇， 于 －20℃放置 1 h 后以 12000 g 的转速 4℃离心 15 min， 弃上清液， 剩余沉淀用 1 mL 70 乙醇洗涤 一次， 自然干燥， 用 50 μL 1 TE 缓冲液 pH 8. 0 溶解沉淀 ［11 ］。 利用 16S rRNA － V3 区引物 341F/534R 扩增样 品 DNA 序列， 上游引物 341F 包括一段 5＇黏性末端 连接 GC 夹子结构的前导区， 具体序列成分见表 2［12 ］。PCR 反 应 体 系 为 DNA 模 板 1 μL; 引 物 10 pmol; TaqDNA 聚 合 酶 1U; 2. 5 mol/L dNTP， 4 μL; 5 PCR缓冲液， 10 μL; Mg2 溶液 1. 6 μL; 去 离子水补至 50 μL。PCR 反应条件为 95℃ 预变性 4 min， 然后 94℃变性 30 s， 55℃退火 30 s 和 72℃延 伸1 min， 共 35 个循环， 最后 72℃延伸 10 min。PCR 反应产物用 1. 2 琼脂糖凝胶电泳检测， 得到的 PCR 产物利用产物纯化试剂盒 北京天根生化科技 有限公司 进行纯化。 表 2引物序列 Table 2Primer sequence 引物序列 341F5 － CCTACGGGAGGCAGCAG －3 534R5 － ATTACCGCGGCTGCTGG －3 341F － GC 5 － CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG －3 M13 －475 － TAATACGACTCACTATAGGGC －3 RV － M5 － ATTTAGGTGACACTATAGAAT ACTC －3 1． 7细菌 16S rRNA V3 可变区片段的 DGGE 分离 与聚类分析 将 40 μL 的 16S rRNA － V3 区 PCR 胶回收产 物， 用变性梯度凝胶电泳仪 D － Code system，BIO － RAD，Hercules，CA，USA 进行 DGGE 分离。 PAGE 胶浓度为 8， 变性梯度 30 ～ 60， 60℃， 80 V 电 压， 1 TAE 20 mmol/L Tris 基 质， 10 mmol/L醋酸钠， 0. 5 mmol/L EDTA 缓冲液中运行 13 h。电泳后 EB 染色30 min， 置于凝胶成像仪紫外 光下检测并照相。 利用 NTsys 软件对 DGGE 凝胶电泳胶体上条带 位置及条带亮度进行测定 ［13 ］， 对 DGGE 条带分离出 的优势菌群进行 UPGMA 聚类及丰度分析， 得到以 皮尔森相似度为基础的聚类分析结果， 并通过离差 平方和法绘制聚类树状图。聚类树状图中， 纵轴站 点两个对象延长线交线垂直于横轴相似系数， 对应 横轴上的数据即为两者之间的相似度。同样， 4 个 层位延长线与另外 4 个层位延长线的垂直交线对应 数据， 即为两站点间的相似程度。 892 第 2 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 1. 8细菌 16S rRNA － V3 区序列的克隆和测序 紫外灯下对成型的 DGGE 凝胶进行检测， 将紫 外光激发下可见的凝胶条带切下， 用去离子水冲洗 3 次后， 浸入 50 μL 去离子水中， 4℃ 过夜沉淀。取 各样品浸出液 2 μL 为模板再次进行 PCR 扩增， 二 次 PCR 产物经胶回收试剂盒纯化后， 连接到 PMD18 － T 载体 TAKARA， 大连 上， 经热激法转化到大肠 杆菌 TOP10 细胞中， 涂布含有 Amp/X － Gal /IPTG 的 LB 平板， 37℃静置培养 16 h。然后4℃静置1 h， 使蓝色充分显现后， 随机调取白色菌落到新的培养 平板内过夜培养。随机挑取单个白色菌落， 加入含 100 μL ddH2O 的 PCR 管内， 置于 PCR 仪 99℃加热 裂解细胞。取 2 μL 裂解液作为模板， 利用 M13 －47 和 RV － M 为引物 具体序列列于表2 ， 进行后续的 PCR 扩增， 验证插入片断的大小， 筛选阳性克隆。 