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电化学 － 表面铜螯合磁性二氧化硅固定化漆酶 联合催化降解水中五氯酚 * 李丽芳1， 2于光认1陈晓春1王颖2李亭亭1， 2 1. 北京化工大学化学工程学院， 北京 100029; 2. 北京师范大学环境学院 水环境模拟国家重点实验室， 北京 100875 摘要 利用电化学 －固定化漆酶联合工艺催化降解水中五氯酚。结果表明 反应0. 5 h 时， 五氯酚的降解效率达 82， 虽 然与单独固定化漆酶催化降解五氯酚效能没有明显区别， 但联合工艺中酶活损失较小， 反应5 h， 联合工艺的相对剩余酶 活为32. 6， 比单独使用固定化漆酶提高12， 且联合工艺脱氯能力明显提高。催化反应重复进行 5 次后， 联合工艺的 五氯酚去除率和相对剩余酶活分别为52. 3和33. 6， 分别比单独使用固定化漆酶催化降解提高38. 5和13. 7。 关键词 漆酶; 电化学; 催化氧化; 五氯酚 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201406007 THE CATALYTIC DEGＲADATION OF PENTACHLOＲOPHENOL PCPBY THE COMBINED PＲOCESS OF ELECTＲOCHEMICAL OXIDATION AND IMMOBILIZATION OF LACCASE ON Cu ⅡCHELATING MAGNETIC SILICA Li Lifang1， 2Yu Guangren1Chen Xiaochun1Wang Ying2Li Tingting1， 2 1. College of Chemical Engineering，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China; 2. State Key Laboratory of Water Environment Simulation，School of Environment，Beijing Normal University，Beijing 100875，China AbstractThe catalytic degradation of pentachlorophenol PCP in aqueous solution by the combined process of electrochemical oxidation and immobilization of laccase on Cu Ⅱchelating magnetic silica was investigated． The removal efficiency of PCP achieved 82 at the initial 0. 5 h． Compared with the immobilized laccase，the combined process showed higher residual activity of immobilized laccase although there was no significant difference in the removal efficiency of PCP between the two processes． After 5 h，the residual activity of immobilized laccase in the combined process was 32. 6，which was 12 larger than that in the immobilized laccase process． The capacity of dechloridation obviously improved in the combined process． The degradation of PCP was repeated five times;the removal efficiency of PCP and the residual activity of immobilized laccase in the combined process was 52. 3 and 33. 6 respectively，which were 38. 5 and 13. 