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渗滤液作基质培养甲烷氧化菌的工艺优化 * 梅娟1， 2赵由才2 1． 苏州科技学院 环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009; 2． 同济大学 污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海 200092 摘要 甲烷氧化菌菌液可用来制备高甲烷氧化率的填埋场覆盖材料。分析了渗滤液预处理对甲烷氧化菌培养的影响， 优化了渗滤液作基质培养甲烷氧化菌的工艺。结果表明 补充 N、 P 能改善培养效果， 使培养液的最高甲烷氧化率提 高 30以上， 稀释效果不明显。甲烷氧化会降低渗滤液中金属元素的浓度， Mn、 Fe 和 Cu 等元素含量过低可能成为老 龄渗滤液甲烷氧化菌培养的限制因素。 关键词 渗滤液; 矿化垃圾; 甲烷氧化菌; 填埋场 DOI 10. 13205/j． hjgc． 201409015 OPTIMIZATION OF METHANOTＲOPHS MIXED- CULTIVATION BY USING LEACHATE AND AGED ＲEFUSE Mei Juan1， 2Zhao Youcai2 1． Institute of Environmental Protection Application Technology， Suzhou University of Science and Technology， Suzhou 215009， China; 2． State Key Laboratory of Pollution Control ＆ Ｒesources Ｒeuse，Tongji University，Shanghai 200092，China AbstractMethanotrophs bacterium fluid could be used to prepare landfill cover materials with high methane oxidation capacity． The effect of the pretreatment of leachate on methanotrophs growth was studied for optimization of methanotrophs cultivation by using leachate as substrate． The experiment results showed that addition of N NO － 3－N and P could increase the peak of methane oxidation rate of methanotrophs liquid by 30，but dilution of leachate was ineffective． Methane oxidation could reduce the concentration of the metal elements in leachate． Obvious consumption of Mn，Fe and Cu were found during the cultivation process，and therefore low concerotration of them in old leachate might be adverse for the cultivation． Keywordsleachate;aged refuse;methanotrophs;landfill site * 国家 863 计划资助项目 2007AA06Z349 ; 江苏省建设系统科技项目 201207180015 。 收稿日期 2013 －11 －24 0引言 垃圾填埋场覆土中的好氧甲烷氧化对生活垃圾填 埋场甲烷排放具有天然调控作用， 强化覆盖层的甲烷氧 化可以明显减少填埋场甲烷的排放量 ［ 1- 3 ］， 尤其是对小 型和中老龄填埋场。有研究发现向覆盖材料中加入甲 烷氧化菌菌液可以明显加快覆盖层甲烷氧化的启动并 有效提高甲烷氧化速率 ［ 4- 7 ］。前期研究发现渗滤液原水 和处理尾水均能促进甲烷氧化菌的生长， 可利用渗滤液 耦合矿化垃圾混合培养制备甲烷氧化菌菌液 ［ 8- 9 ］。 与 NMS nitrate minimal salt medium 培养液培养 相比， 用渗滤液作基质培养时出现了甲烷氧化菌生长 受抑制的现象， 即甲烷菌对数生长期短， 没有生长稳 定期或稳定期不明显。针对这一问题， 本研究分析了 渗滤液培养甲烷氧化菌的限制性因素， 并研究了不同 渗滤液预处理方法对甲烷氧化菌培养的改进效果。 1试验部分 1. 1试验材料 矿化垃圾取自上海老港生活垃圾填埋场 8 年以上 的填埋单元， 从挖掘出的矿化垃圾中拣出器具、 钢缆等 杂物， 再用滚筒筛筛出粒径小于15 mm 的细料备用。 