Nrf2-ARE结合能力及其下游基因表达与燃煤型砷中毒肝损伤关系探讨.pdf

中华地方病学杂志 2015 年 5 月 20 日第 34 卷第 5 期 Chin J Endemiol袁 May 20袁 2015袁Vol. 34袁 No.5 Nrf2-ARE 结合能力及其下游基因表达与燃煤 型砷中毒肝损伤关系探讨 王祺张爱华李军唐旭东黄晓欣 [摘要] 目的 检测贵州省燃煤污染型砷中毒病区砷暴露者外周血 Nrf2 与下游抗氧化酶抗氧化反应元件 渊ARE冤序列结合能力渊Nrf2-ARE 结合能力冤及抗氧化酶基因的表达袁为深入揭示砷致机体氧化损伤机制提供依 据遥 方法 以贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区交乐村和长庆村为调查点袁在健康体检基础上选择 161 例砷暴露 者为砷暴露组袁按照叶地方性砷中毒诊断标准曳渊WS辕T211-2001冤分为病区非病人组渊21 例冤和病例组渊140 例冤袁 病例组参照叶职业性中毒性肝病诊断标准曳渊GBZ 59-2010冤进一步分为轻度肝病组渊52 例冤尧中重度肝病组渊36 例冤袁其余病例为无明显肝病组渊52 例冤曰同时选择相邻的非病区某村 45 例居民作为对照组曰采集观察对象外周 血提取血细胞核蛋白曰凝胶电泳迁移试验渊EMSA冤检测其外周血细胞核内 Nrf2-ARE 结合能力袁实时荧光定量 PCR 检测 Cu辕ZnSOD 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量遥 结果 Nrf2-ARE 结合能力检测结果显示院随砷暴露人群 肝损伤程度的加重袁其外周血细胞核内 Nrf2-ARE 结合能力逐渐升高曰与对照组渊3.14依1.34冤比较袁无明显肝病 组渊5.17依2.06冤尧轻度肝病组渊13.13依4.84冤及中重度肝病组渊32.35依14.76冤Nrf2-ARE 结合能力升高曰与病区非病 人组渊5.15依3.23冤及无明显肝病组比较袁轻度肝病组及中重度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力升高曰与轻度肝病组比 较袁中重度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力升高袁差异均有统计学意义渊F116.033袁P 0.05冤遥 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 表达结果显示院无明显肝病组尧轻度肝病组及中重度 肝病组 Cu辕Zn-SOD mRNA 相对表达量 渊1.1278尧1.2578尧1.6320冤 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量渊1.3345尧 1.9409尧2.0626冤均分别高于对照组渊0.9614 和 0.8843冤袁差异均有统计学意义渊x2 值分别为 13.065尧19.934袁P 0.05冤曰轻度肝病组及中重度肝病组 GSH-Px1 mRNA 相对表达量均高于病区非病人组渊1.2484冤袁差异均有统计 学意义渊P 0.05冤遥 相关性分析显示袁砷暴露人群外周血 Nrf2- ARE 结合能力与 Cu辕ZnSOD 和 GSH-Px1mRNA 表达量呈正相关袁r 分别为 0.271尧0.292渊P 0.01冤遥 结论 砷所致 Nrf2-ARE 结合能力升高参与了砷对 Nrf2 下游抗氧化酶基因表达的调控袁 该过程可能参与了燃煤型砷中毒肝 损伤的发生发展遥 [关键词] 砷中毒曰煤曰肝损伤曰凝胶迁移试验曰Nrf2曰ARE曰氧化损伤 A Exploration of the Relation of Nrf2-ARE Combining Capacity compared with the non- patient group 渊5.15依3.23冤and non-apparent hepatosis group, the Nrf2-ARE combining capacity of mild hepatosis group and moderately severe hepatosis group goes up; compared with mild hepatosis group, the Nrf2 -ARE combining capacity of moderately severe hepatosis group goes up. Their differences are of statistical significance渊F 116.033袁P0.05冤. The results of Cu辕Zn-SOD and GSH-Px1 mRNA expressions show the relative expression quantities of Cu辕Zn-SOD and GSH-Px1 mRNA of mild hepatosis group, moderately severe hepatosis group and non-apparent hepatosis group渊Cu辕Zn-SOD 院 1.127 8尧1.257 8尧1.632 0袁GSH-Px1院1.334 5尧1.940 9尧2.062 6冤are higher than that of the control group 