硫氧还蛋白还原酶1在燃煤污染型砷中毒病区砷暴露人群和大鼠血液和肝脏中的表达.pdf

1 2 生堡垫立痘堂苤查2 Q 1 5 生 旦2 Q 旦筮丝鲞筮 塑￡h 也J E 旦d ￡殛丛，』婴女g g 垫，2 Q 』，y 世丝，奠Q 硫氧还蛋白还原酶1 在燃煤污染型砷中毒病区 砷暴露人群和大鼠血液和肝脏中的表达 胡勇张爱华姚茂琳唐旭东黄晓欣 【摘要】目的观察硫氧还蛋白还原酶 T r x R 1 在燃煤污染型砷中毒病区砷暴露人群和大鼠血液和肝脏 中的表达。探讨其在燃煤污染型砷中毒肝损伤中的作用。方法①人群研究选择贵州省燃煤污染型砷中毒病 区1 3 3 例砷暴露者作为观察对象，依据临床检查和诊断结果分为病区非病人组 2 5 例 、无明显肝病组 3 8 例 、 轻度 4 3 例 和中重度肝病组 2 7 例 ；以非砷污染村3 4 名健康居民为对照组。采集上述观察对象的外周血，采 用实时荧光定量P C R 法检测T ⅨR lm R N A 表达，并用可见分光光度法检测1 h R 酶活力。②动物实验将3 0 只 体质量为8 0 ～1 0 0g 的W i s t a r 大鼠．采用随机数字表法按体质量分为对照组、饮水型砷中毒组和低、中、高砷 粮食污染组，共5 组。每组6 只。对照组常规喂养，饮水型砷中毒组饮用含1 0m g ／k g 三氧化二砷 A s 2 0 3 的水溶 液，低、中、高砷粮食污染组喂饲用病区高砷煤烘烤的玉米粉所配制的饲料 含砷量分别为2 5 、5 0 、1 0 0m g ／k g ， 均喂养3 个月。采用实时荧光定量P C R 法检测其外周血和肝组织中T r x R lm R N A 表达，免疫组织化学法检测 肝组织T ⅨR l 蛋白表达．可见分光光度法检测血清和肝组织中T ⅨR 酶活力。结果①人群研究结果病区非病 人组、无明显肝病组、轻度和中重度肝病组外周血T ⅨR lm R N A 表达[ 中位数 四分位数 ] 分别为1 ．5 9 98 1 ．1 2 89 。2 ．1 5 68 、1 ．4 6 93 1 ．1 4 61 ～1 ．9 7 63 、1 ．2 0 36 0 ．4 6 31 ～1 ．8 1 62 和0 ．9 1 23 0 ．6 3 18 ～1 ．5 3 50 ，轻 度和中重度肝病组均低于对照组[ 1 ．6 4 97 1 ．1 6 11 ～2 ．3 8 02 ，P 均 0 ．0 5 ] ；血清T ⅨR 酶活力分别为 3 ．1 2 - I - 0 ．7 6 、 2 ．8 14 - 0 ．8 4 、 2 ．5 24 - 0 ．7 3 、 2 ．4 2 - i - 0 ．7 6 k U ／L ，轻度和中重度肝病组均低于对照组[ 3 ．0 2 - I - 0 ．7 0 k U ／L ， P 均 0 ．0 5 ] 。②动物实验结果大鼠饮水型砷中毒组和低、中、高砷粮食污染组外周血T r x R lm R N A 表达分别 为1 ．0 5 0 ．1 4 、1 ．1 8 0 ．1 8 、1 ．0 4 0 ．1 0 、0 ．9 7 0 ．1 3 ，除低砷粮食污染组外，其余各染砷组均低于对照组 1 ．2 3 O ．1 5 ，P 均 0 ．0 5 ；肝组织T r x R lm R N A 表达分别为O ．7 8 0 ．1 0 、0 ．8 3 0 ．1 0 、0 ．7 9 0 ．0 9 、0 ．7 7 - 4 - 0 ．1 1 ，除低砷 粮食污染组外．其余各染砷组均低于对照组 O ．9 4 0 ．1 2 ，P 均 0 ．0 5 ；肝组织T ⅨR 1 蛋白表达量分别为 3 1 0 ．3 3 3 8 ．8 1 、3 1 2 ．5 0 - I - 2 3 ．3 6 、3 0 5 ．6 7 - 4 - 2 0 ．5 7 、2 9 8 ．1 7 2 3 ．5 2 ，各染砷组均低于对照组 3 4 8 ．5 0 土3 2 ．3 5 ，P 均 0 ．0 5 ；血清T r x R 酶活力分别为 4 ．2 2 0 ．7 3 、 4 ．8 6 0 ．6 3 、 4 ．0 4 0 ．5 7 、 3 ．7 3 0 ．6 4 k U ／L ，各染砷组均低 于对照组[ 9 ．5 2 1 ．0 8 k U 几，P 均 0 ．0 5 ] ；肝组织T r x R 酶活力分别为 1 4 ．8 2 1 ．6 7 、 1 8 ．7 6 2 ．7 6 、 1 4 ．9 0 2 ．1 7 、 1 1 ．5 54 - 1 ．7 4 U ／m g ，均低于对照组[ 2 3 ．7 1 3 ．0 5 U ／m g ，P 均 0 ．0 5 ] 。结论砷通过下调’r ⅨR 1 转录 表达和蛋白表达。降低其酶活力，加重燃煤污染型砷中毒肝损伤的发生发展。 