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p53 介导的线粒体凋亡通路在燃煤型砷中毒大鼠肝损伤中的作用 谢婷婷，张爱华 贵阳医学院公共卫生学院毒理学教研室，贵州 贵阳550004 摘要目的了解燃煤型砷中毒大鼠肝细胞凋亡情况及 p53 介导的线粒体凋亡通路在砷致肝损伤中的 作用。方法Wistar 大鼠喂饲含砷量分别为 0， 25， 50 和 100 mg kg －1的饲料， 连续 90 d。采用氢化物发 生- 电感耦合等离子发射光谱法检测尿砷、 毛发砷含量; 采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标 记法检测肝细胞凋亡情况; 采用实时荧光定量 PCＲ 检测外周血和肝组织 p53， Bax， Bcl2 mＲNA 表达水平; 采用 Western blot 检测肝组织 p53，Bax，Bcl2 蛋白水平。结果随染砷剂量增加， 大鼠尿砷、 毛发砷含量 逐渐增高， 与正常对照组比较， 差异有统计学意义。砷 50，100 mg kg －1组肝细胞凋亡率 分别为 16．49 2．06， 15．83 1． 28 高于砷 0，25 mgkg －1组 分别为 9． 00 0． 59，9． 27 0． 36 ， 差异有统计学意义 P ＜0．05 。砷 100 mg kg －1组外周血 p53 mＲNA 相对表达量 2．69 1．84 和砷 25，50，100 mg kg－1 组肝组织 p53 mＲNA 相对表达量 分别为 1．63 0．28， 1．91 0．38， 1．71 0．18 均高于正常对照组 分 别为 0．86 0．15， 1．22 0．12 ; 砷 50，100 mgkg －1组外周血 Bax mＲNA 相对表达量 分别为 1． 36 0．30， 1．94 0．65 和砷 100 mg kg －1组肝组织 Bax mＲNA 相对表达量 1．34 0．23 均高于正常对照组 分别为 0．77 0．15， 0．84 0．34 ; 砷 100 mg kg －1组肝组织 Bcl2 mＲNA 相对表达量 0． 98 0．50 低 于正常对照组 2．14 1．15 ， 差异有统计学意义 P ＜0．05 。砷 25，50 和 100 mg kg －1组肝组织 p53 蛋 白相对表达量 分别为 1．06 0．56， 1．15 0．77 和 0．74 0．27 ， 砷 50 和 100 mg kg －1组肝组织 Bax 蛋 白相对表达量 分别为 0．74 0．43 和 0． 69 0． 37 ， 均高于正常对照组 分别为 0． 36 0． 19 和 0． 25 0．09 ， 差异均有统计学意义 P ＜0． 05 。结论燃煤砷暴露所致肝损伤可能与砷通过 p53 调控 Bax 和 Bcl2 的表达水平诱导肝细胞凋亡机制有关。 关键词砷中毒; 煤; 基因，p53; 细胞凋亡; 肝损伤 中图分类号Ｒ994．6，Ｒ114文献标志码A文章编号 1000- 3002 2014 02- 0210- 06 DOI 10．3867/j． issn．1000- 3002．2014．02．011 燃煤污染型地方性砷中毒 以下简称燃煤型砷 中毒 是我国特有的一种地方性砷中毒病型， 仅分 布于贵州、 陕西两省。贵州省病区于 1976 年发现， 至今临床表现典型， 病情严重， 患者除有典型皮肤病 损外， 尚具有多脏器多系统损害及高发癌症， 肝硬变 腹水和癌症是其主要死因。鉴于砷中毒危害的严重 性， 多年来， 我国政府高度关注地方性砷中毒的防制 工作， 在病区环境污染控制和人群健康教育上取得 了显著成就。由于砷致病致癌机制至今未明， 故 其一直是该领域研究的热点［ 1］。 有研究显示， 细胞凋 基金项目国家自然科学基金 81172603 ;贵州省基 金 黔科合人才团队 20124003 ;贵州省基金 黔教科 2008020 ;教育厅研究生教育创新基金 0215016 作者简介谢婷婷 1979 － ， 讲师， 博士研究生， 主要 从事地砷病发病机制研究。 通迅作者张爱华，E- mailaihuagyaliyun． com， Tel 0851 6908908 亡可能与燃煤型砷中毒肝损伤的发生发展有关［ 2］; 多种凋亡相关蛋白受 p53 调控 ［ 3］。为了解砷致机 体肝细胞凋亡与 p53 的关系， 本研究采用病区高砷 煤烘玉米粉为主要原料配制高砷饲料喂养大鼠建立 砷中毒模型 以下简称燃煤型砷中毒大鼠 ， 从 p53 介导的细胞凋亡通路探讨其在砷中毒大鼠肝损伤中 的作用， 为深化揭示燃煤型砷中毒机制提供依据。 