取上海老港生活垃圾填埋场不同填埋单元的渗 滤液， 以及填埋场运行渗滤液处理系统矿化床处理单 元的尾水， 观察渗滤液原水和处理尾水用于甲烷氧化 56 水污染防治 Water Pollution Control 菌培养的效果。渗滤液的理化性质见表 1。文中 L19、 L11、 L9 和 L8 分别代表填埋龄为 19， 11， 9， 8 年 渗滤液; LＲ 为矿化床处理尾水。 表 1渗滤液的理化性质 Table 1Physicochemical properties of each leachate sample 项目pH OＲP/ mV ρ TOC / mg L －1 ρ IC / mg L －1 ρ TN / mg L －1 ρ TP / mg L －1 L87. 6－3558. 22 084. 52 186. 57. 40 L97. 9－522. 7361. 632. 00. 20 L117. 5－298. 8465. 844. 10. 26 L197. 1－355. 1327. 7211. 50. 22 LＲ7. 9－4932. 3220. 9230. 84. 35 1. 2甲烷氧化菌的培养方法 1甲烷氧化菌的富集。取 30 g pH 值为 6 ～ 8， 含水率 10 ～ 30 的矿化垃圾， 装入 500 mL 血清 瓶。血清瓶通入 5的 CH4后密封， 放入生化培养箱 中在 30 ℃下培养 1 ～2 周。 2甲烷氧化菌的混合培养。将富集培养后的矿 化垃圾与渗滤液混合， 取混合液的上清液装入血清 瓶， 向血清瓶通入 CH4后放入生化培养箱中培养。 培养条件为 矿化垃圾和培养液的配比为 1 g ∶ 100 mL， pH 值为 7 ～9， 混合培养温度为 35 ℃。定期 分析血清瓶中的甲烷含量， 计算培养液的甲烷氧化 率。本研究用培养液的甲烷氧化率来表征甲烷氧化 菌的生长情况。 1. 3渗滤液的预处理方法 试验对渗滤液采取 3 种预处理方法 1补充 P 元素含量至 NMS 培养液水平， HPO2 － 4 和 H2PO － 4 共计 21. 5 mmol/L［10- 11 ］。 2补充 NO － 3 －N 和 P 元素含量至 NMS 培养液水 平， NO － 3 浓度为 20 mmol/L。 3渗滤液稀释 1 倍后补充 NO － 3 －N 和 P 元素含 量至 NMS 培养液水平。 1. 4分析测试方法 甲烷浓度分析。采用 Shimadzu 公司的 GC- 14B 型气相色谱仪， 选用热导检测器， 不锈钢填充柱， 柱长 2 m; 担体为 GDX- 104， 80 ～100 目; 载气为氮气， 流量 30 mL/min， 桥电流 90 mA; 检测器、 进样器及色谱柱 温度分别为90， 40， 40 ℃; 采用1 mL 的密封进样针采 样， 进样量 0. 2 mL。 渗滤液测试指标及方法。TP 采用过硫酸钾消 解 － 钼锑抗分光光度法［12 ］， NH 4 －N 采用纳氏试剂光 度法 GB 747887 ， NO － 3 －N 采用紫外分光光度法 GB 747987 ， COD 采用标准重铬酸钾法 ［12 ］。重 金属含量分析采用等离子发射光谱法［12 ］， pH 采用玻 璃电极法 GB 692086 。TN、 无机碳 IC 、 总有机 碳 TOC 采用 TOC- VCPN 型分析仪 Shimazu 测定。 2结果与分析 2. 1预处理对不同渗滤液培养过程的影响 渗滤液预处理对不同性质的渗滤液效果不同 见图 1 。 66 环境工程 Environmental Engineering 图 1预处理后不同渗滤液的甲烷氧化菌培养过程 Fig．1Influences of pretreatment of leachate on methanotrophs cultivation by using leachate and aged refuse 整体上对呈甲烷氧化抑制的 L8 渗滤液没有作 用， 对氧化率高的渗滤液 如 L19 有影响但不明显， 而对甲烷氧化率衰减快的渗滤液效果明显 如 L11 和 L9 。 2. 1. 1填埋龄 19 年的渗滤液 L19 原液的培养效果较好， 与 NMS 培养相比甲 烷氧化菌生长的启动时间稍长， 但是培养混合液的最 高甲烷氧化率较高。向渗滤液补充 NO － 3 －N 和 P 元 素后， 甲烷氧化菌生长的启动时间和混合液的最高甲 烷氧化率没有变化， 生长的稳定阶段时间延长。稀释 处理的效果不明显。 2. 1. 2填埋龄 11 年的渗滤液 L11 原液培养的对数生长期短， 甲烷氧化率在达 到最大值后降低至较低水平。三种预处理方法都改 善了培养效果， 最大甲烷氧化率升高， 由未处理的 1. 73 mL/h 变为 2. 2 mL/h。混合液的甲烷氧化率在 达到最大值后缓慢下降， 出现较明显的稳定阶段。增 加 P 含量有效避免了甲烷氧化率到最大值后快速降 低， 增加 N、 P 含量可以维持高的甲烷氧化率， 效果更 好， 但稀释处理的效果不明显。 2. 1. 3填埋龄 9 年渗滤液 L9 原液培养也存在对数生长期短， 甲烷氧化率 达到最大值后快速降低的问题。三种处理方法都改 善了培养效果， 最大甲烷氧化率升高， 出现明显生长 的稳定阶段。