【关键词】砷中毒；煤； 硫氧还蛋白还原酶1 E x p r e s s i o no ft h i o r e d o 】d nr e d u c t a s e1i nl i v e ra n dp e r i p h e r a lb l o o do fh u m a na n dr a t se x p o s e dt oa i r b o r n e a r s e n i ct h r o u g hc o a l - b u r n i n gH uY o n g ；Z h a n gAi h u a , Y a oM a o l i n , T a n gX u d o n g , H u a n gX i a o x i n ． * D e p a r t m e n t o fT o x i c o l o g y , G u a u gM e d i c dU n i v e r s i t y , G u i y a n g5 5 0 0 0 4 ，C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r Z h a n gAi h u c kE m a i l a i h u a g y a l i y u n ．c o m 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T os t u d yt h ee x p r e s s i o na n de n z y m ea c t i v i t yo ft h i o r e d o x i nr e d u c t a s e1 T r x R l i n l i v e ra n dp e r i p h e r a lb l o o do fh u m a na n dr a t se x p o s e dt oa i r b o r n ea r s e n i ct h r o u g hc o a l b u r n i n ga sw e l la si t sr o l ei n l i v e ri n j u r yo fc o a l b u r n i n g b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n g ．M e t h o d s T h i ss t u d yw a sd i v i d e di n t o2p a r t s ．P a r t1w a sa p o p u l a t i o ns t u d y 1 3 3l o c a lr e s i d e n t se x p o s e dt o a i r b o r n ea r s e n i ct h r o u g hc o a l b u r n i n gw e r es e l e c t e da 8a r s e n i c e x p o s u r eg r o u p si n c l u d i n gan o n p a t i e n tg r o u p 2 5c a s e s ，n oo b v i o u sh e p a t o p a t h yg r o u p 3 8c a s e s ，m i l d 4 3c a s e s a n dm o d e r a t et os e v e r eh e p a t o p a t h yg r o u p s 2 7c a s e s f r o ma r e a sa f f e c t e db ye n d e m i ca r s e n i s mi nG u i z h o uP r o v i n c e ． D O I 1 0 ．3 7 6 0 ／c m a ．j ．i s s n ．2 0 9 5 - 4 2 5 5 ．2 0 1 5 ．0 1 ．0 0 4 基金项目国家自然科学基金 8 1 1 7 2 6 0 3 ；贵州省基金 黔教科2 0 0 8 0 2 0 、黔科合人才团队2 0 1 2 4 0 0 3 、黔科合J 字[ 2 0 1 2 ] 2 0 4 4 号 作者单位5 5 0 0 0 4 贵阳医学院毒理学教研室 胡勇、张爱华、姚茂琳 ；中国人民解放军第4 4 医院 唐旭东、黄晓欣 通信作者张爱华，E m a i l a i h u a g y a l i y u n ．c o i n 论著 万方数据 主堡垫友痘堂盘查垫 』至 旦2 Q 旦筮塑鲞筮 塑￡h 也』量Ⅱd 逝Q ，』墅 盟2 Q ，垫 』，y 3 垒丛 T h i r t y l b u rh e a l t h yr e s i d e n t sf r o ma r s e n i cn o ta f f e c t e da r e a sw e r es e l e c t e d 踮c o n t r o l s ．P e r i p h e r a lb l o o ds a m p l e sw e r e c o U e c t e df r o ma l lt h e s e p e o p l e ．