1材料与方法 1．1仪器及试剂 Vista MPX 型 ICP- OES 光谱仪 美国 Varian 公司 ， BX51 显微镜 日本 Olympus 公司 ， Image- Pro Plus 6．0 图像分析系统 美国 Media Cybernet- ics 公司 ， 核酸蛋白分析仪 美国 Amersham 公 司 ， CFX96TM实时 PCＲ 检测系统 美国 Bio- Ｒad 公司 ， 小型垂直电泳系统及 ChemiDocTMXＲS 成像系统 美国 Bio- Ｒad 公司 。原位细胞凋亡检 012中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 测试剂盒 In Situ Cell Death Detection Kit，POD， 德国 Ｒoche 公司 ， ＲNA 抽提及逆转录试剂盒 ＲNAiso Plus， PrimeScript ＲT reagent Kit with gDNA Eraser， 大连 TaKaＲa 公司 ， 染料法实时荧 光定 量 PCＲ 试 剂 盒 iTaqTMUniversal SYBＲ Green Supermix， 美国 Bio- Ｒad 公司 ， 兔抗大鼠 p53 多克隆抗体 美国 Santa Cruz 公司 ， 兔抗大鼠 Bax、 Bcl2 多克隆抗体、 小鼠抗 GAPDH 单克隆抗体 及山羊抗小鼠 IgG- HＲP 武汉博士德生物工程有限 公司 ， 山羊抗兔 IgG- HＲP 北京鼎国昌盛生物技术 有限公司 。 1．2动物及分组 健康断乳 Wistar 大鼠24 只， 体质量80 ～100 g， 雌雄各半， 购自第三军医大学实验动物中心〔合格 证号 SCXK ﹙渝﹚ 2007- 0003〕 。根据课题组前期 人群砷暴露量估算结果， 结合大鼠经口急性毒性实 验确定染砷剂量。适应性喂养 1 周后， 将大鼠以随 机数字表法分为4 组， 每组6 只， 分别为正常对照组 和砷粮食污染组， 砷粮食污染组大鼠喂掺入高砷煤 烘玉米粉的饲料， 通过调整饲料中高砷煤烘玉米粉 所占比例控制含砷量， 饲料含砷量分别为 25，50， 100 mg kg －1， 持续 90 d。 1．3HG- ICP- OES 法检测尿砷、 毛发砷含量 实验终期收集大鼠24 h 尿液及背部毛发0．5 g 左右， 经湿法消化后采用氢化物发生- 电感耦合等离 子发射光谱法 HG- ICP- OES ［ 4］测定尿砷、 毛发砷 含量， 尿砷含量经尿肌酐校正。 1．4TUNEL 法检测肝细胞凋亡 大鼠处死后迅速分离肝脏， 用体积分数为 4 甲醛溶液固定， 常规脱水、 透明、 包埋及切片。按照 TUNEL 试剂盒说明书操作步骤及反应条件进行后 续实验。高倍镜下观察肝细胞形态、 标记强度及背 景着色， 低倍镜下用 Image- Pro Plus 6． 0 获取图像 并分析计数凋亡细胞阳性率及积分吸光度值。实验 同时设阴性对照 无末端转移酶及阳性对照 DNaseⅠ处理 ， 每张切片随机选择 10 个视野拍 摄分析， 计数 1000 个细胞。 1．5ＲT- qPCＲ 检测外周血和肝组织 p53，Bax 及 Bcl2 mＲNA 表达 常规提取大鼠外周血及肝组织总 ＲNA， 采用可 去除基因组 DNA 的逆转录试剂盒 大连 TaKaＲa 公司 合成 cDNA， 反应体系及条件参照说明书。委 托上海生工公司设计并合成引物， p53 上游 5- GC- CCATCCTTACCATCATCAC- 3， 下游 5- CACAA- ACACGAACCTCAAAGC- 3 80 bp ; Bax 上游 5- GTGGTTGCCCTTTTCTACTTTG- 3， 下游 5- CA- CAAAGATGGTCACTGTCTGC- 3 204 bp ; Bcl2 上游 5- ACGAGTGGGATACTGGAGATG- 3， 下游 5- TAGCGACGAGAGAAGTCATCC- 3 232 bp ; β- actin上 游 5- CACCCGCGAGTACAACCTTC- 3， 下游 5- CCCATACCCACCATCACACC- 3 207 bp ; GAPDH 上游 5- ACAGCAACAGGGTGGTG- GAC- 3， 下 游 5- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT- 3 252 bp 。