渗滤液补充 P 元素有效避免了甲烷氧 化率到最大值后快速降低， 但培养液的最大甲烷氧化 率没有变化。补充 N、 P 后， 最大甲烷氧化率由单独 补充 P 元素的 2. 06 mL/h 变为 2. 68 mL/h。稀释处 理的效果不明显。 2. 1. 4填埋龄 8 年渗滤液 L8 的 IC 值和 TN 值过高， 表现出对甲烷氧化菌 生长的抑制， 没有观察到甲烷氧化菌的生长。三种预 处理方法都没有效果， 甲烷氧化率无变化。 2. 1. 5渗滤液矿化床处理尾水 渗滤液 LＲ 原液培养甲烷氧化菌的效果较好， 3 种预处理方法都提高混合液的最大甲烷氧化率， 由 2. 01 mL/h 增加到 2. 25 ～ 2. 43mL/h， 同时增加 N、 P 元素的效果最好。但总体上各种处理的效果都不明 显， 并且没有根本上改变甲烷氧化率在达到最大值后 明显下降的问题。 2. 2渗滤液不同预处理方法的培养效果 2. 2. 1增加渗滤液的 P 元素含量 渗滤液补充 P 元素后， 培养效果得到了改善 L8 除外 ， 表现为培养液的甲烷氧化率达最大值后缓慢 下降， 甲烷氧化菌的生长出现了较明显的稳定阶段， 其中 L9 渗滤液的最大甲烷氧化率升高 图 2 。 图 2补充 P 元素对甲烷氧化菌培养过程的影响 Fig．2Effects of supplement of phosphorus on Methanotrophs cultivation by using leachate as substrate 2. 2. 2增加渗滤液的 N 元素含量 NH 4 －N 会抑制甲烷氧化菌的生长， 而 NO － 3 －N 对其生长有利 ［13- 15 ］， NO－ 3 －N 的加入可以有效促进渗 滤液为基质的甲烷氧化菌培养。试验表明， 渗滤液补 充 NO － 3 －N、 P 元素的效果最好， 不仅甲烷氧化菌的生 长出现较明显的稳定阶段， 渗滤液的最高甲烷氧化率 也会提高 图 3 。 2. 2. 3稀释调整渗滤液的离子浓度 试验通过稀释的方法希望降低渗滤液中部分高 浓度离子对培养的不利影响， 并在稀释后补充 N 和 P 元素维持合适的营养元素水平。该预处理方法也提 高了各渗滤液培养的甲烷氧化率， 但其效果接近或不 76 水污染防治 Water Pollution Control 图 3补充 NO－ 3－N 和 P 元素对甲烷氧化菌培养过程的影响 Fig．3Effects of supplement of NO － 3－N and phosphorus on methanotrophs cultivation by using leachate as the substrate 及直接补充 N、 P 元素 图 4 。因此， 对于老龄的渗 滤液， 其原有的成分对培养产生的抑制作用并不明 显， 没有必要进行稀释处理。而 L8 渗滤液稀释处理 后， 培养过程中仍然观测不到甲烷氧化菌的生长， 表明 其中甲烷氧化菌抑制物质的影响在该稀释比例下仍不 能消除， 而更大的稀释比例已失去渗滤液的应用意义。 整体上， 试验所研究的渗滤液与 NMS 相比， 均 属于 N、 P 等营养限制型， 在用于培养时需要添加 图 4稀释处理对甲烷氧化菌培养过程的影响 Fig．4Effects of dilution on methanotrophs cultivation by using leachate as substrate N NO － 3 －N 和 P 营养元素。而对老龄渗滤液， 其原 有成分对培养产生的抑制不明显， 没有必要进行稀释 处理。 2. 3甲烷氧化菌培养前后渗滤液成分的变化 表 2 列出了渗滤液在甲烷氧化菌培养前后不同 元素的含量。对比培养前后不同元素的含量变化， 分 析培养引起的渗滤液成分变化， 确定甲烷氧化菌在生 长过程中对各元素的吸收和利用情况， 找出对培养影 响较大的渗滤液成分。 表 2培养前后渗滤液的化学成分 Table 2Elemental contents in leachate before and after methanotrophs cultivationmg/L 元素 培养前培养后 L8L9L11L19LＲL8L9L11L19LＲ As0. 170. 150. 150. 160. 130. 120. 110. 010. 02 Zn1. 840. 671. 250. 500. 320. 830. 400. 510. 62 Pb0. 130. 100. 120. 480. 110. 010. 030. 020. 01 Ni0. 400. 110. 130. 120. 110. 370. 040. 08 Ba0. 200. 240. 280. 240. 200. 280. 270. 330. 220. 29 Fe3. 710. 440. 441. 860. 622. 080. 591. 270. 400. 17 Mn0. 210. 490. 410. 520. 070. 770. 360. 940. 05 Cr0. 120. 010. 140. 040. 040. 07 Ca38. 6097. 80113. 6063. 9095. 