六种特定多环芳烃的测定高效液相色谱法.PDF

1 HZHJSZ0066 水质 六种特定多环芳烃的测定 高效液相色谱法 HZ-HJ-SZ-0066 水质六种特定多环芳烃的测定高效液相色谱法 1 范围 本方法规定了测定水中多环芳烃PAH的高效液相色谱HPLC法本方法参照采用国际 标准 ISO/DIS7981/2 高效液相色谱法分析的六种特定多环芳烃 本方法适用于饮用水地下水湖库水河水及焦化厂和油毡厂的工业污水中荧蒽苯 并b荧蒽苯并k荧蒽苯并a芘苯并ghi茚苯1,2,3-cd芘六种多环芳烃的测定 本法用环已烷提取水中多环芳烃提取液通过弗罗里硅土柱PAH 吸附在柱上用丙酮 加二氯甲烷混合液脱附 PAH 后用配备荧光和或紫外检测器的高效液相色谱仪测定本方 法对六种 PAH 通常可检测到 ng/L水平 水样中若存在可被共萃取的能产生荧光信号或熄灭荧光的物质对本法也有干扰本法用 弗罗里硅土柱层析净化分离可降低荧光背景 2 试剂和材料 2.1 高效液相色谱流动相为水和甲醇的混合溶液 2.1.1 甲醇分析纯用全玻璃仪器重蒸馏要求有足够低的空白 2.1.2 水电渗析水或蒸馏水加高锰酸钾在碱性条件下重蒸在测定的化合物检测限内未 观察到干扰 2.2 配制标准样品和水样预处理使用的试剂和材料 2.2.1 二氯甲烷CH2Cl2用全玻璃蒸馏重蒸馏在测定化合物检测限内不出现色谱干扰为合 格 2.2.2 丙酮C3H6O同 2.2.1 2.2.3 环已烷分析纯同 2.2.1 注若环已烷的纯度不够可采用附录中两种办法中的任一种进行净化 2.2.4 无水硫酸钠Na2SO4分析纯在 400加热 2h 2.2.5 硫代硫酸钠Na2S2O35H2O 分析纯 2.2.6 弗罗里硅土Florisil60100 目色层分析用在 400加热 2h冷却后用水2.1.2 调至含水量为 11m/m 2.2.7 碱性氧化铝层析用50200m活度为 Brockmann级达到的制法如下 将氧化铝加热至 550 20至少 2h冷却至 200250移入放有高氯酸镁的干燥器内 继续冷却即得活度为 Brockmann 级的氧化铝在干燥器内可存放五天 2.2.8 柱层析用硅胶100 目在 300活化 4h 2.2.9 浓硫酸H2SO4分析纯 2.2.10 标准溶液 注有些多环芳烃是强烈致癌的因此操作时必须极其小心不允许人体与多环芳烃固体物质溶剂 萃取物多环芳烃标准品接触多环芳烃可随溶剂一起挥发而沾附于具塞瓶子的外部因此处理含多环芳 烃的容器及实验操作过程必须使用抗溶剂的手套 被多环芳烃污染的容器可用紫外灯在 360nm 紫外线下检 查并置于重铬酸钾浓硫酸洗液中浸泡 4h标准溶液应在有适当设备如合适的毒气橱防护衣服防 尘面罩等的实验室中配制 用固体化合物配多环芳烃标准品 在没有合适的安全设备及尚未正确掌握使用 技术之前不能进行 2.2.10.1 色谱标准物固体多环芳烃标准物为荧蒽苯并k荧蒽苯并b荧蒽苯并a芘 茚并1,2,3-cd芘及苯并ghi等六种纯度在 96以上采用固体标准物质配制标准储备液 亦可采用经证实为合格的市售多环芳烃标准溶液配置标准储备液 2.2.10.2 用固体多环芳烃配制标准储备液分别称量各种多环芳烃2.2.10.1200.1mg分别 2 溶解于 5070mL 环已烷2.2.1中再以环已烷稀释至 1000.1mL配成浓度为 200g/mL 单 个化合物的标准储备液若用市售溶液配制标准储备液可在容量瓶中用环已烷稀释使标 准储备液的浓度各为 200g/mL 的单化合物溶液储备液保存在 4冰箱中 2.2.10.3 混合 PAH 标准溶液的配制在 10mL 容量瓶中加入各种 PAH 储备液2.2.10.4 1 