T h ee x p r e s s i o n o fT r x R lm R N Aw a sd e t e r m i n e d b yr e a l - t i m ef l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v eP C R q P C R ，a n de n z y m ea c t i v i t yo fT r x Rw a st e s t e db yv i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t r y ．P a r t2w a sa na n i m a l e x p e r i m e n ts t u d y T h i r t yW i s t a rr a t s ，w e i g h i n ga b o u t8 0 1 0 0g ，w e r ed i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ，d r i n k i n g w a t e r b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u pa n dc o a l - b u r n i n g - b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u p i n c l u d i n gl o w ，m e d i u ma n dh i g h a r s e n i cc o n t a m i n a t e dg r a i ng r o u p s b ym e a n so fat a b l eo fr a n d o mn u m b e ra c c o r d i n gt ob o d ym a s s ，6r a t si ne a c h g r o u p ．T h ec o n t r o lg r o u pw a sf e dw i t hn o r m a ld i e tf o r3m o n t h s ；d r i n k i n g - w a t e r - b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u pa n d c o a l b u r n i n g b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u pw e r ef e dw i t h 1 0m s ／k sA s 2 0 3s o l u t i o na n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 2 5 ， 5 0 ，1 0 0m g ／k g o fa r s e n i c - c o n t a i n i n gf e e d ，r e s p e c t i v e l y ，f o r3m o n t h s ．T h ee x p r e s s i o no fT r x R lm R N Aw a s d e t e r m i n e db yq P C R ；p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e lo fT r x R1i nl i v e rt i s s u ew a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，a n d e n z y m ea c t i v i t yo fT r x Ri ns e r n ma n dl i v e rt i s s u ew a st e s t e db yv i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t r y ．R e s u l t s T h em R N A e x p r e s s i o n so fT r x R li np e r i p h e r a lb l o o dw e r e1 ．5 9 98 1 ．1 2 89 2 ．1 5 68 ，1 ．4 6 93 1 ．1 4 61 1 ．9 7 63 ，1 ．2 0 36 0 ．4 6 31 1 ．8 1 62 a n d0 ．9 1 23 0 ．6 3 18 1 ．5 3 50 ，r e s p e c t i v e l y ，a m o n gn o n - p a t i e n tg r o u p ，n oo b v i o u sh e p a t o p a t h y g r o u p ，m i l da n dm o d e r a t et os e v e r eh e p a t o p a t h yg r o u p s ．