2090. 30140. 70168. 2093. 80163. 80 Cu0. 100. 030. 150. 130. 050. 580. 080. 190. 04 由表 2 的数据发现 培养后渗滤液中 As、 Zn、 Cu、 Pb、 Mn、 Fe 和 Ni 元素的浓度降低。其中， 甲烷氧化率 较高的培养液 Mn、 Fe 和 Cu 元素的浓度降低幅度较 其他样品大， 表明 Mn、 Fe 和 Cu 元素的浓度降低与甲 烷氧化的相关性明显， 这些元素含量过低对于某些渗 滤液是甲烷氧化菌培养的限制因素; 对于 As、 Zn、 Pb， 没有甲烷氧化菌生长的渗滤液 L8 也出现明显的浓度 变化， 表明此类元素与包括甲烷氧化在内的微生物活 动有关， 微生物的生长繁殖使其浓度明显降低。试验 结果表明， 甲烷氧化菌的生长可以降低渗滤液中大部 分金属元素的含量， 而部分金属元素含量过低有可能 成为甲烷氧化菌培养的限制性因素 如矿化床处理 尾水中 Cu 元素的浓度过低 。 3结论 1三种预处理措施都能有效促进渗滤液的甲烷 氧化菌培养 除了 L8 ， 增加 N、 P 元素的预处理效果 最好， 能提高混合培养液的最大甲烷氧化率和延长甲 烷氧化菌的稳定生长阶段。对老龄渗滤液， 其原有成 86 环境工程 Environmental Engineering 分对培养产生的抑制作用不明显， 没有必要进行稀释 处理。 2预处理对不同性质的渗滤液效果不同， 整体上 对TN 过高抑制甲烷氧化的渗滤液没有作用， 对培养过 程中甲烷氧化率衰减快的渗滤液效果最明显。与 NMS 相比， 渗滤液均属于N、 P 等营养限制型， 在用于培养时 需要添加 N 以 NO － 3 －N 形式 和 P 营养元素。 3甲烷氧化菌的生长可以降低渗滤液中大部分 金属元素的含量， 其中 Mn、 Fe 和 Cu 元素的浓度降低 与甲烷氧化的相关性明显， 尤其对 Cu 元素有明显的 消耗， 这些元素含量过低可能成为甲烷氧化菌培养的 限制因素。 参考文献 ［1］Boeckx P， Van Cleemput O， Villaralvo I． Methane emission from a landfill and the methane oxidizing capacity of its covering soil［ J］ ． Soil Biology ＆ Biochemistry， 1996， 28 10/11 1397- 1405. ［2］Bowden Ｒ，Newkrik K，Ｒukko G． Carbon dioxide and methane fluxes by a forest soil under laboratory- controlled moisture and temperature condition［J］ ． Soil Biology and Biochemistry，1998， 30 12 1591- 1597. ［3］Kightley D，Nedwell D，Cooper M． Capacity for methane oxidation in landfill cover soils measured in laboratory scale soil microcosms ［ J］． Applied and Environmental Microbiology，1995，61 2 592- 601. ［4］梅娟， 赵由才， 王莉， 等． 利用矿化垃圾富集和培养甲烷氧化菌 的研究［ J］． 有色冶金设计与研究， 2009， 30 6 101- 103. ［5］Mei J，Zhao Y C，Su Q，et al． Optimization of mixed- cultivation conditions of methanotrophs from the aged refuse［C］∥ 2011 International Conference on Material Science and Ination Technology，Singapore， 2012 4746- 4750. ［6］Mei J， Zhao Y C，Huang Ｒ H， et al． Study on influences of mixed methanotrophs agent on the methane oxidation capacity of landfill cover materials［C］∥2010 International Conference on Electrical Engineering and Auto- Controlling，Wuhan， 2011. ［7］Mei J，Wang L，Han D，et al．Methanotrophic community structure of aged refuse and its capability for methane bio- oxidation ［J］ ． Journal of Environmental Sciences- China，2011，23 5 867- 873. ［8］王罗春，刘疆鹰，赵由才，等． 