0.01mL用甲醇稀释至标线使标准溶液中含各种多环芳烃的浓度各为 20g/mL 的混合 PAH 标准溶液标准液保存在 4冰箱中 2.2.10.4 标准工作溶液根据仪器灵敏度及线性范围的要求取不同量的混合 PAH 标准溶液 2.2.10.3用甲醇2.1.1稀释配制成几种不同浓度的标准工作溶液 3 仪器 3.1 高效液相色谱仪带荧光和紫外检测器的高效液相色谱仪 3.1.1 恒流梯度泵系统 3.1.2 反相柱填料为 Zorbax 5ODS, 柱长 250mm内径 4.6mm 3.1.3 荧光检测器荧光分光光度计检测器激发波长 280nm发射光波长大于 389nm 截止 点荧光光度计检测器应有激发用的色散光系统和可用滤光片或色散光学系统的荧光发射部 分 3.1.4 紫外可见光检测器可调波长紫外检测器或固定滤长为 254nm 的紫外检测器可单 独使用也可以与荧光检查器联用 3.1.5 记录仪与检测器匹配 3.1.6 微量注射器规格为 51050100 及 500L 3.1.7 恒温水浴或恒温柱箱 3.2 采样瓶1L具磨口玻璃塞的棕色玻璃细口瓶 3.3 振荡器调速配备自动间歇延时控制仪 3.4 玻璃器皿 3.4.1 分液漏斗1000mL玻璃活塞不涂润滑油 3.4.2 碘量瓶 200mL 3.4.3 层析柱 3.4.3.1 净化环已烷层析柱长 500mm内径 25mm 玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱 3.4.3.2 样品预处理层析柱长 250mm内径 10mm 玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱 3.4.4 KD 浓缩瓶25mL带刻度容积必须进行标定带磨口玻璃塞 3.4.5 KD 蒸发瓶500mL 3.4.6 KD Snyder 柱三球常量 3.4.7 KD Snyder 柱二球微量 3.4.8 量筒500mL 3.5 玻璃毛或玻璃纤维滤纸在 400加热 1h冷却后保存在具塞磨口的玻璃瓶中 3.6 沸石在 100加热 1h冷却后保存在具塞磨口的玻璃瓶中 4 试样制备 4.1 样品的性质 4.1.1 样品名称水样 4.1.2 样品状态液体 4.1.3 样品稳定性水样中的 PAH 对光敏感 4.2 水样采集和储存方法 4.2.1 水样采集样品必须采集在玻璃容器中采样前不能用样品预洗瓶子以防止样品的沾 染或吸附防止采集表层水保证所采样品具有代表性在采样点采样及盖好瓶塞时样品 瓶要完全注满不留空气若水中有残余氯存在要在每升水中加入 80mg硫代硫酸钠2.2.5 除氯 4.2.2 水样保存水样应放在暗处4冰箱中保存采样后应尽快在 24h 内进行萃取萃取 3 后的样品在 40 天内分析完毕 4.3 水样预处理 4.3.1 水样的萃取摇匀水样用 500mL 量筒3.4.8量取 500mL 水样萃取所用水样体积视具 体情况而定可增减加入 50mL 环已烷2.2.3手摇分液漏斗放气几次后安装分液漏 斗于振荡器架上3.3振摇 5min进行萃取取下分液漏斗静置约 1530min 静置时间视 两相分开情况而定分出下层水相留待进行第二次萃取上层环已烷放入 200mL 碘量瓶 3.4.2中再用 50mL 环已烷对水样进行第二次萃取水相弃去环已烷萃取液并入同一 碘量瓶中加无水硫酸钠2.2.4至环已烷萃取液清沏至少放置 30min脱水干燥 4.3.2 萃取液的净化 4.3.2.1 饮用水的环已烷萃取液可以不经柱层析净化浓缩后直接进行 HPLC 分析 4.3.2.2 地表水及工业污水用柱层析净化 4.3.2.2.1 