对外周血和肝组织 cDNA 进行实时 荧光定量 PCＲ 反应， 反应体系和条件参照说明书， 扩增完毕后进行熔解曲线分析。每个样本重复检测 3 次， 实验同时设无逆转录酶对照 NＲT 和非模板 对照 NTC ， 根据扩增效率用 CFX Manager 软件 美国 Bio- Ｒad 公司 采用 2 －△△Ct计算目标基因相 对表达量。 1．6Western blot 检测肝组织 p53，Bax 和 Bcl2 蛋白表达 取肝组织 40 mg， 采用 ＲIPA 裂解液 强 及苯 甲基磺酰氟 PMSF 提取肝组织总蛋白。采用 SDS- PAGE 电泳肝组织总蛋白 40 μg ， 转印至 PVDF 膜 Millipore 后， 分别加入一抗兔抗大鼠 p53，Bax，Bcl2 多克隆抗体、 小鼠抗 GAPDH 单克 隆抗体， 及二抗山羊抗小鼠 IgG- HＲP 或山羊抗兔 IgG- HＲP 进行孵育， 采用 HＲP 化学发光试剂盒 Millipore 检测免疫化学物。采用 Image Lab 2．0 软件 美国 Bio- Ｒad 公司 分析蛋白条带强度， 以 GAPDH 作为内参照， 采用目标蛋白积分吸光度值与 内标蛋白吸光度值的比值表示目标蛋白相对表达量。 1．7统计学分析 采用 SPSS 18．0 统计软件进行数据分析， 经正 态性检验， 燃煤型砷中毒大鼠尿砷呈非正态分布， 以 中位数 四分位数 进行描述， 多组间比较采用 Kruskal- Wallis 法秩和检验; 其余指标呈正态分布， 以x s 进行描述， 多组间比较采用单因素方差分 析， 进一步两两比较采用 SNK 法， 方差不齐时将数 据对数转换后进行单因素方差分析; 尿砷、 发砷与肝 细胞凋亡率的相关性采用 Spearman 和 Pearson 相关分析; 以 P ＜0．05 为差异有统计学意义。 2结果 2．1燃煤型砷中毒大鼠尿砷、 发砷含量 表1 结果显示， 随染砷剂量增加， 大鼠尿砷和发 砷含量逐渐增加， 与正常对照组比较， 各砷粮食污染组 尿砷、 毛发砷含量均增高， 差异均有统计学意义 尿砷 χ2值为18．13， 毛发砷 F 值为107．84， P ＜0．05 。 112中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 Tab．1Arsenic contents in urine and hair of arsenic poisoning rats exposed to coal burning Arsenic/mg kg －1 Urine arsenic/μg g －1Cr Hair arsenic/μg g －1 0 Normal control81．62 47．95 －103．001．20 0．30 25678．54 453．43 －1015．13 * 8．95 3．51* 501594．02 515．26 －2280．71 * 11．88 3．53* 1002801．28 2234．51 －3409．38 * 24．54 8．05* △ Wistar rats were fed with arsenic contaminated grain for 90 d． The arsenic contents of urine and hair were detected by HG- ICP- OES． Urine arsenic was described as P25－P75and hair arsenic was described as x s，n 6． * P ＜0．05，compared with normal control group;P ＜ 0．05，compared with arsenic 25 mg kg －1 group;△P ＜0．05，compared with arsenic 50 mg kg －1 group． 2．2燃煤型砷中毒对大鼠肝细胞凋亡的影响 高倍镜下可见砷 50 和 100 mg kg －1组凋亡肝 细胞染色质致密浓缩， 黄色至深棕色， 呈新月形或环 形附在核膜周边 图 1C， D 。表 2 结果显示， 与正 常对照组比较， 砷 50 和 100 mgkg －1 组肝细胞凋 亡率升高， 差异有统计学意义 F 值为 54． 50， P ＜ 0．05 。 砷负荷与肝细胞凋亡率进行相关性分析 Fig．1Effect of arsenic on apoptosis of hepatocytes in arsenic poisoning rats caused by coal burning DAB 400 ．