城市垃圾填埋场渗滤液特性及 其处理［ J］ ． 污染防治技术， 1998， 11 2 88- 89. ［9］宋玉，李鸿江，赵由才，等． 垃圾填埋场渗滤液生物处理尾水 的性质研究［ J］ ． 环境污染与防治， 2007， 29 5 330- 332. ［ 10］Chaturapruek A， Visvanatham C， Ahn K H．Ozonation of membrane bioreactor effluent for landfill leachate treatment［J］． Environmental Technology， 2005， 26 1 65- 73. ［ 11］Setiadi T，Fairus S． Hazardous waste landfill leachate treatment using an activated sludge- membrane system［J］． Water Science and Technology， 2003， 48 8 111- 117. ［ 12］国家环保局． 水和废水监测分析方法 ［M］． 4 版． 北京中国 环境科学出版社， 2002. ［ 13］Bykova S，Boeckx P，Kravchenko I， et al．Ｒesponse of CH4 oxidation and methanotrophic diversity to NH 4 and CH4mixing ratios［ J］ ． Biology and Fertility of Soils， 2007， 43 3 341- 348. ［ 14］Ｒeay D，Nedwell D． Methane oxidation in temperate soilEffects of inorganic N［ J］ ． Soil Biology ＆ Biochemistry，2004，36 12 2059- 2065. ［ 15］Marion H，Johannes T，Katharina B，et al． Scrutinizing compost properties and their impact on methane oxidation efficiency［J］． Waste Management， 2011， 31 871- 883. 第一作者 梅娟 1976 － ， 女， 博士， 讲师， 主要研究方向为固体废弃物 处理及其资源化。 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 susie_mei163． com 上接第 44 页 ［ 14］高廷耀， 顾国维， 周琪． 水污染控制工程［M］． 3 版． 北京 高等 教育出版社， 2007. ［ 15］张丽丽， 陈效， 陈建孟， 等． 胞外多聚物在好氧颗粒污泥形成中 的作用机制［M］． 环境科学， 2007， 28 4 795- 799. ［ 16］McSwain B S， Irvine1 Ｒ L， Hausner M， et al． Composition and distribution of extracellular polymeric substances in aerobic flocs and granular sludge［ J］ ． Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71 2 1051- 1057. ［ 17］张小玲， 王志盈． 低溶解氧下 SBＲ 内短程硝化影响因素试验研 究［J］． 环境科学与技术， 2011， 34 1 163- 166. ［ 18］支霞辉， 王红武， 丁峰， 等． 常温条件下短程硝化反硝化生物脱 氮研究［ J］． 环境科学研究， 2006， 19 1 26- 29. ［ 19］Kim D J， Ahn D H， Lee D I． Effect of free ammonia and dissolved oxygen on nitrification and nitrite accumulation in a biofilm airlift reactor［J］． The Korean Journal of Chemical Engineering，2005， 22 1 85- 90. ［ 20］Anthonisen A C， Loehr Ｒ C， Prakasam T B， et al． Inhibition of nitrification by ammonia and nitrous acid［J］． Water Pollution Control Federation， 1976， 48 5 835- 852． 第一作者 刘润 1989 － ， 男， 硕士研究生， 主要从事水处理方面的研 究。liurun72163． com 通讯作者 安立超 1963 － ， 男， 博士， 教授， 主要从事水处理方面的研 究。84315532126． com 96 水污染防治 Water Pollution Control