层析柱的装填在玻璃层析柱3.4.3.2的下端放入少量玻璃毛或玻璃纤维滤纸3.5 以支托填料 加入 3mL 环已烷2.2.1润湿柱子 称 46g弗罗里硅土 2.2.6 于小烧杯 3.4.9 用环已烷制成匀浆以湿式装柱法填入上述柱中净化地表水的柱填充 4g弗罗里硅土净 化污水的柱填充 6g弗罗里硅土放出柱中过量的环已烷至填料的界面 4.3.2.2.2 萃取液的净化从层析柱4.3.2.1的上端加入已干燥的环已烷萃取液全部溶液以 12mL 流速通过层析柱用柱已烷洗碘量瓶中的无水硫酸钠三次每次 510mL环已烷洗 涤液亦加入层析柱 回收通过柱的环已烷 被吸附在柱上的PAH用丙酮2.2.2和二氯甲烷2.2.1 的混合溶液解脱地表水用 100mL 88mL 丙酮 12mL 二氯甲烷脱附污水用 75mL 15mL 丙酮60mL 二氯甲烷脱附解脱液收集于已联接 KD 蒸发瓶3.4.5的 KD 浓缩瓶3.4.4 中加入两粒沸石3.6安装好三球 Snyder 柱3.4.6待浓缩 4.3.2.3 试样的浓缩将 KD 浓缩装置的下端浸入通风橱中的水浴锅3.7中在 6570的 水温下浓缩至约 0.5mL从水浴锅上移下 KD 浓缩装置冷却至室温取下三球 Snyder 柱 用少量丙酮洗柱及其玻璃接口洗涤液流入浓缩瓶中加入一粒新沸石装上二球 Snyder 柱 3.4.7在水浴锅中如上述浓缩定容至 0.30.5mL留待 HPLC 分析 注甲醇环已烷二氯甲烷及丙酮等是易燃的有机溶剂应在通用橱中操作 5 操作步骤 5.1 调整仪器 安装高效液相色谱仪使其达到预期的分离效果预热运转至获得稳定的基线 5.1.1 柱温35 5.1.2 流动相组成 A 泵85水2.1.215甲醇2.1.1V/V B 泵100甲醇2.1.1 5.1.3 洗脱视柱的性能可采用下列方式的一种进行洗脱或按柱的性能选择条件 5.1.3.1 恒溶剂洗脱以 92B 泵和 8A 泵流动相组成等浓度洗脱 5.1.3.2 梯度洗脱 以 60B 泵40A 泵的组成洗脱保持 20min 以 3B/min 增量至成为 96B4A 泵的组成保持至出峰完 以 8B/min 减量至成为 60B 泵40A 泵的组成保持 15min使流动相组成恒定为 下一次进样准备好条件 5.1.4 流动相流量30mL/hr 恒流或按柱的性能选定流量 5.1.5 检测器 5.1.5.1 荧光检测器3.1.3波长的选择 a. 荧光分光光度计检测器 六种 PAH 在荧光分光光度计特定的条件下最佳的激发和发射 波长如表 1 4 表 1 六种多环芳烃最佳的荧光激发和发射波长 化 合 物 激发波长 exnm 发射波长 emnm 荧蒽 365 462 苯并b荧蒽 302 452 苯并k荧蒽 302 431 苯并a芘 297 450 或 430 苯并ghi 302 419 或 407 茚苯1,2,3-cd芘 300 500 水样中含茚并123cd芘时选ex340 nmem450nm较好在此波长下茚并12 3cd芘的荧光强度较高否则选ex286 nmem430nm对苯并a芘灵敏度较高 b. 荧光计检测器 单色光荧光计使用ex300 nm em460nm 为宜 滤色器荧光计在ex300 nmem370nm 下测定 5.1.5.2 紫外检测器3.1.4在 254nm 下检测 PAH 以上几种检测器可以单独使用亦可以把荧光和紫外两种检测器串联使用 5.1.6 记录器 5.1.6.1 放大根据样品中被测组分含量调节记录仪放大档使谱图在记录纸量程内 5.1.6.2 纸速0.25cm/min 5.2 校准 5.2.1 用外标法定量 5.2.2 标准样品 5.2.2.1 标准样品的制备 在线性范围内用混合 PAH 标准溶液2.2.10.3配制几种不同浓度的标 准溶液其中最低浓度的溶液浓度应稍高于最低检测限 5.2.2.2 高效液相色谱法中使用标准样品的条件 a. 