头孢曲松钠对大鼠液压脑损伤后TLR4介导的神经炎症反应的作用.pdf

重庆 医学 2 0 1 6年 2月第 4 5卷第 6期 论著 基础研究d o i 1 0 ． 3 9 6 9 ／ j ． i s s n ． 1 6 7 1 8 3 4 8 ． 2 0 1 6 ． 0 6 ． 0 0 6 73 7 头孢 曲松钠对大 鼠液压脑损伤后 T L R4介导 的神经炎症反应 的作用 李 萍， 解东兴 ， 刘 伟 ， 王丹宜， 周洪霞△ 唐 山工人 医院功能检 验科 ， 河北唐 山 0 6 3 0 0 0 [ 摘要] 目的 观察头孢曲松钠 C e f 治疗对大鼠液压冲击脑损伤后 T L R 4介导的神经炎症反应的影响。方法 选用雄性 S D大鼠 7 2只， 随机分为假手术组 、 脑损 伤组, C e f 治疗组 ， 每组 2 4只。采 用液压 冲击 法制备 S D大鼠脑损 伤模 型， C e f 治疗组 于致 伤 前 5 d注射 C e f 2 0 0 mg ／ k g ， 连 续 5 d 。通 过干湿 比重法检测各组大 鼠脑 组织含水量 ， E L I S A 法检 测 大鼠脑 皮层 T NF - a 、 I L 1 口 水平， 免疫组织化学及 we s t e r n b l o t 法检测脑皮层 T L R 4的蛋白表达情况。结果 与脑损伤组比较， C e f 治疗组明显减轻液压冲 击性脑损 伤的脑组织含水量 P0 ． 0 5 ， 降低 大鼠脑皮质 组织 中炎性 因子 T NF _ I L _ 1 8 水平 P0 ． 0 5 ， 明显 下调 T L R 4蛋 白的 表 达量 P O ． 0 5 。结 论C e f 可以通过抑制 TL R 4介 导的神 经炎症反 应 ， 下调炎症 因子 的表达 ， 改善 脑水肿情 况。 ‘ [ 关键词] 脑损伤； 头孢曲松钠 ； 脑水肿； 神经炎症反应 [ 中图分类号] R 6 0 5 ． 9 7 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1 6 7 1 8 3 4 8 2 0 1 6 0 6 0 7 3 7 0 3 Ef f e c t o f c e f t r i a x o n e o n T LR4 me d i a t e d n e r v e i n f l a mma t o r y r e a c t i o n a f t e r h y d r a u l i c b r a i n i n j u r y i n r a t s Li Pi n g ， Xi e Do n gxi n g ， Li u W e i ， Wang Danyi， Zh o u Ho ngxi a De pa r t me n t o f Fu n c t i o n a l L a b o r a t o r y， Ta n g s h a n Wo r k e r s Ho s pi t a l ， T a n g s h a n ， He b e i 0 6 3 0 0 0， C h i n a [ A b s t r a c t ] O b j e c t i v e To i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f c e f t r i a x o n e C e 1 o n T L R 4 me d i a t e d n e r v e i n f l a mma t o r Y r e a c t i o n a f t e r h y d r a u l i c b r a i n i n j u r y i n r a t s ． Me t h o d s S e v e n t y - t wo ma l e S D r a t s we r e r a n d o ml y d i v i d e d h n t o t h e s h a m o p e r a t i o n g r o u p， b r a i n i n j u r y g r o u p a n d c e f t r i a x o n e t r e a t me n t g r o u p 一2 4 ． Th e r a t mo d e l o f b r a i n i n j u r y wa s P r e p a r e d b y t h e hy d r a u l i c i mp a c t me t h o d ． Th e Ce f t r e a t me n t g r o u p wa s t r e a t e d wi t h