7 higher than that in the immobilized laccase process． Keywordslaccase;electrochemical oxidation;catalytic degradation;pentachlorophenol * 国家自然科学基金 No． 21177013 ; 国家国际科技合作专项项目 No．2013DFＲ90290 。 收稿日期 2013 －09 －25 0引言 五氯酚 pentachlorophenol， PCP 作为有机农药广 泛地用于杀菌剂、 杀螺剂、 杀藻剂、 杀虫剂和除草剂， 以及木材防腐剂 ［1- 2 ］。其化学性质稳定、 残效期长、 毒 性高， 对生物体具有广谱毒性和三致作用 致畸、 致 癌、 致突变 ， 被列为环境优先监测的持久性有机污 染物之一 ［3- 5 ］。五氯酚在自然界中不断累积， 给人类 健康和自然环境都造成了严重的危害［6- 8 ］。目前处理 五氯酚的方法主要有吸附法［9 ］、 萃取法 ［10 ］、 活性污泥 法 ［11 ］、 化学沉降法［12 ］、 高级氧化法［13- 17 ］等。这些方 法普遍成本高， 易造成二次污染。近年来， 低成本的 生物法处理有机污染物逐渐占据了主导地位。 漆酶是一种含有铜原子的多酚类单电子氧化 酶 ［18 ］， 能够催化氧化许多芳香族化合物， 如氯代酚、 多氯联酚、 二氯苯胺、 杀虫剂和染料等 ［19- 21 ］， 广泛应 42 环境工程 Environmental Engineering 用于食品加工、 造纸、 废水处理和生物漂白等领 域［22 ］。游离漆酶在使用过程中容易受环境条件变化 影响而失活， 目前大多研究将漆酶固定化 ［23 ］。以前 研究将漆酶固定在磁性二氧化硅载体上， 其对二氯酚 具有较好的催化降解效果［24 ］。但由于漆酶易受污染 物毒性和环境因素的影响， 在对高毒性难降解有机物 如五氯酚的催化降解过程中容易失活。 电化学降解作为一种高级氧化方法， 能在常温常 压下， 通过有催化活性的电极反应直接或间接产生 OH ， 从而有效降解水中大多数的有机污染物［25 ］。 电催化方法以电子为氧化剂， 无需添加其他化学试 剂， 避免产生二次污染， 但其成本较高。 针对漆酶在使用过程中易受高毒性难降解有机 污染物和环境条件变化影响而失活的问题， 结合电化 学法氧化有机污染物选择性低的特点， 本文提出采用 电化学 － 固定化漆酶联合工艺催化氧化水中五氯酚， 减少漆酶使用过程中的酶活损失， 提高了固定化漆酶 的利用率， 降低成本， 为高毒性有机污染治理奠定了 一定的理论基础。 1实验部分 1. 1实验材料 漆酶 Laccase， 22. 4 U/mg， Sigma 公司 ; γ- 氯丙 基三甲氧基硅烷 山东曲阜万达化工有限公司 ; 聚 丙烯酰胺 北京格林思宝科技有限公司 ; 2， 2’ - 连氮- 双 3- 乙基苯并噻唑- 6- 磺酸铵 ABTS， Sigma 公司 ， 考马斯亮蓝Sanland- chem Interna- tional Inc ， 钛板 电极 30 mm 50 mm 1 mm ， 其余均为国产分析纯 试剂。 戴安 U 3000 型高效液相色谱仪 美国 ， HZQ- F100 型恒温摇床 哈尔滨东联电子技术开发有限公 司 ， DX- 60 型离子色谱仪 DIONEX ， DH1719A- 3 型 单路稳压稳流电源 北京大华无线电仪器厂 。 1. 2实验方法 固定化漆酶的制备见文献［ 26］ 。 电极制备方法 用砂纸将钛电极基体打磨干净， 经 40NaOH 90 ℃处理 30 min 除去表面油污后， 在 10草酸溶液煮沸1 h， 用刷子将涂覆液 8. 5 g SnCl4 5H2O 1. 5 g SbCl310 mL 浓 HCl 40 mL 正丁醇 均匀涂覆在电极表面， 120 ℃烘干 20 min， 重复 9 次， 最后一次将电极置于马弗炉， 500 ℃， 煅烧2 h 制得电 极底层。煅烧后的电极在沉积液 A 0. 11 mol/L PbO， 3. 5 mol/L NaOH 中40 ℃沉积1 h， 制得 α- PbO2 中间层， 后在沉积液 B 0.5 mol/L Pb NO3 2， 0.1 mol/L HNO3， 0. 04 mol/L KF， 10 mmol/L Er NO3 3 中20 ℃ 沉积 1 h， 沉积电流为 10 mA/cm2， 制得铒改性电极。 电化学 － 固定化漆酶联合工艺催化降解五氯酚 在 25 ℃、 电流密度 5 mA/cm2下以 0. 02 mol/L 的 Na2SO4溶液作为电解质， 采用铒改性的钛板电极催 化氧化 150 mL 初始浓度为 28. 56 mg/L 的五氯酚溶 液， 电化学氧化 15 min 后， 取电解液 50 mL 加入装有 0. 