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添加纤维素降解菌对牛粪堆肥特性的影响 马溪曼郭晓博李群良 广西大学 化学化工学院,南宁 530004 摘要 在实验室规模的牛粪和木薯杆堆肥中, 筛选出能降解纤维素的混合菌, 经在平板培养基中分离纯化和进一步筛 选, 得到对纤维素降解效果较好的纯菌株 CE5, 将其在液体培养基中富集后添加到相同的堆肥原料中, 研究接种 CE5 对堆肥特性的影响。结果表明 接种 CE5 的试验组堆体温度在堆肥过程中均高于未接种对照组; 堆肥结束时, 实验组 的 C/N 低于对照组, 种子发芽指数、 全氮和有效氮含量均高于对照组, 水溶性有机碳和有机质含量相当, 说明实验组 的腐熟情况好于对照组, 通过扫描电镜对堆肥结束后样品检测, 可以看出试验组中木薯杆的降解效果优于对照组, 证 明接种 CE5 提高了有机肥的品质。 关键词 牛粪; 堆肥; 纤维素降解菌 DOI 10. 13205/j. hjgc. 201410023 EFFECT OF ADDING CELLULOSE DEGRADER ON THE CHARACTERISTICS OF CATTLE MANURE COMPOSTING Ma XimanGuo XiaoboLi Qunliang College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China AbstractMixed cellulose degraders were screened from the cattle manure and stalks of cassava composting in the laboratory, further isolation was done through alternative plating ,and a strain named CE5 was obtained,which could effectively degrade cellulose. The strain CE5 was enriched in liquid medium,and inoculated in the composting materials to assess the influence of the addition of CE5 on composting process. The results showed that adding CE5 had a higher temperature than controlling samples, at the end of composting, the germination index, total N and effective N of experimental samples were higher than control samples, while C/N was lower, WSC and organic matter had no significant difference, indicating that biodegradation of the experimental group was more than controlling samples. Also,SEM analysis revealed that stalks of cassava of experimental samples were better degraded than the controlling group. Hence,adding CE5 can enhance the quality of composts. Keywordscattle manure;compost;cellulose degrader 收稿日期 2013 -12 -23 0引言 近年来, 由于集约化畜牧养殖业的迅猛发展, 禽 畜粪便污染的问题突出, 如若不能及时处理, 就会造 成严重的环境污染 [1 ]。因此, 如何高效处理禽畜粪 便, 使其在不污染环境的同时能够再次利用, 成为了 目前发展绿色畜牧业的热点问题。利用禽畜粪便堆 肥制成生物有机肥既可以减轻粪便质量、 水分含量和 活性, 还能使其便于处理, 并在没有臭味的问题下得 到较好的储存, 减少农田径流和氮素的损失[2- 5 ]。而 腐熟的肥料又能向农作物提供各种有机和无机养分, 培肥改良土壤 [6- 8 ]。但由于传统的堆肥过程是一个由 自然微生物参与的生化过程, 而土著微生物的数量和 种类又十分有限, 因此在初期难易快速繁殖, 存在发 酵周期长, 肥效低的特点。