将筛选好的阳性克隆保存于 1 mL 含有 20 甘油的 液体 LB 培养基中， 每个平板随机选取 10 株已得到 验证的阳性克隆进行测序 BGI， 北京 。 1． 9典范对应分析 CCA 将三个站点土壤样品的理化因子数据， 包括 pH 值、 Eh 值、 含水率、 硝态氮含量、 亚硝态氮含量、 氨态氮 含量、 氟离子及氯离子含量， 与克隆文库测得的土壤细 菌群落组成进行了典范对应分析， 分为两个数据矩阵， 即土壤理化因子数据矩阵以及土壤细菌群落组成数据 矩阵。通过 Canoco 软件计算分析出生态重要理化因 子与土壤细菌群落分布之间的相互影响关系， 从而分 析出单个环境因子对细菌群落组成的具体影响。 1． 10核酸序列登录号 通过随机测序共获得 107 个 16S rRNA － V3 区 序列， 利用 Check － Chimera 检测 http ∥rdp8． cme． msu． edu/cgis/Himera． cgi su SSU ， 将其中的嵌 合体等不正常的序列剔除， 81 个属于正常序列。本 实验中采用的全部序列已提交到 GenBank， 序列号 Accession Number 为 HQ916750 ～ HQ916804。 1． 11系统发育与统计分析 获得的16S rRNA － V3 区序列通过 BLAST 工具 从 GenBank 获得与本实验所得到序列亲缘关系最 近的类群序列。使用 Thompson等 ［14 ］的方法对这些 16S rRNA 序列进行比对， 然后利用 MEGA3． 0［15 ］中 的 Neighbor － Joining 模型进行系统发育与进化分 析。并利用 DOTUR 软件 以 DNA 序列间距划分微 生物分类及多样性的软件 版本 1． 53［16 ］比较本实 验三个站点共 12 个土层样品的细菌多样性， 将相似 性≥98的细菌 16S rRNA 基因序列归为同一可操 作分类单元 OUT 。 2结果与讨论 2． 1土壤样品细菌总数统计及环境理化因素测定 实验区三个站点土壤样品的 pH 值均为 8． 0 以 上; 含水量在各点的变化较小， 均在 15 以上; 氨氮 含量及硝基氮含量在 T2 站点积累较为明显， 在站点 T3 积累其次， 而 T1 站点三氮含量检出较站点 T2 与 T3 明显减少， 亚硝氮在站点 T3 的表层位点含量较 高， 在 T1 站点及 T2 站点中没有明显积累; 三个站点 中硫酸盐含量不均， 在 6. 62 ～ 448. 05 mg/kg 之间 表 3 。各站点 12 个土壤样品中， 土壤岩性细菌总 数在 1. 6 105～8. 87 109范围之内。 表 3各点位土壤样品理化参数及微生物数量统计 Table 3physicochemical factors and microorganisms of soil samples 站点土壤岩性 细菌总数/ CUFg －1 深度/m 酸碱度 pH 含水率/ 氧化还原电位 Eh/mV 干重 wB/ mgkg－1 NH4－ NNO3－ NNO2－ NSO2 － 4 T1 －1粉质黏土5. 37 1091. 948. 7320．53247．002． 240．460．0856． 22 T1 －2黏土夹砂7． 27 1083．278．7316．75201．000． 520．470．1236． 61 T1 －3粉细砂8． 17 1067．458．6318．34133．100． 420．690．139．82 T1 －4细砂2． 64 1058．218．6817．26107．200． 531．960．126．62 T2 －1黏土8． 87 1090．958．1417．77566．0021． 0422． 2116．8819． 04 T2 －2粉土1． 53 1082．218．7117．75187．604． 885．090．3524． 38 T2 －3粉细砂8． 31 1064．008．333．83284．009． 972．040．4349． 83 T2 －4粉土9． 53 1068．158．569．83226．0066． 5911． 610．8133． 29 T3 －1黏土夹砂3． 22 1070．278．550．17491．000． 464．561．