标准样品与试样进样体积最好相同两者的响应值也要相近 b. 在工作曲线范围内相对标准偏差10 c. 标准样品与试样应尽可能同时进行分析 5.2.2.3 使用次数每个工作日必须测定一种或几种浓度的标准溶液来检验校准曲线或响应因 子若某一化合物的响应值与预期值间的偏差大于 10则必须用新的标准对该化合物绘制 新的校准曲线或求出新的响应因子 5.2.3 校准数据的表示以响应值对进样量校准曲线可得一条通过原点的直线响应值与进 样量的比值为一常数可用平均比值或响应因子代替标准曲线来计算测定结果 5.3 测定 5.3.1 进样 5.3.1.1 进样方式以注射器人工进样 5.3.1.2 进样量525mL 5.3.1.3 操作用试样4.3.2.3润湿微量注射器3.1.6的针头及针筒并洗涤三次抽取样品 排出针筒中的气泡迅速注射样品至 HPLC 的柱头进行 HPLC 分析 5.3.2 记录 5.3.2.1 放大和纸速记录下放大倍数及纸速 5.3.2.2 组分的色谱峰以标样核对记下色谱峰的保留时间及对应的化合物 5.3.2.3 基线漂移记下漂移值 5.4 色谱图的考察 5.4.1 标准色谱图 5 不同填料的色谱柱化合物出峰的顺序有所不同下图为两种不同检测器串联的 16 种 PAH 标准色谱图图 1 为紫外检测器在波长 254nm 下的色谱图图 2 为荧光分光光度计在 ex286 nmem430nm 下的色谱图多环芳烃标样浓度十六种化合物皆为 2g/mL进样量 10g/mL 图 1 十六种 PAH 标样的 HPLC 紫外谱图 图 2 十六种 PAH 标样的 HPLC 荧光谱图 5.4.2 定性分析 5.4.2.1 各组分的洗脱次序 以标准谱图相对照 图 1 和图 2 为十六种 PAH 标准在 Zorbax ODS 柱的 HPLC 图出峰顺序为 1.萘2.苊稀3.苊芴4.菲5.蒽6.荧蒽7.芘8.苯并a蒽 9.苯并b荧蒽10.苯并k荧蒽11.苯并a芘12.二苯并a, h蒽13.苯并ghi14. 茚并123-cd芘 5.4.2.2 保留值以试样的保留时间和标样的保留时间相比较来定性用作定性的保留时间窗 口宽度以当天测定标样的实际保留时间变化为基准用一个化合物保留时间标准偏差的三倍 计算设定的窗口宽度 5.4.2.3 鉴定的辅助方法可用加标样使峰高叠加的方法或用停泵扫描测定各组分荧光激 发和发射谱图与对应标样的荧光图对比的办法来帮助鉴证化合物 5.4.3 定量分析 5.4.3.1 色谱峰的测量 连接峰的起点与终点之间的直线作为峰底以峰最大值到峰底的垂线为峰高垂线在时 间坐标上的对应值为保留时间通过峰高的中点作平行峰底的直线此直线与峰两侧相交 两点之间的距离为半高峰宽峰与峰底之间的面积为峰面积等于峰底乘半高峰宽 5.4.3.2 计算外标法 式中Xi试样中组分 i 的含量g/mL Ai标样中组分 i 进样量对其峰高或峰面积的比值ng/mm或 ng/mm2 Bi样品中组分 i 的峰高或峰面积mm或 mm2 Vt萃取液浓缩后的总体积L Vi注射样品的体积L Vs水样体积mL 6 结果计算 si tii i VV VBA X ⋅ ⋅⋅ 6 6.1 定性结果 根据标准色谱图各组分的保留时间 确定出被测试样品中存在的组分数目和组分的名称 6.2 定量结果 6.2.1 含量的表示方法按 5.4.3.2 公式计算水样中 PHA 的含量以 g/L 表示 6.2.2 精密度见表 2 6.2.3 准确度见表 3 6.2.4 检出限以 HPLC 最灵敏档噪音的五倍作为仪器的检出限 