渊0.961 4 and 0.884 3冤 respectively, and their differences are of statistical significance 渊x213.065尧19.934袁P0.05冤. The relative expression quantities of GSH-Px1 mRNA of mild hepatosis group and moderately severe hepatosis group are higher than that the non-patient group 渊1.248 4冤, and their differences are of statistical significance 渊P 0.05冤. The correlation analysis indicates the Nrf2-ARE combining capacity is positively related to the Cu辕Zn-SOD and GSH-Px1 mRNA expression, correlation coefficient is 0.471 and 0.592渊P0.01冤respectively. Conclusions The increase of Nrf2-ARE combining capacity by asenic participates in the regulation of Nrf2 downstream antioxidase gene expression, and this process possibly participates in occurrence and development of coal-fired arsenism hepatic injury. 揖Key words铱 arsenic poisoning曰coal曰liver injury曰EMSA曰Nrf2曰ARE曰oxidative damage 65窑窑 中华地方病学杂志 2015 年 5 月 20 日第 34 卷第 5 期 Chin J Endemiol袁 May 20袁 2015袁Vol. 34袁 No.5 物素标记 EMSA 探针-ARE 和 EMSA 探针-ARE渊碧 云天生物技术研究所冤袁兔多克隆 Nrf2 抗体渊北京博 奥森生物技术公司冤袁RNAiso Plus 和 PrimeScriptTM RT reagent Kit渊大连 TaKaRa 公司冤袁iQ SYBR Green Supermix渊美国 Bio-Rad 公司冤曰PowerPacTM 基础电 泳仪渊美国 Bio-Rad 公司冤袁ChemiDocTM XRS凝胶 成像仪 渊美国 Bio-Rad 公司冤袁 核酸蛋白检测仪袁 CFX96 实时荧光定量 PCR 仪渊美国 Bio-Rad 公司冤袁 MQX200 超级酶标仪渊美国 Bio-Tek 公司冤遥 1.3 方法 1.3.1 外周血核蛋白提取 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞袁细胞 核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒抽提核蛋白袁用二 喹啉甲酸渊BCA冤法探测蛋白浓度遥 1.3.2 Nrf2 与 ARE 结合能力检测 EMSA 法检测 Nrf2-ARE 结合能力院探针渊生物 素标记 ARE冤与核蛋白提取物渊15g 蛋白冤室温孵育 20min袁4的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳渊100V袁 55min冤袁380mA 电转印 40min 至尼龙膜遥 尼龙膜经 封闭液封闭 15min袁 链霉亲和素辣根过氧化物酶抗 体孵育 15min袁洗膜液洗膜 4 次袁每次 5min袁平衡检 测液反应 5min袁加入化学发光液袁化学发光凝胶成 像系统成像遥 结合能力的表达水平用其迁移条带的 灰度值以空白孔为参照进行比较袁得到相对灰度值 以表示 Nrf2-ARE 结合能力袁 以探针冷竞争反应及 Super-shif 反应进行质量控制遥 1.3.3 外 周 血 Cu辕Zn -SOD mRNA 和 GSH -Px1 mRNA 表达检测 常规提取总 RNA 并反转录成 cDNA袁反应体系 及条件为院 总 RNA 1滋g尧5伊PrimeScriptTM Buffer 4滋L尧PrimeScriptTMRTEnzymeMixI1滋L尧 50滋mol辕L Oligo dT Primer 1滋L尧100滋mol辕L Random 6 mers 1滋L尧RNase Freed H2O 加至 20滋L袁37 益 15 min袁85益 5 s袁-20益保存遥委托大连宝生物公司进行 引物设计和合成 Cu辕Zn-SOD渊NM_000454.4冤引物 序列院5袁-TGGTTTGCGTCGTAGTCTCCT-3袁渊上游冤袁 5袁-TGCTTCCCCACACCTTCAC-3袁渊下游 冤曰GSH- Px1渊NM_000581.2冤引物序列院5袁- AGAATGTGGCGTCCCTCTG -3袁 渊 上 游 冤袁5袁 - TTCGTTCTTGGCGTTCTCCT-3袁渊下游冤曰 内参基因 茁 -actin渊NM_001101.3冤引 物 序 列 院5袁 - TGGCACCCAGCACAATGAA -3袁 渊 上 游 冤袁5袁 - CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA -3袁 渊 下 游 冤曰 GAPDH渊NM_002046.3冤引 物 序 列 院5袁 - GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3袁渊上游冤袁 5袁-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3袁渊下游冤遥 10滋L 实时荧光定量 PCR 反应体系含 5滋L iTaq supermix 渊1伊冤尧10滋mol辕L 上下游引物各 0.4滋L尧cDNA1滋L尧 3.2滋L 灭菌去离子水遥 反应条件为 95益预变性 30s袁 95益变性 5s尧退火温度 60益袁30s袁共 39 个循环袁扩 增完毕后进行熔解曲线分析遥 所有样本重复检测 3 次袁每次均设空白对照遥 以 茁-actin 和 GAPDH 作内 参基因袁 采用 Bio-Rad CFX96 软件进行 Cu辕Zn- SODmRNA 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量计算遥 1.4 统计分析 采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析袁 计量资 料进行正态检验遥 Nrf2-ARE 结合能力数据呈正态 分布袁采用渊依s冤示袁组间比较采用单因素方差分析袁 进一步两两比较袁方差齐采用 LSD-t 检验袁方差不 齐则采用 Dunnett 检验曰mRNA 相对表达量呈偏态 分布袁以中位数渊四分位数间距冤表示袁多组间比较 采用 Kruskal-Walls H 检验和 Mann-Whitney U 检 验袁相关性分析采用 Spearman 等级相关遥 P 0.05袁 差异有统计学意义遥 2 结果 2.1 砷暴露人群外周血 Nrf2-ARE 结合能力 随砷暴露人群肝损伤程度的加重袁其外周血细 胞核内 Nrf2-ARE 结合能力逐渐升高曰 与对照组比 较袁 无明显肝病组尧 轻度肝病组及中重度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力升高曰分别与病区非病人组尧无 明显肝病组比较袁 轻度肝病组及中重度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力升高曰与轻度肝病组比较袁中重 度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力升高袁 差异均有统计 学意义渊F116.033袁P 0.05冤袁见表 1遥 表 1砷暴露人群外周血 Nrf2-ARE 结合能力 组别例数渊n冤Nrf2-ARE渊依s冤 对照组453.14依1.34 病区非病人组215.15依3.23 无明显肝病组525.17依2.06a 轻度肝病组5213.13依4.84abc 中重度肝病组3632.35依14.76 abcd 注院a 表示与对照组比较 P0.05曰b 表示与病区非病人组比较 P 0.05曰c 表示与无明显肝病组比较 P0.05曰d 表示与轻度肝病组比较 P0.05遥 图 1 砷暴露人群外周血细胞核内 Nrf2-ARE 结合能力 注院lane1院 阴性对照曰lane2-lane6院 样本 曰lane7院 探针冷竞争反应曰 lane8院Super-ship 反应 2.2 砷暴露人群外周血 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 66窑窑 中华地方病学杂志 2015 年 5 月 20 日第 34 卷第 5 期 Chin J Endemiol袁 May 20袁 2015袁Vol. 34袁 No.5 mRNA 表达 随砷暴露人群肝损伤程度的加重袁 外周血 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量逐渐升 高曰与对照组比较袁无明显肝病组尧轻度肝病组及中 重度肝病组 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 相对 表达量升高袁 差异均有统计学意义 渊x2 值分别为 13.065尧19.934袁P 0.05冤曰 与病区非病人组比较袁轻 度肝病组及中重度肝病组 GSH-Px1 mRNA 相对表 达量升高袁差异均有统计学意义渊P 0.05冤袁见表 2遥 2.3 砷暴露人群外周血 Nrf2-ARE 结合能力与 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1mRNA 表达相关性分析 砷暴露人群外周血 Nrf2-ARE 结合能力与 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1mRNA 表达量的 Spearman 秩相关分析结果表明袁 砷暴露人群外周血 Nrf2- ARE 结合能力与 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1mRNA 表 达量呈正相关袁r 分别为 0.271尧0.292渊P0.01冤,见表 3遥 3 讨论 Nrf2 是一种具有应激防御反应能力的核转录 因子袁在抗氧化反应元件渊ARE冤介导的抗氧化基因 