人工加入微生物菌剂则可 以调节堆肥的微环境, 加快堆肥中有机质的降解及腐 熟, 从而提高堆肥质量[9- 13 ]。很多研究人员接种微生 物菌剂到堆肥物料中都取得了良好的效果[14- 18 ], 而 堆肥过程本身就会产生相应功能的微生物。本试验 以广西地区来源广泛的牛粪和木薯杆为原料, 从堆肥 中筛选了能够降解纤维素的菌剂, 添加到相同的堆肥 原料中, 研究接种了纤维素降解菌对堆肥发酵过程及 特性的影响。 89 环境工程 Environmental Engineering 1试验部分 1. 1试验材料 堆肥原料为牛粪和木薯杆, 牛粪取自广西大学动 物科学技术学院教研基地, 木薯杆取自广西大学校 内, 堆肥原料的主要性状见表 1。 表 1堆肥原料的主要理化性质 Table 1Major physical and chemical characteristics of compost materials 原料含水率/pH有机质/C/N有机碳/全氮/ 牛粪75. 868. 2689. 3119. 0151. 803. 18 木薯杆6. 587. 7975. 8354. 2343. 980. 95 1. 2微生物菌剂 筛选样品来源于实验室自堆的牛粪和木薯杆堆 肥中, 筛选培养基成分为 羧甲基纤维素钠 1, 酵母 提取物 0. 5, 胰蛋白胨 1, KH2PO40. 1, NaCl 0. 5, Na2CO30. 5, 琼脂 1. 5, pH 为 7。将混合 菌分离纯化到筛选培养基中, 经刚果红染色1 h, 无菌 生理盐水脱色 30 min 后, 选出透明圈较明显的菌落, 再将这些菌落经液体发酵后测酶活。液体发酵培养 基成分为 羧甲基纤维素钠 1, 胰蛋白胨 0. 5, KH2PO41, NaCl 0.5, Na2CO30.5, MgSO40.07, pH 为 7 左右。经多次筛选后选取酶活最大的菌株培 养制成微生物菌剂。 1. 3试验设计 堆肥试验于2013 年9 月26 日10 月13 日在自 制的发酵罐中进行, 发酵罐内径 35 cm, 高 60 cm, 不 加盖, 混合物按 m 牛粪 ∶ m 木薯杆2. 25∶ 1的比 例混合均匀, 木薯杆在混合堆肥前进行粉碎处理, 试 验组加入发酵的生物菌剂, 设 3 个重复, 对照组用无 菌水调节至含水率相近, 每天上午 10 00 在各堆肥的 中心和四周取 3 点测温, 每 2 d 取样一次, 在堆肥物 料中采用五点法取样, 充分混匀后一部分风干并过 100 目筛待用, 另一部分保存于 -20 ℃冰箱中。所有 堆体每 4 d 人工翻堆一次。 1. 4测定方法 温度用精密式数显温度计测定堆肥中心及四周 三点温度取平均值记录; 含水率通过烘干法测定[19 ]; pH 取5 g 堆肥原料加入50 mL 去离子水, 搅拌30 min 再静止 1 h 后用 pH 计直接测量; 有机质采用重铬酸 钾容量法, 依照国标标准 NY 525- 2012有机肥料 ; 发芽指数 GI 将堆肥产品与去离子水按 1∶ 10 的质 量比充分混合, 取 10 mL 滤液在 3 000 r/min 下离心 10 min, 小心吸取5 mL上清液到铺有滤纸的培养皿 内, 将 20 粒小白菜种子放入培养皿中, 以去离子水做 对照, 每个样品做 3 次重复, 在 30 ℃下于生物培养箱 中培养96 h后, 测定根长并计算发芽率, 然后根据 式 1 计算种子的发芽指数。 发芽指数 处理的发芽率 处理的根长 / 对 照的发芽率 对照的根长 1 总氮 TN 由于肥料中的硝态氮、 亚硝态氮和铵 态氮含量很少, 因此一般用凯氏定氮法测量出的凯氏 氮 TKN代替总氮, 采用硫酸 - 双氧水消化法 测定 [20 ]。 有效氮使用碱扩散法[20 ]。 水溶性有机碳 WSC 将 1 g 肥料加入 100 mL 去离子水中, 浸提液在 200 r/min 频率下振荡 1 h, 12 000 r/min下离心 20 min, 取上清液经 0. 45 μm 纤 维树脂膜过滤后用 TOC 仪测定 [21 ]。 2结果与讨论 2. 1温度的变化 堆肥是一个复杂的生化反应过程, 底物混合大量 微生物以固态发酵方式进行生物降解。其中温度就 是微生物活动的主要指标, 根据温度的变化, 可将堆 肥分成 4 个阶段 起始阶段 易降解且富含能量的物 质充足, 微生物开始适应新环境; 中温阶段 嗜温性微 生物较为活跃, 主要利用物料中的可溶性有机物大量 繁殖并放出热量, 温度不断上升; 高温阶段 一般认为 超过 45℃即为高温阶段, 此时嗜热微生物大量繁殖, 除了可溶性有机物继续得以分解外, 纤维素、 半纤维 素、 木质素等也开始被分解; 腐熟阶段 温度下降, 剩 余有机物大部分为难降解物质, 腐殖质大量行成并趋 于稳定化[22- 25 ]。 