34448． 05 T3 －2粉土含砂1． 54 1081．238．6319．17372．001． 114．062．4729． 10 T3 －3中细砂8． 00 1063．258．6218．0290．702． 483．210．5945． 75 T3 －4粗砂1． 60 1054．218．7316．8786．005． 163．680．5228． 00 992 第 2 期程雅楠， 等 氨氮污染源区包气带剖面微生物生态分布特征的研究第 32 卷 ChaoXing 研究区剖面土壤样品各环境因素的测定结果表 明， 总氮及各类污染氮素的分布及含量在各采样站 点差异明显， 最高站点约是最低站点的 60 倍。取样 位点的土壤环境中 NO2－ N、 NO3－ N、 NH4－ N、 SO2 － 4 等阴离子的含量过高， 表明研究区土壤处于氮 素及无机盐类污染状态， 地下水环境极有可能因此 受到威胁。 其中， 研究区 T1 位点土壤的总微生物量随地层 深度加深明显减少， 说明细菌数量随地层增加、 有机 质含量减少而减少。同时， 表 3 数据还反映出， 研究 区内部水平方向微生物菌群分布基本均匀， 但影响 细菌总数的因素并不单一， 研究区 T2 站点中深层位 点 地下 8 m 左右 与中层位点 地下 3 m 左右 的 细菌总量同属一个数量级， 说明其他土壤理化因素 的改变， 如污染氮素的异常积累、 土壤含水率及溶氧 量等同样是影响土壤微生物总量的关键因素。研究 区 T3 站点同样存在特例， 表层的细菌总数略低于地 下浅层的细菌总数， 说明土壤样品中细菌的含量并 非随地层加深而增多， 站点中土壤颗粒组成变化仍 是影响细菌总量的主要因素。 2． 2基于 DGGE 的微生物多样性分析 对研究区 T1、 T2 及 T3 共12 个土层进行变性梯 度凝胶电泳 DGGE 的测定， 结果表明三个站点的 土壤细菌群落具有较为明显的差异 如图 1 所示 。 12 个泳道中产生的条带均聚集在胶体的中间部位 该区域的变性浓度属于高低混合 。DGGE 胶体图 谱中共出现 85 条可见条带， 并标注出 35 条亮度明 显、 位置清晰的 DGGE 胶体条带， 代表土壤样品中 优势细菌 16S rRNA 目的片段， 进行后续序列分析。 DGGE 胶体图谱中， 站点 T1 中表层土壤及浅层 土壤的 DGGE 条带分布较为相似， 各层位条带随深 度增加亮度降低、 种类也相应减少， 部分菌群 条带 1、 3、 4、 6、 8、 9 表现尤为明显。结合表 3 中各站点土 壤理化参数分析， 包气带土壤剖面表层至底层之间 微生物多样性发生的明显改变， 与层位加深后土壤 颗粒结构改变造成的有机质积累变化相关。 同时表现在 DGGE 图谱中， 站点 T2 各层位的 条带随层位加深变化并不明显， 除部分菌群 条带 17、 18、 19、 21、 24 为个别层位的特别优势菌群外， 其 他菌群 条带 12、 13、 14、 15、 20 均贯穿于所有层位 土壤之中， 这与该位点各层位相似的土壤颗粒组成 表层至底层多以黏土及粉质黏土为主 ， 及相似的 污染物积累状态 氮污染积累较为明显 关系密切。 站点 T3 在 DGGE 图谱中的条带分布表明， 表 图 1三个站点 12 个层面土壤样品 16S rRNA － V3 可变区 的 DGGE 图谱 Fig． 1DGGE profiles of the 16S rDNA- V3 region of the twelve layers along the soil sample three stations 层及浅层土壤的细菌群落分布相似性很高， 条带 27 ～34 所对应的细菌菌群在两层位中的含量存在差 异， 而细菌种类几乎没有改变， 但该层位见水较浅， 且土壤颗粒变化较大， 因此表层及浅层中大量存在 的优势细菌群落在位处浅层饱水带的 T3 － 3 及 T3 －4层位中逐渐消亡， 仅有少量优势菌群存在 条 带 29、 30、 31 并新增一种优势菌 条带 35 ， 说明该 位点土壤颗粒吸附细菌的能力随土壤剖面加深而减 弱， 同时较深层位污染物浓度的增加， 也是造成土壤 剖面细菌多样性分布差异明显的主要原因。 使用软件 NTsys Version 2． 