表达中具有重要作用遥 当机体受到外源刺激时细胞 ROS 生成增多袁ROS 可氧化 Keap1 上的巯基或磷酸 化 Nrf2 分子中的丝氨酸和苏氨酸残基袁 从而改变 Keap1 或 Nrf2 空间构象袁 抑制 Keap1 表达袁 导致 Nrf2 与 Keap1 分离袁并向细胞核内转移遥 细胞核内 的 Nrf2 与小 Maf 蛋白形成异二聚体袁并与下游抗氧 化酶及域相解毒酶的 ARE 序列结合袁 激活抗氧化 基因的转录表达袁 调节细胞的解毒及抗氧化能力 [13-14]遥 有研究表明袁 砷暴露可导致细胞内活性氧 渊ROS冤水平升高袁导致细胞处于氧化应激状态[15]遥 尚有研究显示袁 在肝脏纤维化病变条件下袁Nrf2 不 仅上调自身蛋白表达, 还促进其核内转移显著增加 [16]曰在肿瘤细胞中袁Nrf2 表达也明显增强[17]遥 本课 题组前期研究观察到砷暴露人群外周血 Keap1 mRNA 表达下调袁Nrf2 mRNA 表达上调[9]袁其下游 的抗氧化基因及抗氧化酶活力均发生改变袁但关于 砷对上述通路发挥应激防御作用的必需环节要要要 Nrf2 与 ARE 结合的影响尚不清楚遥 本研究采用 EMSA 法检测砷暴露人群外周血细胞核内 Nrf2- ARE 结合能力袁结果发现随着砷暴露人群肝损伤程 度加重袁Nrf2-ARE 结合能力逐渐升高袁尤其在中重 度肝病组 Nrf2-ARE 结合能力增加更为突出袁 表明 砷暴露导致机体处于氧化应激状态后袁可激活并使 转移入核的 Nrf2 增多袁通过增强 Nrf2-ARE 结合能 力袁上调下游抗氧化酶基因的表达袁影响其酶活力袁 该系列改变与燃煤型砷中毒肝损伤的发生发展密 切相关遥 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 是 Nrf2 调控的抗氧 化酶袁与机体抗氧化作用关系密切遥 本研究发现袁随 砷暴露人群肝损伤程度的加重袁Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 相 对表 达量逐 渐 升高袁 表明 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 转录表达上调与燃煤型砷 中毒肝损伤的发生发展有关曰 研究还发现袁Nrf2- ARE 结合能力与 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量均呈显著的正相关关系袁提示 Nrf2 通路 对砷暴露产生应答袁随着 Nrf2-ARE 结合能力增强袁 下游抗氧化酶基因的表达也相应增强遥 结合课题组 前期研究结果分析袁 即随砷暴露人群 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 mRNA 相对表达量增加袁Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 活力逐渐降低[10]袁提示 Cu辕ZnSOD 和 GSH-Px1mRNA 的异常改变可能是 导致酶活力异常改变原因之一袁 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1 活力降低 可能与砷影响了抗氧化基因的转录 后调控渊mRNA 加工尧翻译和翻译后 的修饰尧 酶的基因多态性和酶的别 构调节等冤有关袁或砷通过直接攻击 抗氧化酶的活性基团袁 导致其酶活 力下降[18]遥 本研究样本量尧指标代 表性及其研究深度和系统性均有 限袁许多问题尚需要进一步探讨遥 参考文献 组别例数渊n冤Cu辕Zn-SOD mRNAGSH-Px1 mRNA 对照组450.961 8渊0.776 8耀1.245 5冤0.884 3渊0.561 8耀1.848 0冤 病区非病人组211.024 8渊0.689 5耀1.338 6冤1.248 4渊0.643 2耀1.894 3冤 无明显肝病组521.127 8渊0.796 7耀2.217 1冤a1.334 5渊0.809 0耀2.437 1冤a 轻度肝病组521.257 8渊0.882 7耀3.984 7冤a1.940 9渊1.083 7耀4.261 6冤a b 中重度肝病组361.632 0渊0.807 4耀6.570 6冤a2.062 6渊1.005 0耀7.359 4冤a b 表 2砷暴露人群外周血 Cu辕Zn-SOD 和 GSH-Px1mRNA 表达 （M） 注院a 表示与对照组比较 P0.05曰b 表示与病区非病例组比较 P0.05曰M院中位数曰渊冤内数 字为四分位数间距 变量变量Spearman 秩相关系数P 值 Nrf2-ARE 结合能力Cu辕ZnSODmRNA 表达量0.2710.000 GSH-Px1mRNA 表达量0.2920.000 表 3砷暴露人群外周血 Nrf2-ARE 结合能力与 Cu辕ZnSOD 和 GSH-Px1mRNA 表达量 Spearman 秩相关 67窑窑 中华地方病学杂志 2015 年 5 月 20 日第 34 卷第 5 期 Chin J Endemiol袁 May 20袁 2015袁Vol. 34袁 No.5 [1] 李达圣袁安冬袁曾正袁等. 贵州燃煤型砷中毒患者患恶性肿瘤死亡 观察[J].中国地方病学杂志袁2004袁23渊1冤院42-45. 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