整个堆肥过程中的温度变化如图 1 所示。接种纤 维素降解菌CE5 的试验组温度在堆肥过程中均高于对 照组, 试验组的最高温度为 49. 5 ℃, 高于对照组的最 高温度45. 4 ℃。实验组的高温阶段维持 6 d, 而对照 组仅维持了 2 d 左右, 随着堆肥过程中有机物的不断 消耗, 微生物的代谢逐渐降低, 发热减少。对照组和实 验组温度分别在12 d 和 13 d 时降到 40 ℃以下, 之后 持续降低至第16 天各堆体温度与环境基本相近。 在定期翻堆时由于物料热量的损失, 堆肥温度有 短暂降低, 但由于翻堆使原料的通氧量增加, 微生物 的活性上升, 因此之后温度又重新升高。试验组在堆 肥初期添加了能降解纤维素的菌剂, 有可能增加了纤 99 固废处理与处置 Solid Waste Treatment and Disposal 图 1堆肥过程中的温度变化 Fig.1Changes of the temperature during composting 维素的降解活性, 加快了有机物的消耗, 微生物大量 繁殖而产生热量。在整个过程中的微生物活动均活 跃于对照组, 因此温度一直高于对照组直至肥料 腐熟。 2. 2含水率的变化 水是微生物活动所需的重要物质, 在整个堆肥过 程中都需要适当的水分, 一般认为堆肥的起始含水率 为 60是最合适的状态, 低含水率会阻碍生物活动 进程, 而高含水率会降低孔隙率而阻止气体交换, 阻 碍好氧发酵进程 [26 ]。但材料的理化性状、 粒径及有 机质含量等也会对含水量有不同的要求, 由于木薯杆 较为干燥蓬松且有机质含量较高, 需要稍高的含水 率, 最后调节初始含水率为 68左右。 随着堆肥的进行, 微生物的生长活动需要水, 但 在肥料好氧分解和细胞的内源呼吸过程中也生成了 水 [27 ], 在两者的相互作用下, 肥料的含水率缓慢下 降, 每次翻堆时通过水分蒸发而下降, 之后随着微生 物的活动又重新升高 见图 2 。试验组在开始就添 加了菌剂, 对水分的消耗较快, 因此在初期水分含量 下降较快, 后期微生物含量增多, 内源呼吸加剧, 含水 率的下降速度放缓。 2. 3pH 的变化 pH 能够反映微生物的环境情况和堆肥的分解过 程, pH 一直在堆肥过程中随着堆肥时间和温度的变 化而变化, 适宜的 pH 可使微生物有效地发挥作用, 一般认为 pH 为 6. 5 ~8. 5 时, 堆肥的效率最高[28 ] , 本 次试验调节初始 pH 为 8. 0 左右, 堆肥过程中的 pH 变化见图 3。 如图 3 所示 对照组和实验组的 pH 值在发酵开 始阶段先升高而后降低, 最后为 8. 4 ~ 9. 2。在堆肥 图 2堆肥过程中的含水率变化 Fig.2Changes of moisture content during composting 图 3堆肥过程中的 pH 变化 Fig.3Changes of pH during composting 过程的初期, 有机质先被转化成有机酸, pH 降低, 之 后牛粪中含氮有机物分解出大量的氨使 pH 值升高。 而图 3 显示的试验组 pH 则一直呈上升状态, 对照组 有较小的下降过程。而对照图 1 可知, 温度在初始阶 段上升较快, 使有机酸转化过程迅速完成, 而后产生 大量的氨使 pH 立即上升, 因此没有在图中看到 pH 降低的过程。而在温度逐渐升高后, 氨大量的挥发而 有机质分解产生腐殖酸, 使 pH 值有所下降, 之后, 氮 代谢和碳代谢的互相作用使 pH 值在一定范围内波 动, 在堆肥的最后对照组合实验组的 pH 分别稳定在 8. 94 和 9. 02, 并无显著差异, 可能是由于腐熟阶段微 生物活性减弱。 2. 4有机质含量变化 在堆肥过程中有机质的不断降解使其质量减少, 试验组在一开始的有机质含量下降趋势略强于对照 组, 这可能是由于添加了微生物促进了碳代谢。到后 期温度降低, 分解有机质的微生物数量减少, 有机质 的降解减慢, 见图 4。 2. 5总氮 TN 的变化 以干样计 堆肥过程中总氮的变化趋势是先升高再下降最 001 环境工程 Environmental Engineering 图 4堆肥过程中的有机质含量变化 Fig.4Changes of organic matter content during composting 后稳定在一定水平 图 5 , 堆肥的氮素在整个堆肥过 程中随着氨的散发有一定损失。堆肥初期碳素被迅 速降解, 碳含量大量减少导致总氮相对有上升趋势, 之后随着碳素降解减慢, 且氮素开始被大量分解成 NH3而损失, 总氮量降低, 直到后期各种微生物活动 减缓, 氮素在一定范围内波动。