微生物提高煤层气产量模拟实验研究_陈浩.pdf

第 44 卷 第 4 期 煤田地质与勘探 Vol. 44 No.4 2016 年 8 月 COAL GEOLOGY EXPLORATION Aug. 2016 收稿日期 2015-08-15 基金项目 国家科技重大专项项目（2011ZX05033）；中国石油天然气股份有限公司科学研究与技术开发课题（2013E-050202） Foundation itemNational Science and Technology Major Project（2011ZX05033）；Science Research and Technology Development Project of PetroChina Co. Ltd. （2013E-050202） 作者简介 陈浩（1985）， 男，湖北荆州人，硕士，工程师，从事煤层气资源评价与实验测试研究. E-mail chenhao69 引用格式 陈浩，李贵中，陈振宏，等. 微生物提高煤层气产量模拟实验研究［J］. 煤田地质与勘探，2016，44（4）64-68. CHEN Hao， LI Guizhong， CHEN Zhenhong， et al. Simulation experiment on enhancing coalbed methane production by microbes［J］. Coal Geology Exploration，2016，44（4）64-68. 文章编号 1001-1986（2016）04-0064-05 微生物提高煤层气产量模拟实验研究 陈 浩 1，李贵中1，陈振宏1，庚 勐1，邓 泽1，张 辉2 （1. 中国石油勘探开发研究院廊坊分院，河北 廊坊 065007； 2. 农业部沼气科学研究所，四川 成都 610041） 摘要 为解决微生物对煤层产气量的影响，通过对不同煤阶煤岩进行生物气模拟实验发现，在实 验室条件下煤中微生物能利用自身物质进行生物产气。通过设置不同温度实验发现，在 35℃条件 下产气量要大于 15℃时的产气量，说明 35℃的温度更适合微生物利用煤样产气。在进行定量实验 后发现，在添加外源营养物质或外源菌类的条件下能提高煤的产气量。在添加外源菌种的条件下， 增产比例可达 115％，而通过添加营养物质增产比例可达 144％。 关 键 词煤层气；产甲烷菌；生物气；煤层气增产 中图分类号P618.13 文献标识码A DOI 10.3969/j.issn.1001-1986.2016.04.012 Simulation experiment on enhancing coalbed methane production by microbes CHEN Hao1， LI Guizhong1， CHEN Zhenhong1， GENG Meng1， DENG Ze1， ZHANG Hui2 （1. Langfang Branch of Research Institute of Exploration and Development of Petrochina， Langfang 065007， China； 2. Biogas Research Institute of the Ministry of Agriculture， Chengdu 610041， China） Abstract To verify the effect of microbes on gas generation of coal beds， microbial simulation experiments have been made on different coal ranks. The result shows that microbes in coals can produce gas by themselves under laboratory conditions. With comparison of experiments under different temperatures， the gas production under 35℃ is greater than that under 15℃， indicating that it is more suitable for microbes to produce gas under 35℃. According to quantitative experiments， it is shown that the gas production is improved by adding exogenous nutrients or exogenous bacteria. Moreover， the production enhancement ratio can reach 115％ by adding exogenous bacterial species and 144％ by adding nutrients. Key words coalbed methane； methanogens； biogenic gas； enhancing coalbed methane production 我国煤层气资源潜力巨大， 中高煤阶煤层气取得 了较大的突破，而占全国资源量 40％低煤阶盆地勘 探进展却较为缓慢， 制约其发展的主要原因是热演化 程度低， 热成因作用能提供的气量有限， 而生物气发 育的甜点区不好发现， 导致钻井后的煤层气产量普遍 偏低。 