Ce f 2 0 0 mg ／ k g o n 5 d b e f o r e i n j u r y f o r S U C C e s s i v e 5 d ． Th e we t - d r y we i g h t me t h o d wa s u s e d t o d e t e c t ． t h e wa t e r c o n t e n t i n t h e b r a i n t i s s u e i n e a c h g r o u p ． The l e v e l s o f TNF_ a n d I L - 1 i n t h e c e r e b r a l c o r t e x we r e t e s t e d wi t h t h e E LI S A me t h o d ． Th e e x p r e s s i o n o f TLR4 p r o t e i n i n t h e c e r e b r a c o r t e x wa s me a s u r e d b y i mmu n o h i s t o c h e mi c a l s t a i n i n g a n d W e s t e r n b l o t me t h o d s ． Re s u l t s Co mp a r e d wi t h t h e b r a i n i n j u r y g r o u p , t h e b r a i n t i s s u e wa t e r 。 c o n t e n t c a u s e d b y t h e。h y d r a u l i c i mp a c t i n t h e C e f t r e a t me n t g r o u p wa s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d P0 ． 0 5 ， t h e 1 e v e l s o f T NF - a a n d I L - l f] i n t h e c e r e b r a l c o r t e x t i s s u e w e r e d e c r e a s e d P 0 ． 0 5 ， a n d t h e e x p r e s s i o n o f TLR4 ． p r o t e i n wa s s i g n i f i c a n t l y d o wn - r e g u l a t e d P 0 ． 0 5 C o n c l u s i o n Ce f c o u l d d o wn - r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f i n f l a mma t o r y f a e t o r s a n d i mp r o v e t h e c e r e b r a l e d e ma b y i n h i b i t i n g TLR4 me d i a t e d n e r v e i n f l a mma t i o n r e a c t i o n ． [ K e y w o r d s ] b r a i n i n j u r i e s ； e e f t r i a x o n e ； b r a i n e d e ma ； i n f l a mma t i o n 8 一 内酰胺类抗生素头孢 曲松钠 c e f l r i a x o n e ， C e f 是 一种 临 床 常用的抗生素 ] 。近几年 多数 研究 发现 C e f 除有 抗菌 作用 外 ， 还具有一定 的神经保护作用 ， 例如在脑缺血缺氧 、 脑缺血再 灌 、 细菌性脑膜 炎 及创 伤性 脑损 伤 中均显 示 积极 的疗 效_ 2 ] 。 然 而 ， C e f 对大 鼠液压 冲击脑损 伤后 TL R 4介导 的神经 炎症反 应 的影 响 ， 目前鲜有文献报道 。作者 通过建立液压冲击脑损伤 大鼠模 型 ， 通过 E L I S A、 免 疫组 织化 学及 免疫 印 迹 的方法 ， 观 察 C e f 处理后大 鼠脑组织含水 量 ， TL R 4蛋 白及炎 性 因子的变 化 。以期探讨 C e f 对脑损 伤大 鼠的脑保 护作 用及 可能 的分子 机制 。 1 材料 与方 法 1 ． 1 材料健康 S D大 鼠 7 2只 ， 雄 性 ， 普 通级 ， 体质 量 2 8 0 ～ 3 0 0 g ， 河北 医科 大 学实 验动 物 中心 提供 ， 标准 鼠饲料 常 规 喂 养 。