7 参考文献 GB 13198-1991 表 2 不同实验室测定的精密度再现性 实 验 室 编 号 PAH 项 目 1 2 3 4 5 6 7 测定平均值ng/L 2.4 1.4 72.4 4.9g/L 16.9 42.8 15.2 变异系数 2 6 4 10 15 13 3 荧蒽 测定次数 3 6 3 6 6 6 6 测定平均值ng/L 5.3 1.4 8.8 2.9g/L 36.0 24.2 1 40.1 1 变异系数 16 12 7 8 22 11 3 苯并b荧蒽 测定次数 3 6 3 6 6 6 6 测定平均值ng/L 3.5 1.5 4.6 3.3g/L 31.8 变异系数 3 6 7 10 16 苯并k荧蒽 测定次数 3 6 3 6 6 测定平均值ng/L 5.5 2.2 6.0 3.9g/L 42.6 3.3 23.7 变异系数 5 8 6 4 15 17 3 苯并a芘 测定次数 3 6 3 6 6 6 6 测定平均值ng/L 34.8 10.3 变异系数 10 6 茚苯 1,2,3-cd芘 2 测定次数 4 6 测定平均值ng/L 2.7 4.3 59.7 3.1g/L 63.5 48.3 24.7 变异系数 4 9 7 4 12 19 8 苯并ghi 测定次数 3 6 3 6 6 6 6 注 1 为苯并b荧蒽苯并k荧蒽数据 2 空格表示未检出或分不开按苯并ghi计算 7 表 3 各实验室准确度地表水加标回收率测定汇总 实 验 室 编 号 PAH 项 目 1 2 3 4 5 6 7 加标量ng/L 48 0.82 64.5 2.5 11 109 11.0 荧蒽 平均回收率 70 67 92.3 98 59 90 94 加标量ng/L 34.2 1.5 12.5 5.6 20 150 39.1 苯并b荧蒽 平均回收率 98 81.7 101 86 109 106 94 加标量ng/L 46.8 1.4 12 4.5 19.1 苯并k荧蒽 平均回收率 91 86 97 82 84 加标量ng/L 72.0 1.9 21.1 7.2 25.4 117 25.4 苯并a芘 平均回收率 80 90 93 93 72 62 93 加标量ng/L 34.8 28.8 茚苯 1,2,3-cd芘 1 平均回收率 83 86 加标量ng/L 55.2 98 69.0 1.9 38.8 300 10.8 苯并ghi 平均回收率 96 91 87 79 93 86 95 注 1 空格表示未检出或分不开按苯并ghi计算 附录 A 六种特定多环芳烃的名称结构及其在自然界的分布 补充件 多环芳烃几乎存在于所有的水中可以在水中成为溶液或为微粒物质悬浮性固体沉积 物所吸附下表所列特定的六种多环芳烃用作天然水和污水中存在的一大类多环芳烃的指示 物世界卫生组织拟定了饮用水中表列的六种特定多环芳烃总的最高可接受的水平为 200ng/L这一标准也已为欧洲经济共同体所采纳 各种不同水中六种多环芳烃总的代表性数值如下 地下水 最高达 500ng/L 地面水 最高达 1g/L 废 水 最高达 100g/L 8 附录 B 环已烷的净化方法 补充件 B1 浓硫酸净化 将环已烷与浓硫酸2.2.9共振摇用试剂水2.1.2洗涤经无水硫酸钠2.2.4干燥后进行 蒸馏 B2 柱层析净化 在一根具有玻璃活塞的玻璃柱3.4.3.1内先加入级活性碱性氧化铝2.2.650g 再从顶 端加入 20g 干燥硅胶2.2.8两种吸附剂都以干品加入用分液漏斗从柱顶端慢慢加入环已 烷通过柱的最初 50mL 环已烷再从柱的顶端重新加入在一般情况下一支柱可纯化 2.5L环 已烷若柱上出现黄色区带就必须停止过柱更换柱填料