4 g 固定化漆酶的 100 mL 三角瓶中， 于 25 ℃、 105 r/min的摇床中缓慢搅拌， 在 0. 5， 1， 2， 3， 5 h 时分 别取样分析水中五氯酚和中间产物的浓度， 并测定固 定化漆酶的剩余酶活。以不使用电化学降解阶段， 只 添加同等质量固定化漆酶处理五氯酚作对比实验。 固定化漆酶的重复使用性 在 pH 5. 0 的条件 下， 在三角瓶中加入 25 mL 25. 56 mg/L 的五氯酚和 一定质量的固定化漆酶， 体系总体积为 50 mL， 混合 均匀， 在 25 ℃， 105 r/min 的条件下缓慢搅拌 2 h， 取 样测定反应体系中五氯酚的浓度， 通过磁吸， 回收固 定化漆酶并倾去反应溶液， 再加入新的五氯酚溶液， 如此反复操作 5 次。 1. 3五氯酚及氯离子浓度测定 使用戴安 U 3000 液相色谱系统测定五氯酚的浓 度， 分析柱为 C18 反向柱 ODS- 18， 5 μm， 150 mm 4. 6 mm， Varian 。五氯酚分析条件 流动相为体积比 为 85∶ 15 的甲醇/乙酸铵溶液， 其中乙酸铵浓度为 0. 02 mol/L 并用乙酸调其 pH 值至 4， 等梯度洗脱， 柱 温度为 20 2℃， 流速为 1. 0 mL/min， 检测波长为 312 nm。使用 DX- 60 型离子色谱仪测定溶液中 Cl － 浓度。 1. 4酶活性测定 称取适量的固定化漆酶于10 mL 离心管中， 加入 2. 5 mL pH 值为 5 的柠檬酸 － 磷酸氢二钠缓冲溶液 和 2. 5 mL 1 mmol/L 的 ABTS 水溶液， 在一定温度下 搅拌反应 5 min， 吸取上清液， 测定其在 420 nm 处的 吸光度值， 计算固定化漆酶的活性。 酶活的计算方法 根据朗伯 － 比耳定律 ［27 ］， 漆酶 的活性计算公式为 U 106 V总 ΔA ε Δt 式中 Δt 为反应时间; ΔA 为 Δt 时间内反应液在 420 nm的吸光度值的增加; V 为反应体系的体积; ε 为摩尔消光系数， 36 000/ mol cm 。 52 水污染防治 Water Pollution Control 2结果与讨论 2. 1电化学 －固定化漆酶联合催化氧化水中五氯酚 图 1 是载体、 单独漆酶和电化学 － 固定化漆酶联 合工艺对五氯酚的去除效能。如图 1a 所示 载体对 五氯酚具有较强的吸附作用， 搅拌 0. 5 h， 去除率达 31. 1; 2h 后去除率上升至 37. 9; 随着反应的进 行， 五氯酚去除率几乎不再变化， 说明载体对五氯酚 的吸附达到饱和。利用电化学 － 固定化漆酶联合工 艺催化降解五氯酚时， 反应 15 min 时， 五氯酚去除率 为 56. 3， 反应 0. 5 h 时， 五氯酚去除率升高到 82， 联合工艺对五氯酚的去除效果与单独采用固定 化漆酶催化降解效果没有明显区别。但在相同时间 内 图 1b ， 联合工艺中固定化漆酶的剩余酶活始终 高于单独固定化漆酶， 5 h 时， 联合工艺的剩余酶活 为 32. 6， 比固定化漆酶高 12， 原因是利用电化学 预氧化降解五氯酚后， 降低了高浓度五氯酚对漆酶的 毒性作用， 使得固定化漆酶活性损失较少。 图 1载体、 单独漆酶和电化学 － 固定化漆酶联合 工艺对五氯酚的去除效能比较 Fig． 1Comparison of perance of support and immobilized laccase and electrochemistry- immobilized laccase for removal of PCP 图 2 为联合工艺和单独漆酶降解五氯酚过程中 间产物的峰面积随时间的变化。如图 2a 所示 在用 电化学降解五氯酚 15 min 后， 出现了保留时间为 3. 3 min的中间产物， 随后采用固定化漆酶降解时， 该 物质消失同时出现了保留时间为 1. 96 min 的中间产 物。通过单个氯酚标样的保留时间可以推断联合工 艺中保留时间为 3. 3 min 的物质为一种单氯酚， 而保 留时间为 1. 96 min 的物质可能为苯酚， 说明单氯酚 脱氯转化成苯酚， 具体产物有待于进一步分析。由图 2b 可知 采用固定化漆酶降解五氯酚 15 min 后， 生成 大量保留时间为 2. 28 min 和7 min 的中间产物， 随着 反应的进行， 保留时间为 7 min 的中间产物含量迅速 减少， 保留时间为 2. 28 min 的中间产物含量也有所 降低， 这两种物质分别为苯酚或单氯酚以及二氯酚。 