兔抗 大鼠 的 TL R4多 克 隆抗体 和小 鼠抗 大 鼠 的 l- a c t i o n 单 克隆抗体均购 自美 国 S a n t a C r u z 公 司。羊抗兔 及羊抗 鼠的 兔辣根 过氧化 物 酶标 记 的 Ⅱ抗 均 购 自美 国 S o u t h e r n B i o t e c h 公 司。E L I S A试剂盒 、 S AB C试剂 盒及 D AB试 剂盒 购 自武 汉 博 士德 生物技术 有限公司。枸 橼酸盐缓 冲液及 P B S缓 冲液均 购 自北京 中杉金桥有 限公 司。 1 ． 2方 法 1 ． 2 ． 1 动 物模型 制备及分 组将 7 2只健康雄 性 的 S D大 鼠 随机 分为假 手术 组 、 脑损 伤组 、 C e f 治疗 组 ， 每组 2 4只。各 组 又分 为 1 2 、 2 4 、 4 8 、 7 2 h 4 个 时间亚组 ， 每个亚组 6只。2 戊 巴 比妥 4 0 ms ／ k g 腹腔麻醉大 鼠， 假手术组 动物常规麻 醉开 颅 ， 但不 给予液 压冲击处 理。脑损 伤组 、 C e f 治疗组 大 鼠参 照文献 [ 5 ] 制备液压冲击性脑 损伤 动物模型 ， 打击 强度 1 ． 5 0 o ． 2 0 大 气压 1大气压 一1 0 1 ． 3 2 5 k P a ， 造成 中度 脑损 伤 。液 压 冲 击 伤后 大鼠立即出现竖毛 、 弓背 、 前肢 屈曲 、 后 肢强直 、 肌 张力 明显增 高及 心率增快等表 现 。致伤后将 大 鼠放 回专用 鼠笼标 准饲料 和饮 用纯净水 ， 恒温 2 O ～2 5℃饲 养。C e f 治疗 组大 鼠 于致伤前 5 d腹腔注射 C e f 2 0 0 mg ／ k g ， 连续注射 5 d 。 1 ． 2 ． 2 脑组 织含水量测定 腹腔 注射 1 O 水 合氯 醛麻醉 大 * 基金项 目 河北省唐 山市科学技术研究与发展计划资助项 目 1 2 1 4 0 2 0 9 A 一 3 1 。 作者简介 李 萍 1 9 6 9 -- ， 主治医师 ， 硕士 研究生 ， 主要 从 事脑损 伤基础研究 。 通 讯作者 ， Te l 1 5 6 3 3 9 1 0 3 4 6 ； E - ma i l l i p i n g g n j y y e a h ． n e t 。 重庆 医学 2 0 1 6 年 2月第 4 5卷第 6期 假手术组水 平 P 0 ． 0 5 。与脑 损 伤组 相 应各 时 间点 比较 ， C e f 治疗组大 鼠 T L R 4的蛋 白表达量 显著 下降 ， 差异均有 统计 学意义 PO ． 0 5 ， 见 表 4 。 表 4 3组大鼠术后各 时间点皮层 T L R 4蛋 白表达量 比较 S 。 一6 ， O D PO ． 0 5 与假手术组比较 ； PO ． 0 5 与脑损伤组 比较 。 3讨 论 B _ 内酰胺 类抗生素是第三代头孢类抗 生素 ， 可有效 地透过 血～ 脑屏障进入脑和脊髓 中发挥药 效 。其 中 C e f 经多数研 究证 实除了具有抗菌作用外还具有新 的功能 ， 应用后可发挥一定 的 神经保 护作用 ] ， 然而其他 B _ 内酰胺 类抗生 素 尚未 见报 道具 有此 功能。所 以本 实验 应用 液压 冲击 脑 损伤 大 鼠模型 ， 探 讨 C e f 的脑保 护作 用及 作用 机制 。干 湿 比重法 测量 脑组 织 含水 量发 现 在液压脑损 伤 的大 鼠模 型 中， C e f 处 理 能够 明显 减轻 脑组 织含水量 ， 缓 解脑 水肿 改变 。本结 果提 示 ， C e f 对脑 损伤 具有一定 的治疗效 果 ， 与先前 的文 献报道相 一致 。肖国民等_ 6 ] 报道在 大鼠致 伤后立即一次性 给予 C e f 2 0 0 mg ／ k g ， 可 以明显 减轻脑水 肿 并 改 善大 鼠的学 习记 忆 功能 。潘 向 东等l_ 7 ] 发 现 C e f 通过 降低创 伤性 脑损伤大 鼠谷氨 酸盐水平 ， 减 轻海 马 C A1 区神 经元 死亡及脑水肿 。但 是有关 C e f 脑保 护作用 机制 的研 究较少。有研究报道显示， C e f 可以激活谷氨酸转运体一 1的表 达及功能 ， 从而阻断兴奋性氨基酸 的神 经毒 性[ 8 ] 。本 实验通过 E L I S A法检测各组大 鼠大脑皮 层组织 中 T NF - a 和 I L - I 水平 改变， 结果显示 ， C e f 能够明显降低脑损伤后 T NF - a和 I L 一 1 口 水平， 减轻大脑皮层的神经炎症反应。脑损伤后出现的神经炎 症反应是 一个复杂的多因素共 同参与 的级联过程 ， 是后续多种 继发 性脑损伤 的病理生理 基础 。