Anormal control;Barsenic 25 mgkg －1 group;Carsenic 50 mgkg －1 group;Darsenic 100 mgkg －1 group． Arrows show the apoptotic hepatocytes． Tab．2Effect of arsenic on apoptosis of hepatocytes in arsenic poisoning rats exposed to coal burning Arsenic/mg kg －1 Apoptotic rate/ 0 Normal control9．00 0．59 259．27 0．36 5016．49 2．06* 10015．83 1．28* See Tab． 1 for the rats treatment． x s，n 6． * P ＜ 0． 05， compared with normal control group;P ＜0．05，compared with arsenic 25 mg kg －1 group． 显示， 尿砷、 发砷含量与肝细胞凋亡率呈正相关 r 值分别为 0．636， 0．667， P ＜0．05 。 2．3燃煤型砷中毒对大鼠外周血及肝组织 p53， Bax 及 Bcl2 mＲNA 表达的影响 表3 结果显示， 随染砷剂量增加， 大鼠外周血及 肝细胞 p53，Bax mＲNA 相对表达量逐渐升高， 砷 100 mg kg －1组与正常对照组比较， 差异有统计学 意义 F 值分别为 3． 28，7． 44，8． 80 和 5． 16， P ＜0．05 ; 而大鼠外周血及肝细胞 Bcl2 mＲNA 相 对表达量呈现先升高再下降的趋势， 与正常对照和 砷 25 mg kg －1 组比较， 砷 100 mgkg －1 组肝细胞 Bcl2 mＲNA 相对表达量下降， 差异有统计学意义 F 值为 3．33， P ＜0．05 。 Tab．3Effect of arsenic on mＲNA expression of p53，Bax and Bcl2 of peripheral blood and hepatocytes in arse- nic poisoning rats exposed to coal burning Arsenic/ mg kg －1 p53 mＲNA expression BloodHepatocyte Bax mＲNA expression BloodHepatocyte Bcl2 mＲNA expression BloodHepatocyte 0 Normal control0．86 0．151．22 0．120．77 0．150．84 0．340．86 0．222．14 1．15 251．11 0．261．63 0．28*1．06 0．440．93 0．281．04 0．652．18 0．78 501．94 1．271．91 0．38*1．36 0．30*0．94 0．231．61 0．521．61 0．97 1002．69 1．84*1．71 0．18*1．94 0．65* 1．34 0．23* △0．91 0．510．98 0．50* See Tab．1 for the rats treatment． Ｒelative mＲNA expression 2 －ΔΔCt． x s， n 6．* P ＜0．05， compared with normal control group; P ＜ 0．05，compared with arsenic 25 mg kg －1 group;△P ＜0．05，compared with arsenic 50 mg kg －1 group． 212中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 2．4燃煤型砷中毒对大鼠肝组织 P53，Bax 及 Bcl2 蛋白表达的影响 表 4 和图 2 结果显示， 随染砷剂量增加， 砷 25， 50， 100 mg kg －1组大鼠肝细胞 P53 蛋白相对表达 量升高， 与正常对照组比较， 差异有统计学意义 F 值为 4．03， P ＜0．05 ; 砷 50，100 mg kg －1组大鼠 肝细胞 Bax 蛋白相对表达量升高， 与正常对照组比 较， 差异有统计学意义 F 值为 3．92， P ＜0．05 ; 而 大鼠肝细胞 Bcl2 蛋白相对表达量呈现先升高再下 降的趋势， 但各组差异无统计学意义 F 值为 0．