0［13 ］根据 DGGE 图谱 中每条带所建立的矩阵进行聚类分析， 通过非加权 组平均法 UPGMA 分析表明三个站点之间的群落 结构相似程度均存在变化， 聚类图如图 2 所示， 横线 链接的末端垂线所对应的数值即为两者的相似程 度， 如图中站点 T1 表层 T1 －1 与 T1 －3 的微生物群 落结构最相近， 相似度为 90 左右。说明T1 －3中 部分微生物种群在较深地层仍然存在。地下浅层 T1 －2 与表层 T1 － 1 相比， 微生物群落结构变化稍 明显， 相似度为 86。而随着地层的加深， 底层 T1 －4的微生物群落分布明显不同于另外三层， 相 似度约只有 75。 同样站点 T2 各层位的微生物群落结构也存在 差异， T2 －2 层与其他三层差别最明显， 相似度只有 76左右， 而地层 T2 －4 与 T2 －1 及 T2 －3 两层的 群落结构相似度则保持在 80 以上， 其中表层 T2 －1与地下深层 T2 －3 的微生物群落结构相似度 最高， 达到 88。 003 第 2 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 图 2DGGE 分离所得细菌 16S rRNA － V3 区序列的 NTSYS 聚类图 Fig． 2NTSYS dendrogram based on 16S rRNA- V3 region sequences from DGGE 站点 T3 的各层位群落结构差异较为明显， 反映 在图谱中的成层分布差异较大。表层 T3 － 1 与 T3 －2之间的相似度达到 96， 而深层 T3 － 3 与 T3 －4之间的群落结构相似度同样为 96。但较浅 两层与较深两层之间的差异明显， 只达到 80， 说 明浅层与深层土壤剖面的微生物群落结构变化 较大。 反映在三个站点之间的群落结构相似性， 站点 T1 与站点 T3 的群落结构较为接近， 相似度达到 75， 而站点 T2 与其他两个站点 T1、 T3 差异较大， 相似度只有57。说明微生物菌群在站点 T1 及 T2 之间变化不大， 但站点 T3 与站点 T1 及 T2 的细菌群 落结构分布差异均比较明显， 原因在于站点 T3 紧靠 温榆河畔， 包气带地层见水层位较浅， 土质成多为砂 质土壤， 造成站点 T3 的微生物群落结构变化明显。 2． 3细菌群落结构及系统发育分析 将 DGGE 分离出的优势细菌条带 分别标记为 条带 1 ～ 35 在 NCBI 基因库 NCBI， http ∥www． ncbi． nlm． nih． gov/ 中进行序列比对发现， 实验区 12 个土壤样品中提取出的81 个正常细菌16S rRNA 序列共 54 个不同亲缘类型 OUT ， 分属于 11 个系 统发育门类。如图 3 所示， 各分属具体细菌门类及 所占细菌总亲缘类型比例分别为 α － 变形细菌 7 ， β － 变形细菌 10 ， γ － 变形细菌 25 ， δ － 变形细菌 7 ， 厚壁菌 4 ， 酸杆菌 7 ， 放 线菌 3 ， 绿弯菌 3 ， 拟杆菌 4 ， 产黄杆菌 2 ， 芽单胞菌 5 和未分类细菌 26 。 基于16S rDNA 基因序列相似性≥98的准则， 图 3研究区三站点各层位总微生物群落组成 Fig． 3Microbial community composition of soil horizons from three stations in research area 选取 DGGE 图谱 图 1 中得到的部分代表条带进行 序列系统发育分析， 结果表明细菌类群在不同站点 和层位中的分布存在显著差异。 如图 4 所示， T1 站点 4 个层位样品中的优势细 菌类群是γ － 变形细菌 代表条带 3、 7 ， δ － 变形细 菌 代表条带 2、 8 ， α － 变形细菌 代表条带 5 ， 绿 弯菌 代表条带 1 ， 厚壁菌 代表条带 4、 9 和芽孢 杆菌 代表条带 6 ， 另外在该站点深层区域 T1 － 4 土壤样品中， 检出少量产黄杆菌 代表条带 10 和放 线菌 代表条带 11 。根据测序结果， 发现该站点土 壤总细菌中 γ － 变形细菌在所占比例 最 大 为 36. 