本 发现 揭示 C e f 降 低炎 性 因 子 的表达 可能是其在脑损伤 大 鼠模 型 中发 挥脑保 护作用 的机 制之一 。同 时证 实 了 C e f 抗 菌 之外 的另 一 作 用抗 感 染 作用 。 To l l 样受 体 To l l l i k e r e c e p t o r s ， TL Rs 是 生物 体 中非 常 重要 的固有免疫模式识别受体 ， 广 泛分布于各种免疫细胞及多 种组 织 中， 在 固有 免 疫 应 答 过 程 中具 有 重 要 作 用I g 。 。在 TL Rs 的受体家族 中， TL R 4是最 早被 发现 的成员 。在脑 组织 内， T L R 4主要分布于 星形胶 质 细胞 、 小胶 质细胞 和少 突 胶质 细胞 中_ 1 。值得 注 意 的是 脑组 织 中 T L R 4的异 常表 达在 中 风 、 多发性硬化和阿尔兹海 默病 等多种神经系统疾病 的免疫病 理过程 中发 挥作用 。此外还 有研究发现 在脑 缺血再 灌注动 物损伤模 型中 T L R 4不仅能够诱导免疫应答反应 ， 而且还可 以 触发炎症级联反应 [ 1 。小胶质细胞 中 TL R 4的活化与创 伤性 疾病神经炎症反应 的启 动和严重的神经 变性密切 相关_ 1 。本 实验 的免疫 印迹结果提示 ， C e f 处理 可逆 转脑损 伤后 TL R4的 高表达 ， 限制 T L R 4诱导 的神经炎症反应 ， 促进创伤的修复 。 综上所述 ， 本实验通 过液压 冲击制 备大 鼠脑损 伤模 型 ， 研 73 9 究证 实 C e f 治疗可 以减 轻脑水肿 ， 对脑损伤发挥一定 的脑保 护 作用 。进一步探讨其机 制发 现 ， C e f 通过 降低 T L R 4诱导 的神 经炎症反应促 进脑 损伤 的修 复 。揭示 了 C e f 抗菌作 用之外 的 另一 重要 临床 应用 价值 。 参考 文献 [ 1 ] 李丹 ， 张永信． 头孢曲松钠 的特性及 临床应用 [ J ] ． 上海 医 药 ， 2 0 1 3 ， 3 4 1 3 1 2 1 6 ． [ 2 ] 刘 心 洁 ， 王 玉珍 ， 胡 瑞 梅 ， 等． 基 质金 属 蛋 白酶 抑 制 剂 G M6 0 0 1 对肺炎链球 菌性脑膜 炎模 型大 鼠的脑保护作用 [ J ] ． 中 国药理学与毒理学杂志 ， 2 0 1 1 ， 2 5 2 1 5 6 1 6 1 ． [ 3 ] 刘 畅 ， 巴晓红 ， 闵连秋 ， 等． 头孢 曲松钠 预处理对局灶性脑 缺血大 鼠缺血周 围脑 组织 白介素 1 B 和 白介 素 6表达 的 影响[ J ] ． 中 国全科医学 ， 2 0 1 3 ， 1 6 3 6 4 2 9 3 4 2 9 5 ． [ 4 ] 颜志婷 ， 熊建 忠， 林小小 ， 等． 头孢 曲松钠 对脑缺血再灌 注 模 型大 鼠 的脑 保 护 作 用 [ J ] ． 中 国 老年 学 杂 志 ， 2 0 1 4 ， 5 1 5 4 2 4 1 4 2 4 2 ． r- s ] 孙 国柱 ， 刘性强 ， 王 目纲 ， 等． 一种大 鼠液 压冲击脑损伤装 置的研制[ J ] ． 中华实验外科杂志 ， 2 0 1 1 ， 2 8 5 7 4 9 7 5 0 ． [ 6 ] 肖国民 ， 危静 ， 潘 向东 ， 等． 头孢 曲松对创 伤性脑损伤 大鼠 伤后脑 水肿和学 习记忆 功能 的影 响[ J ] ． 中华 外科 杂志 ， 2 0 i 3， 5 1 3 2 7 2 2 7 3 ． [ 7 ] 潘 向东 ， 危静 ， 肖国民， 等． B内酰胺抗生 素头孢 曲松对创 伤性脑损伤大 鼠海马谷氨酸盐水平 的影响[ J ] ． 浙江大 学 学报 医学版 ， 2 0 1 1 ， 4 0 5 5 2 2 - 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1 8 0 ． r 1 5 ]Fe r n a n d e z - L i z a r b e S， P a s c u a l M ， Gu e r r i C． Cr i t i c a l r o l e o f TL R4 r e s p o n s e i n t h e a c t i v a t i o n o f mi c r o g l i a i n d u c e d b y e t h a n o l [- J ] ． J I mmu n o l ， 2 0 0 9 ， 1 8 3 7 4 7 3 3 4 7 4 4 ． 收稿 日期 2 0 1 5 0 6 2 2 修回 日期 2 0 1 5 1 0 0 9