46， P ＞0．05 。 Tab．4Effect of arsenic on protein expression of p53， Bax and Bcl2 of hepatocytes in arsenic poisoning rats exposed to coal burning Arsenic/mg kg －1 Protein expression IATarget protein∶ IAGAPDH P53BaxBcl2 0 Normal control0．36 0．190．25 0．090．35 0．14 251．06 0．56*0．38 0．120．49 0．32 501．15 0．77*0．74 0．43*0．65 0．50 1000．74 0．27*0．69 0．37*0．46 0．36 See Tab．1 for the rats treatment． IAintegrated absorbance． x s，n 6． * P ＜0．05，compared with normal control group． Fig．2Effect of arsenic on protein expression of P53， Bax and Bcl2 of hepatocytes in arsenic poisoning rats exposed to coal burning by Western blotting． Lanes 1 －4arsenic 0， 25， 50 and 100 mg kg －1，respectively． 3讨论 尿砷、 发砷是目前常用的砷暴露生物学标志， 也 是诊断砷中毒的参考依据， 可根据尿砷、 发砷与效应 标志进行剂量- 效应关系分析 ［ 5］。细胞凋亡是由基 因控制的程序性死亡， 能及时有效地清除体内出现 的过量或有潜在危险性的细胞， 维持机体内环境的 稳定， 但如果过量细胞凋亡， 就会导致机体失衡， 正 常生命活动受到破坏。研究显示， 砷可诱导人肺成 纤维细胞、 肾近曲小管上皮细胞、 神经干细胞等细胞 凋亡 ［ 6 －8］。本研究发现， 随着染砷剂量的加大， 大鼠 肝细胞凋亡率及凋亡细胞累积灰度值呈有统计学意 义的升高， 将各染砷组大鼠尿砷、 发砷含量与肝细胞 凋亡率进行相关性分析， 发现砷负荷与肝细胞凋亡 率呈正相关， 有明显剂量- 效应关系， 该结果为燃煤 砷暴露致大鼠肝细胞凋亡提供了直接证据。 p53 是一种重要的转录因子， 被认为是细胞应 激的关键调控分子之一， 可对细胞受到的各种压力 作出反应， 通过转录依赖性或非转录依赖性途径诱 导细胞周期阻滞， 细胞凋亡、 衰老， DNA 修复和细胞 代谢改变等不同反应 ［ 3］。正常情况下， p53 蛋白在 细胞中维持在极低水平， 但当 DNA 损伤， 原癌基因 活化及细胞受到其他刺激时， p53 表达量升高， 半衰 期延 长 ［ 3， 9］。有 研 究 报 道， 顺 铂 可 使 肝 癌 细 胞 HepG2p53 mＲNA 和 蛋 白 表 达 水 平 持 续 升 高 ［ 10］; 三氧化二砷可导致小鼠胚胎成纤维细胞 MEF 、 人结肠癌细胞 ＲKO， HCT116 等肿瘤细 胞中 p53 蛋白的含量增加 ［ 11］。本研究发现， 随着染 砷剂量增加， 大鼠外周血、 肝细胞 p53 mＲNA 及肝 细胞 p53 蛋白相对表达量均呈有统计学意义的升 高， 表明燃煤砷污染可上调 p53 基因转录表达及蛋 白表达水平。结合课题组前期研究结果［ 12 －13］， 推 测 p53 高表达可能与砷引起的氧化应激、 DNA 损伤 等变化有关， p53 及其调控的信号网络可能是砷中 毒作用机制中的重要环节。 诱导细胞凋亡是 p53 的重要功能之一。p53 活 化后可作为转录因子通过死亡受体途径和线粒体凋 亡途径有效诱导细胞凋亡［ 3］。Bax 与 Bcl2 同为 p53 调控的线粒体凋亡途径 Bcl2 蛋白家族成员， Bax 具有促凋亡功能， 而 Bcl2 通过与 Bax 结合形成 异二聚体发挥抗凋亡作用。Bax/Bcl2 蛋白在细胞 中的比例是决定细胞凋亡敏感性的重要因素之一， 当 Bax 在细胞内过量表达并形成同源二聚体时， 细 胞对死亡信号的反应增强， 反之细胞对凋亡不敏感。 本研究发现， 随着染砷剂量增加， 大鼠外周血、 肝细 胞 Bax mＲNA 及肝细胞 Bax 蛋白相对表达量均呈 有统计学意义的升高， 结合 p53 mＲNA 和蛋白表达 水平及肝细胞凋亡率随染砷剂量的增加而增高， 提 示砷可能通过上调 p53 蛋白水平启动细胞凋亡信 号通路， p53 介导的线粒体凋亡通路 Bax 蛋白高表 达可能是砷致肝细胞凋亡的直接原因之一。