C o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p [ 1 ．6 4 97 1 ．1 6 11 2 ．3 8 02 】， t h ed i f f e r e n c e sw e r es i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a l l yi nm i l da n dm o d e r a t et os e v e r eh e p a t o p a t h yg r o u p sr a l lP 0 ．0 5 ．T h e e n z y m ea c t i v i t yo fT r x Ri np e r i p h e r a lb l o o dw a s 3 ．1 2 O ．7 6 ， 2 ．8 1 O ．8 4 ， 2 ．5 2 O ．7 3 ， 2 ．4 2 - i - O ．7 6 U ／m l ， r e s p e c t i v e l y ，i nt h o s ec o r r e s p o n d i n gg r o u p s ．C o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p [ 3 ．0 2 0 ．7 0 U ／m 1 ] ，t h ed i f f e r e n c e sw e r e s i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a l l yi nm i l da n dm o d e r a t et os e v e r eh e p a t o p a t h yg r o u p sf a l lP 0 ．0 5 ．T h em R N Ae x p r e s s i o n so f T r x R li np e r i p h e r a lb l o o dw e r e1 ．0 5 0 ．1 4 ，1 ．1 8 0 ．1 8 ，1 ．0 4 0 ．1 0a n d0 ．9 7 0 ．1 3 ，r e s p e c t i v e l y ，a m o n g d r i n k i n g w a t e r b o r n ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u p ，l o w ，m e d i u ma n dh i g ha r s e n i cc o n t a m i n a t e dg r a i ng r o u p s ；a l lo f w h i c hw e r el o w e rt h a nt h a t i nt h ec o n t r o lg r o u p 1 ．2 3 0 ．1 5 ，a l lP 0 ．0 5 e x c e p tt h a to ft h el o wa r s e n i c c o n t a m i n a t e dg r a i ng r o u p ．T h em R N Ae x p r e s s i o n so fT r x R li n l i v e rt i s s u ew e r e0 ．7 8 0 ．1 0 ，0 ．8 3 0 ．1 0 ，O ．7 9 O ．0 9a n d0 ．7 7 0 ．11 ，r e s p e c t i v e l y ；a l lo fw h i c hw e r el o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p 0 ．9 4 0 ．1 2 ，a l lP 0 ．0 5 ． T h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fT r x R li nl i v e rt i s s u ew a s3 1 0 ．3 3 - i - 3 8 ．8 1 ，3 1 2 ．5 0 - 1 - 2 3 ．3 6 ，3 0 5 ．6 7 2 0 ．5 7a n d2 9 8 ．1 7 土 2 3 ．5 2 ，r e s p e c t i v e l y ，a m o n gt h ea r s e n i cp o i s o n i n gg r o u p s ；a l lo fw h i c hw e r el o w e rt h a nt h a t i nt h ec o n t r o lg r o u p 3 4 8 ．5 0 3 2 ．3 5 ，a l lP 0 ．0 5 ．T h ee n z y m ea c t i v i t yo fT r x Ri ns e r u mw a s 4 ．