4， 其 次 是 厚 壁 菌 和 δ － 变 形 细 菌 占 到 18. 2 ， 绿弯菌占到 13. 6， 芽孢杆菌所占比例为 9， 产黄杆菌及放线菌所占总菌类的比例仅为 4. 5， 其余菌种属于未分类细菌。 随着深度的增加， 底层 T1 － 4 中的优势细菌主 要为产黄杆菌。该站点由于表层覆盖建筑垃圾杂填 土， 浅层土壤颗粒为粉质黏土， 深层主要由粉细砂、 细砂组成。地下污染氮素及以硫酸根离子为代表的 无机盐在粉质黏土及黏土层积累明显， 在以细砂为 主的土层中含量迅速降低， γ － 变形细菌占绝对优 势。另外厚壁菌、 δ － 变形细菌、 芽孢杆菌和绿弯菌 同样是表层的优势细菌群， 其中厚壁菌类细菌与来 自植物根系土壤的细菌亲缘性较高 ［17 ］， 尤其发现一 类异养脱氮细菌 Bacillus sp． 菌属与氮循环密切相 103 第 2 期程雅楠， 等 氨氮污染源区包气带剖面微生物生态分布特征的研究第 32 卷 ChaoXing 图 4三个站点各层位细菌组成统计 Fig． 4Bacterial composition from three stations in research area 关 ［18 ］。另有分属于 δ － 变形菌的除硫单胞菌属 Desulfuromonas 被认为在硫循环中具有重要的作 用 ［19 ］， 同样仅存在于土质为粉质黏土和黏土夹细砂 的 T1 －1 及 T1 －2 层位中， 说明相对砂质土壤硫酸 根离子蓄积量较高的黏土质土壤为是该类细菌生存 的首选环境。 T2 站点 4 个层位样品中的优势细菌类群是 β － 变形细菌 代表条带 14、 23 ， γ － 变 形 细 菌 代表条带 12、 19、 24、 25 ， α － 变形细菌 代表条带 20、 21 ， 拟杆菌 代表条带 15、 22 ， δ － 变形细菌 代 表条带 16、 17、 18 ， 产黄杆菌 代表条带 26 和酸杆 菌 代表条带 13 。序列测试结果显示， 各类细菌所 占该站点总菌比例分别为 β － 变形细菌 21． 6 、 γ － 变形细菌 19． 6 、 α － 变形细菌 17． 6 、 拟杆菌 17． 6 、 δ － 变形细菌 5． 9 、 酸杆菌 7． 8 和产黄杆菌 2 ， 其余属于未分类细菌。 该站点位于长期受到含氮类农药污染的城郊果 蔬种植园， 分析其土壤环境发现， 该区域氨态氮积累 极为严重， 尤其在地下浅层与饱和带之间积累更加显 著。硝态氮及亚硝态氮含量随层位加深呈递减趋势， 说明在这些层位的土壤微环境中发生了较为明显的 反硝化作用， 其中占绝对优势的细菌均属于反硝化细 菌类 别，如 假 单 胞 菌 和 反 硝 化 菌 Paracoccus pantotrophus ATCC 35512 。此类细菌能够利用硝酸 根、 亚硝酸根、 氮氧化物作为末端电子受体， 以还原性 硫化物为能源生长 ［ 20 －22 ］， 进而解释了站点 T2 中亚硝 态氮随层位增加的现象。另外， 分属变形菌 γ 亚纲的 高度耐盐菌盐单胞菌 Halomonas sp． 生存于硫酸盐 含量较高的 T2 站点粉质土壤中， 与其亲缘关系最近 的物种来自于苯乙酸废水的高盐污泥 ［ 23 ］， 这类细菌 的存在多数受污染盐类含量的影响。T2 站点的各层 位中还存在着各类有机污染的降解菌， 如分属于 δ －变形细菌的地杆菌 Geobacteraceae 、 放 线 菌、 β －变形菌以及拟杆菌等， 这些门类的细菌多来自混 203 第 2 期 岩矿测试 http ∥www． ykcs． ac． cn 2013 年 ChaoXing 合污染土壤及淤泥中 ［ 24 －25 ］。但草地土壤［ 26 ］、 农田［ 27 ］ 等环境的常见细菌绿弯菌、 芽孢杆菌及厚壁菌未在 T2 站点中检出。 T3 站点 4 个层位样品中 γ － 变形细菌 代表条 带 30、 31、 32、 35 占较大优势， 是总菌量的 17． 6， δ － 变形细菌 代表条带 33 、 β － 变形细菌 代表条 带 28 、 芽孢杆菌 代表条带 29 、 拟杆菌 代表条带 34 和酸杆菌 代表条带 27 所占比例均在 8． 0 左 右， 厚壁菌及产黄杆菌所占比例仅为 2．