课题组 前期发现燃煤型砷中毒患者肝细胞 Fas/FasL、 Bax 蛋白水平随肝损伤加重而增强， 细胞凋亡与肝损伤 关系密切 ［ 2］， 推测 p53 介导的细胞凋亡通路参与了 砷中毒肝损伤的发生发展。研究还发现， 与 Bax 表 达量随着染砷剂量加大而逐渐增高不同， Bcl2 mＲNA和蛋白相对表达量均呈现先升高再下降的趋 312中国药理学与毒理学杂志 2014 年 4 月第 28 卷第 2 期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 28，No 2，Apr 2014 势， 砷 25， 50 mg kg －1组同时存在 Bax 和 Bcl2 表 达升高的趋势， 提示砷 25， 50 mg kg －1组肝细胞内 可能存在较强的抗凋亡效应， 这可能与砷生物效应双 向性有关， 其细胞效应双向性取决于砷暴露的时间、 剂量和细胞种类 ［ 14 ］。虽然砷100 mg kg－1组肝细胞 Bcl2 mＲNA 相对表达量呈有统计学意义的降低， 但 未观察到 Bcl2 蛋白的明显降低。有研究表明， 砷可 通过影响基因的转录后调控机制而影响蛋白表 达 ［ 15 ］。本研究中 Bcl2 转录表达与蛋白表达结果不 一致， 推测可能与基因的转录后或翻译后调控有关。 研究报道， 多个信号通路组成了复杂的调控网 络参与了肝细胞凋亡， 多种因素如乙醇、 病毒、 药物 可通过死亡受体途径、 线粒体凋亡途径、 内质网和溶 酶体改变等诱导细胞凋亡从而导致肝损伤 ［ 16］。本 研究发现， 燃煤砷暴露可致大鼠肝细胞凋亡， p53 介 导的线粒体凋亡通路可能参与了甚至肝损伤的发生 发展。燃煤砷激活 p53 的具体机制及其介导的细 胞凋亡与砷中毒肝损伤的关系， 本课题组正在进行 深入研究。 致谢贵阳医学院公共卫生学院姚茂琳、 于春、 徐玉艳、 胡勇 对本研究的帮助。 参考文献 ［ 1］ Sun DJ，Shen HM，Li X，An D，Sun XJ，Wei HL， et al． A review of ″ the 11th five- year plan″ and prospect of ″ the 12th five- year plan″ of Chinese major endemic disease prevention and control［ J］ ． Chin J Endemiol 中国地方病学杂志 ，2012，31 5 473- 475． ［ 2］ Yang DP，Li J，Huang XX，Zhang AH，He Y，Xie ZJ． Apoptosis in arsenic poisoning hepatic injury caused by coal burning［ J］ ． J Mil Surg Southwest China 西南军医 ， 2005， 7 4 1- 3． ［ 3］ Amaral JD，Xavier JM，Steer CJ，Ｒodrigues CM． The role of p53 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50 and 100 mg kg －1，respectivelyfor 90 d． The arsenic contents of urine and hair，apoptosis of hepatocytes and mＲNA expression of p53，Bax and Bcl2 in peripheral blood and hepatocytes were uated． At the same time，protein expression of p53， Bax and Bcl2 in hepatocytes were analyzed．ＲESULTSThe arsenic contents of urine and hair increased with the elevation of arsenic dose． The apoptotic rate of hepatocytes in arsenic 50 and 100 mg kg －1 group were 16． 49 2． 06 and 15． 83 1． 28，respectively which were signific