2 2 0 ．7 3 ， 4 ．8 6 0 ．6 3 ， 4 ．0 4 O ．5 7 ， 3 ．7 3 0 ．6 4 U ／m l ，r e s p e c t i v e l y ；a l lo fw h i c hw e r el o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p 【 9 ．5 2 1 ．0 8 U ／m l ，a l lP 0 ．0 5 1 ．T h ee n z y m ea c t i v i t yo fT r x Ri nl i v e rt i s s u ew a s 1 4 ．8 2 1 ．6 7 ， 1 8 ．7 6 2 ．7 6 ， 1 4 ．9 0 2 ．1 7 ， 11 ．5 5 土1 ．7 4 U ／m g ，r e s p e c t i v e l y ；a l lo fw h i c hw e r el o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p 【 2 3 ．71 3 ．0 5 U ／m g ，a l lP o ．0 5 ] ． C o n c l u s i o nA r s e n i ca g g r a v a t e sl i v e ri n j u r yo fc o a l b u r n i n ga r s e n i cp o i s o n i n gt h r o u g hd o w n - r e g u l a t i n gt h e e x p r e s s i o n so fT r x R lm R N Aa n dp r o t e i na n dr e d u c i n gi t se n z y m ea c t i v i t ya sw e l l ． 【K e yw o r d s 】 A r s e n i cp o i s o n i n g ； C o a l ；T h i o r e d o x i nr e d u c t a s e1 燃煤污染型地方性砷中毒是我国特有的公共 卫生问题，肝损害严重，死亡率高，发病机制尚不完 全清楚。有研究发现，氧化应激与燃煤污染型砷中 毒致病机制密切相关[ 1 ] 。硫氧还蛋白还原酶 T r x R 是机体的一种主要抗氧化酶．在维持机体的氧化还 原平衡中起重要作用[ 2 1 。T r x R l 是T 力【R 的一种主要 亚型，在许多组织中均有表达，尤其在肝脏表达丰 富[ 3 ] 。作者在既往研究基础上．选择燃煤污染型砷中 毒病区人群，侧重从转录表达和酶学水平探讨 T r x R l 在燃煤污染型砷中毒肝损伤中的作用。尽管 人群研究直接可靠，但取材困难，混杂因素多，在机 制研究方面存在较大的局限性而动物实验具备更 好控制毒物的接触剂量和接触时间．排除人群研究 中众多混杂因素，且能保证脏器组织取材等优势， 1 3 因此，本研究模拟病区燃煤污染型砷中毒病因实 际，利用病区燃煤污染的高砷粮食喂饲动物．建立 燃煤污染型砷中毒动物模型。为排除燃煤污染所致 的干扰因素，设立饮水型砷中毒对照组，通过观察 T ⅨR l 在燃煤污染型砷中毒肝损伤大鼠外周血和肝 组织中的转录表达、蛋白表达和酶活力情况。旨在 为进一步揭示燃煤污染型砷中毒致机体肝损伤的 机制提供科学依据。 1 对象与方法 1 ．1 人群研究 1 ．1 ．1 对象以贵州省兴仁县交乐村燃煤污染型砷 中毒病区为调查点，以长期生活在调查点的当地居 民，经健康体检 包括一般临床、常规肝功能、乙型 肝炎、丙型肝炎以及肝脏B 型超声波等检查 ，排除 万方数据 史堡垫立痘堂苤查垫 』生 旦2 Q 旦筮3 垒鲞复 塑￡h 鱼』E Ⅱd ￡趟丛，』墅 盟垫，2 Q 1 5 ，y 丛丝，盟Q l 嗜酒史、肝损伤药物接触史、病毒性肝炎史以及检 查指标异常者作为病区非病人组 2 5 例 。经地方 性砷中毒诊断标准 W S ／T2 1 1 - 2 0 0 1 诊断为砷中 毒的调查点居民，同上进行健康体检，排除嗜酒史、 肝损伤药物接触史、病毒性肝炎史、乙型及丙型肝 炎检查异常者，再参照职业性中毒性肝病诊断标 准 G B Z5 9 2 0 1 0 分为无明显肝病组 3 8 例 、轻度 肝病组 4 3 例 、中重度肝病组 2 7 例 。在距调查点 约1 3k m 的非燃用高砷煤且生活习惯及经济状况 与调查点相似的大果朵村．同上原则确定体检合格 的3 4 名居民作为对照组。采集上述观察对象的抗 凝静脉血0 ．51 1 1 1 和非抗凝静脉血2 ．Or I l l 。分别检测 T r x R lm R N A 表达和T r x R 酶活力。本研究经贵阳医 学院伦理委员会批准，调查对象均知情同意。 1 ．1 ．2主要仪器与试剂核酸蛋白检测仪 美国 A m e r s h a m 公司 ；C F X 9 6 实时荧光定量P C R 仪 美国 B i o R ．