由于二氯酚的毒性大于苯酚且单独固定化漆酶中生 成的二氯酚的含量远远大于联合工艺中生成的苯酚 含量， 因此在整个反应过程中， 联合工艺中固定化漆 酶酶活剩余始终大于固定化漆酶。 图 2联合工艺和单独漆酶降解五氯酚过程中间产物的 峰面积随时间的变化 Fig．2Change in peak area of middle of product during the reaction systems with time 从图 3 可以看出 两种方法的反应体系中氯离子 62 环境工程 Environmental Engineering 浓度均随时间的延长而增大， 在相同反应时间内， 联 合工艺氯离子浓度均远大于单独固定化漆酶， 反应 1 h时， 氯离子浓度迅速增加， 分别达到 6. 66 mg/L 和 1. 91 mg/L; 反应 5 h 时， 两反应体系中氯离子浓度分 别为 8. 21 mg/L 和 3. 90 mg/L， 说明电化学 － 固定化 漆酶联合工艺对五氯酚具有更高的脱氯能力。 图 3电化学 － 固定化漆酶联合工艺和单独漆酶降解五氯酚 过程中所生成氯离子浓度变化 Fig．3The change in concentration of Cl － of electrochemistry- immobilized laccase and immobilized laccase for the continuous elimination of PCP 2. 2固定化漆酶催化降解水中五氯酚的重复使用性 两种工艺对五氯酚去除的重复使用性见图 4。 由图 4a 可知 电化学 － 固定化漆酶联合工艺和单独 漆酶对五氯酚去除率均随重复次数的增加而逐渐降 低， 在重复操作次数相同时， 联合工艺催化氧化五氯 酚的去除率均大于单独使用固定化漆酶。催化反应 重复操作 5 次后， 联合工艺对五氯酚去除率为 52. 3， 而单独使用固定化漆酶时五氯酚去除率仅为 13. 8。说明电化学 － 固定化漆酶联合工艺提高了 固定化漆酶的重复使用性， 增强了对水中难降解有毒 污染物的催化降解能力。 由图 4b 可知 电化学 － 固定化漆酶联合工艺和 单独漆酶降解五氯酚的相对剩余酶活均随着重复次 数的增加而逐渐降低， 在重复操作次数相同时， 联合 工艺单独使用固定化漆酶的酶活均高于单独使用固 定化漆酶。重复操作 5 次后， 联合工艺的剩余酶活为 33. 6， 单独固定化漆酶的剩余酶活为 19. 9。这 主要是因为在使用电化学降解五氯酚 15 min 后， 五 氯酚浓度的降低使得其对固定化漆酶的毒性减弱， 此 外联合工艺中间产物的毒性也小于单独固定化漆酶 降解工艺， 因而在一定程度上保留了固定化漆酶的活 性， 提高了固定化漆酶的重复使用性。 图 4电化学 － 固定化漆酶联合工艺和单独漆酶降解 五氯酚的重复使用性 Fig．4The reuse of electrochemistry- immobilized laccase and immobilized laccase for the continuous elimination of PCP 3结论 电化学 － 固定化漆酶联合工艺对水中五氯酚表 现出良好的催化降解能力， 反应 0. 5 h 时， 五氯酚的 降解效率达到 82， 反应 5 h， 联合工艺的相对剩余 酶活为 32. 6， 比单独使用固定化漆酶提高 12， 且 联合工艺脱氯能力明显提高。重复操作 5 次后， 联合 工艺的五氯酚去除率和相对剩余酶活分别为 52. 3 和 33. 6， 分别比单独使用固定化漆酶催化降解提 高 38. 5 和 13. 7， 电化学 － 固定化漆酶联合工艺 提高了漆酶的重复使用性， 增强了对水中难降解有毒 污染物的催化降解能力。 参考文献 ［1］Niu Junfeng，Bao Yueping，Li Yang， et al．Electrochemical mineralizationofpentachlorophenolPCP byTi/SnO2- Sb electrodes［J］ ． Chemosphere， 2013， 92 11 1571- 1577. ［2］Liu Jing，Zhou Xiaohong，Shi Hanchang．Inhibitory effects of pentachlorophenol on wastewater biofilms as determinedby phospholipid analysis and microelectrode［ J］． Biochemical Engineering Journal， 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