试验组由于添加了纤 维素降解菌, 因此促进了碳代谢, 与对照组相比总氮 含量较高, 有利于氮素的保持。 图 5堆肥过程中的总氮变化 Fig.5Changes of TN content during composting 2. 6C/N 的变化 C/N 是指肥料中有机碳和总氮的摩尔比, 是微生 物重要的营养平衡因子, 如果偏低会由于堆体可利用 碳源不足而升温缓慢, 偏高则会造成氮饥饿 [29 ]。一 般来说, 堆肥最适的 C/N 为 30 左右, 而腐熟的肥料 C/N 一般为 15 ~ 20。在堆肥过程中, 有机物被大量 分解为 CO2散出而造成碳素的损失, 而氮素也以 NH3形式损失, 由于 CO2的逸出较 NH3多, 因此 C/N 总体上表现出下降趋势。图 6 所示的试验组和对照 组在堆肥结束时的 C/N 均为 15 ~ 16, 已达到腐熟。 试验组虽然温度较高, 但 C/N 的降低趋势较对照组 无明显区别, 可能是因为温度升高使 C、 N 的损失都 增加。 图 6堆肥过程中的 C/N 变化 Fig.6Changes of C/N during composting 2. 7水溶性有机碳 WSC 的变化 WSC 被认为是微生物易利用的营养物质, 适宜 的 WSC 对菌群的生长起着重要作用 [30 ], 同样, WSC 的含量也可以体现菌群的生长情况。 在堆肥初期 WSC 含量较低, 随着温度升高至高 温期, 微生物迅速适应堆肥环境, 微生物数量增多, WSC 含量升高, 而后微生物对易于利用的碳源需求 越来越大, 但易利用的物质已被大量消耗, WSC 含量 也随之降低 图 7 。在高温期, 由于试验组添加了菌 株导致微生物含量较丰富, WSC 也较对照组高, 而后 到了腐熟阶段, 试验组和对照组中的易利用碳源均消 耗殆尽, 微生物活动也渐渐缓慢, 两者的 WSC 也降至 相近水平。 图 7堆肥过程中的 WSC 变化 Fig.7Changes of WSC content during composting 2. 8有效氮的变化 以干样计 有效氮包括无机的矿物态氮和部分有机质中易 分解、 比较简单的有机态氮, 是铵态氮、 硝态氮、 氨基 酸、 酰胺和易水解的蛋白质氮的综合, 通常也称水解 氮, 它能反映土壤近期内氮素供应情况。微生物将总 101 固废处理与处置 Solid Waste Treatment and Disposal 氮分解成铵态氮, 然后再有铵态氮转化成亚硝态氮进 而迅速转化为硝态氮[31- 32 ]。有效氮总体呈先上升后 下降的趋势, 之后随着温度升高 NH3的逸出有一个 短暂的下降趋势, 之后由于氨氧化作用使氮素转化成 较为稳定的硝态氮而得到保持, 试验组由于 C 的损 失而表现出良好的保氮特性 图 8 。 图 8堆肥过程中的有效氮变化 Fig.8Changes of effective Ncontent during composting 2. 9堆肥前后的发芽指数 GI GI 被认为是有效的生物学检验堆肥毒性的方 法。一般认为, 当 GI >50 时, 堆肥对植物已基本没 有毒性, 堆肥基本腐熟; 当 GI > 80 时, 堆肥已经腐 熟 [33 ]。在堆肥技术时, 对照组和试验组的 GI 均高于 80, 而实验组高于对照组 11. 34, 腐熟程度更好, 这可能是由于添加菌剂使肥料中的各物质 包括毒 害物 降解得更彻底。 表 2堆肥前后的发芽指数 Table 2GI before and after composting 堆肥阶段对照组/试验组/ 堆肥初始<50<50 堆肥结束126. 24140. 56 2. 10扫描电镜 SEM 分析 取堆肥初始和堆肥结束后对照组和实验组的样 品风干粉碎并过 100 目筛后, 用扫描电镜检测分析, 如图 9 所示。在初始时木薯杆中纤维素的筛孔很明 显, 结构较为完整。堆肥后, 试验组和对照组木薯杆 与牛粪结合较紧密, 几乎看不到完整的纤维素结构, 说明已经被降解。 图 9堆肥前后的 SEM 分析 Fig. 9SEM analysis before and after composting 3结论 在牛粪堆肥中添加了纤维素降解菌, 提高了堆肥 温度并延长了高温堆肥时间, 降低了 C/N, 加快了堆肥 的腐熟, 增加了对堆肥原料的降解, 有利用氮的保持。 因此纤维素降解菌的添加有效地改善了堆肥的质量。 参考文献 [1]魏源送, 王敏健. 堆肥技术及进展[J] . 环境科学进展, 1999, 7 3 11- 23. 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