a d 公司 ；M Q X 2 0 0 超级酶标仪 美国B i o T e k 公司 。R N A i s oP l u s 、P r i m e S c r i p t T MR Tr e a g e n tK i t 和S Y B RP r e m i xE xT a q T Ml I 试剂盒 日本T a K a R a 公司 ；二硫代二硝基苯甲酸 D T N B 、还原型辅酶 I I N A D P H 、乙二胺四乙酸 E D T A ，美国S i g m a 公 司 。 1 ．1 ．3 外周血T r x R lm R N A 表达检测①总R N A 提取和反转录取0 ．5I l l l 外周血，采用R N A i s oP l u s 试剂盒．提取总R N A 并反转录成c D N A 。②引物设 计与合成委托大连宝生物工程有限公司进行引物 设计和合成，T r x R l N M _ 0 0 1 0 9 3 7 7 1 ．1 上游引物为 5 ’- C A G C T G G A C A G C A C A A I T G G A - 3 ’，下游为5 ’- T G C A G T C T Y G G C A A C A G C A T C 一3 ’；内参B ．肌动蛋白 B ．a e t i n ，N M _ 0 0 1 1 0 1 ．3 上游引物为57 - T G G C A C C C A G C A C A A T G A A ．37 。下游为5 ’．C T A A G T C A T A G T C C G C C T A G A A G C A ．3 ’；甘油醛一3 一磷酸脱氢酶 G A P D H ， N M3 G A G A A C ．3 ’．下游为5 ’一T G G T G A A G A C G C C A G T G G A 一3 ’。③实时荧光定量P C R 反应对提取的外周血 c D N A 标本进行实时荧光定量P C R 检测，反应体系 及条件参照说明书，扩增完毕后进行熔解曲线分 析。所有样本重复检测3 次，每次均设空白对照。④ T r x R lm R N A 相对表达量的计算采用C F XM a n a g e r 软件v e r s i o n1 ．5 ，美国B i o 。R a d 公司 ，选择均一化后 的基因表达方法进行计算。 1 ．1 ．4 血清中T r x R 酶活力检测参考文献[ 4 ] ，常 规分离血清，取待测血清样本1 0 0 斗l ，加入0 ．3 3 m m o l ／LN A D P H 水溶液7 5 斗l 和1 0m m o l ／LD T N B 反应液7 5 l ，置3 7 ℃准确反应1 0m i n ，于波长 4 0 5a m 处，间隔Im i n 测定吸光度似 值。计算公 式T r x R 酶活力 1 “m o lD T N B 1U A A 删／m i n 2 7 ．2 10 0 0 。 1 ．2 动物实验 1 ．2 ．1 燃煤污染型砷中毒大鼠肝损伤模型的建立 利用姚茂琳等瞪1 建立的燃煤污染型砷中毒大鼠肝损 伤模型进行实验研究。具体建模方法和分组如下 健康清洁级W i s t a r 大鼠3 0 只，体质量为8 0 1 0 0g ， 购自第三军医大学实验动物中心[ 合格证号S C X K 渝 2 0 0 7 ．0 0 0 3 ] 。适应性喂养l 周后，采用随机数字 表法按体质量将其分为5 组，每组6 只，雌雄各半。 实验期间所有大鼠在清洁级动物房内 室内温度 2 2 ～2 4 ℃，湿度6 0 ％～7 0 ％，光照和黑暗时间各半 分笼饲养。对照组喂饲标准饲料，低、中、高砷粮食 污染组喂饲用病区高砷煤烘烤的玉米粉所配制的 饲料 含砷量分别为2 5 、5 0 、1 0 0r a g ／k s ，均自由饮 用去离子水；饮水型砷中毒组喂饲标准饲料，自由 饮用含1 0m g ／k g 三氧化二砷 A s 2 0 3 的水溶液；均 喂养3 个月。实验结束时采集大鼠外周血和肝组 织．检测T r x R lm R N A 表达和T r x R 酶活力，以及肝 组织T r x R l 蛋白表达。本实验经贵阳医学院伦理委 员会批准，符合动物伦理学要求。 1 ．2 ．2 标本采集和处理大鼠处死前，经腹腔注射 质量分数为0 ．9 ％的戊巴比妥钠，麻醉后心脏采血， 抽取抗凝的外周静脉全血O ．5I I l l ，用于全血总R N A 提取；外周静脉非抗凝全血2 ．0I I l l ，用于T r x R 酶活 力检测。大鼠处死后，立即分离肝脏，取O ．5g 肝组 织，用于总R N A 提取；另取1 ．Og 肝组织，在体积分 数为1 0 ％的中性甲醛溶液中固定4 8h ，脱水、石蜡 包埋、切片；其余肝脏过液氮后一8 0 ℃保存，用于 T r x R 酶活力检测。 1 ．2 ．3 主要仪器与试剂Y B ．6 L F 生物组织石蜡包 埋机 孝感市亚光医用电子科技有限公司 ；R M 2 1 3 5 旋转式超薄切片机、H 1 1 2 1 0 摊片机、H 1 1 2 2 0 烘片 机、T P l 0 2 0 抽真空型脱水机 德国L e i c a 公司 ；B X 5 1 倒置显微镜 日本O l y m p u s 公司 。小鼠抗大鼠T ⅨR 1 B ．2 多克隆抗体 美国S a n t ae m z 公司 ；二氨基联 苯胺 D A B 试剂盒、磷酸缓冲液 P B S 、通用型二抗 P V 9 0 0 0 d E 京中杉金桥生物技术有限公司 。 1 ．2 ．4 外周血和肝组织中T r x R lm R N A 表达检测 总R N A 提取和反转录、实时荧光定量P C R 反应、 T r x R lm R N A 相对表达量的计算方法均与人群研究 相同。委托大连宝生物公司进行引物设计和合成， T r x R l N M _ 0 3 1 6 1 4 ．2 上游引物为5 - C A A A 哪C C G G C A G T G T G T G T C 一3 ’．下游为5 - G A G C C A T G C A A T G 万方数据 史堡丝直痘堂盘查2 Q 生 旦垫旦筮丝鲞蔓 塑g h 也』星趟迪丛。且盟Ⅱ垫，垫 ，Y 尘丝。№ G A G T C T G A G T A - 3 ’；内参B a c t i n N M _ 0 3 11 4 4 ．2 上 游引物为5 ’．G G A G A T r A C T G C C C T G G C T C C T A 一3 ． 下游为5 ’G A C T C A T C G T A C T C C T G C r l T G C T G - 3 ’内 参G A P D H N M _ 0 1 7 0 0 8 ．3 上游引物为5 - G G C A C A G T C A A G G C T G A G A A T G ．3 ’．下游为5 ’．A T G G l r G G 7 I I G A A G A C G C C A G l ’A - 3 ’。 1 ．2 ．5 免疫组织化学法检测肝组织中T r x R l 蛋白 表达采用E n v i s i o n 法进行肝组织免疫组织化学染 色，T r x R l 一抗工作浓度为1 4 0 0 ，磷酸盐缓冲液 P B S 代替一抗作阴性对照，以细胞质出现黄色或 棕黄色颗粒为阳性反应，光镜下观察5 个高倍视 野，每个视野计数1 0 0 个肝细胞，共计5 0 0 个细胞， 计数其中阳性表达细胞的总数[ 剐。 1 ．2 ～血清和肝组织中T r x R 酶活力检测血清 豫R 酶活力检测参照1 ．1 ．4 。肝组织豫R 酶活力检 测参照文献[ 7 ] ，将肝组织放人含lm m o l ／LE D T A 的P B S 中匀浆，1 30 0 0r ／m i n4 ℃离心3 0m i n 离心 半径为6c m 。二喹啉甲酸 B C A 法测量上清中蛋 白含量。将上清液于5 5 ℃加热1 0m i n ，冰水浴冷 却，1 30 0 0r ／r a i n4 ℃离心1 0m i n 离心半径为6c m ． 去除变性的蛋白，加入T r x R 分析混合物中。T r x R 分 析混合物包括5 0w lN A D P H 4 1 0 4m g ／L ，0 ．5m l E D T A O ．2m o l ／L ，1 ．0m lP B S 1 ．0t o o l ／L ，0 ．8m l D T N B 2 ．5 1 0 4m s ／L ，1 0 0w l 牛血清白蛋白 B S A ， 2 1 0 4m s ／L ，实验组10 0 0 斗l 混合物加2 0 0 仙l 样 品，对照组10 0 0 “l 混合物加入2 0 0 仙lP B S ，立即 于4 1 2n m 处，间隔1m i n 测定A 值。计算公式T r x R 酶活力 1 恤m o lD T N B 1U A A 4 l z ／m i n 1 ／2 7 ．2 蛋白含量。 1 ．3 统计学分析应用S P S S1 1 ．5 软件，人群T r x R l m R N A 相对表达量以中位数 四分位数 表示，多组 间比较进行K r u s k a l ．W a l l i s 检验；其余数据以x s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两 两比较采用L S D - t 检验。检验水准d 0 ．0 5 。 2 结果 2 ．1 砷暴露人群外周血中T D 【R 1m R N A 和T r x R 酶活力检测结果与对照组和 病区非病人组比较，轻度和中重度肝病 组T ⅨR 1m R N A 表达和’r ⅨR 酶活力均 显著降低 P 均 0 ．0 5 ；与无明显肝病 组比较．轻度和中重度肝病组T r x R l m R N A 表达明显降低，且中重度肝病组 T r x R 酶活力也明显降低 P 均 0 ．0 5 。 见表l 。 2 ．2