同时， 由于我国各煤阶的含煤盆地大都经历了 一次或多次的构造运动， 在煤层抬升后， 煤层热演化 过程变慢或停滞， 地层压力降低， 煤层的吸附量变小， 大量的气体逸散， 导致煤层气含量偏低。 近年来有学 者研究［1-2］，在有大气降水补给的区域，由于大气淡 水的进入， 大量的生物菌类进入煤层， 在这些菌类的 作用下，煤层中的小分子物质被分解成为甲烷气体， 继续被煤层吸附仍能形成有利的煤层气藏。 因此， 开 展产甲烷菌降解煤的生物模拟实验研究微生物产气 过程将对煤层气勘探和开发有着重要的实际意义。 文献［13］提出了煤层甲烷微生物增化开采（micro- bially enhanced coalbed methane）的概念，即向煤层中 注入产甲烷菌群及营养物质，通过生物降解煤、沥青 质和石蜡等产生甲烷来增加煤层中甲烷生成量，从而 有利于煤层气开采。国外研究表明［3］，较低煤阶煤中 富含小分子量的可抽提有机物，可供微生物利用并产 气。2011 年，美国相关单位开展了通过促进微生物生 产来提高地下煤层气抽采量的现场工作。该技术方法 是先寻找适合煤层微生物群落生长的营养液配方，将 ChaoXing 第 4 期 陈浩等 微生物提高煤层气产量模拟实验研究 65 营养液注入地层中，促进微生物生长，实现煤炭到甲 烷的转化［3-4］， 这些工作从工业生产规模上证明了煤中 生物甲烷转化的可行性。 国内学者［5-7］采用厌氧培养方 法，在云南省昭通褐煤样品中成功地培养富集了活性 厌氧细菌，并开展了为期 60 d 的甲烷生成实验，分析 了生物气的生成规律、物质组成和成因机制。结果表 明，昭通盆地褐煤煤层具有较强还原性的生化环境， 有利于产甲烷菌的繁盛；生物气的生成经历了生气量 缓慢增长、显著增高、趋于减缓三个阶段，表明产甲 烷菌在经历了第一阶段缓慢繁殖后，其数量和活性在 第二阶段达到较高水平，褐煤生物气生成过程至少存 在两个以上的生气高峰阶段。 1 微生物生气机理 生物成因煤层气被认为遵从厌氧发酵理论［8］，生 物和动植物体埋藏后，首先经过喜氧微生物的耗氧降 解， 形成大分子有机质， 由于氧气的不断被消耗， 地层 环境逐渐由喜氧向厌氧的环境过渡。在厌氧生态系统 中， 第一阶段为有机单体分解为还原态有机化合物的 阶段， 发酵的碳水化合物、蛋白质、脂类等大分子有 机多聚体被水解性细菌或发酵细菌酵解为糖、 氨基酸、 脂肪酸、甘油等有机单体， 然后将有机单体进一步水 解为丙酸、丁酸、乳酸和醇类等还原态有机化合物。 第二阶段为还原态有机化合物降解为 CO2 和乙酸的 阶段，由专性产氢、产乙酸菌等将水解后的中间产物 进一步降解为乙酸、CO2 及甲酸、甲醇、甲胺之类的 C1化合物和氢。 降解分两种情况 a. 在有硝酸盐和（或） 硫酸盐存在的地质系统中，电子流首先流向硝酸盐和 （或）硫酸盐， 经过硝酸盐和（或）硫酸盐还原菌的代谢， 将还原态的有机产物氧化为 CO2和乙酸； b. 在不含硝 酸盐和（或）硫酸盐的生态环境中电子流直接流向CO2。 第三阶段为产甲烷阶段， 由同型产乙酸菌将 CO2 或 3 HCO-与氢合成乙酸， 乙酸再通过发酵生成甲烷；或 由产甲烷菌利用辅酶 M 还原系统在厌氧呼吸代谢过 程中将 CO2或通过其它发酵途径将 C1化合物转化为 甲烷［3，9］。所以生物气的形成可归结有 H2CO2 还原和 乙酸、甲基类发酵两种类型。 2 生物气模拟实验方法和过程 2.1 样品来源及基本特征 本次实验样品采自鄂尔多斯盆地与沁水盆地， 选取了有代表性的不同煤阶样品，采样均取自煤矿 井下新鲜面，在操作过程中采用快速取样后用保鲜 膜密闭，在最短的时间运送至实验室，保证煤样尽 量处于厌氧状态封存。 样品的的镜质体反射率与显微组分测定结果见 表 1。 表 1 样品的镜质体反射率与显微组分特征 Table 1 Characteristics of vitrinite reflectance and macerals ％ 采样点 煤种Rmax 镜质组 惰质组 壳质组矿物 镇城底矿 焦煤1.3082.6 16.3 - 1.1 新柳煤矿 焦煤1.3165.1 31.1 - 3.8 虎峰煤业 贫煤1.9177.0 19.0 - 4.0 双柳煤矿 焦煤1.3280.2 16.3 - 3.5 纳林庙二矿长焰煤0.5675.8 18.6 5.3 0.3 张家峁煤矿长焰煤0.5670.7 20.0 9.0 0.3 赛蒙特尔煤矿 长焰煤0.557.4 78.9 12.51.2 阿尔巴斯二矿肥煤1.1171.0 7.6 18.92.5 闫家沟煤矿长焰煤0.506.3 85.5 6.9 1.3 2.2 煤样微生物检测 2.2.1 煤样微生物 DNA 提取与测序 对微生物检测方面，主要利用分子生态学手段 对煤样进行总的 DNA 提取，提取时利用了试剂盒 原理。首先用一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶（蛋 白酶 K）对细菌细胞壁破碎，再加入十二烷基磺酸钠 （Sodium dodecyl sulfate，SDS），使 DNA 与变性的 蛋白质及其他成分分离，再利用硅类基质对 DNA 独特吸附原理对 DNA 纯化， 接着利用 16S rRNA 独 特性采用PCR技术在加入碱基对对双链DNA复制， 获取所需特定的 DNA 条带，并在凝胶电泳下检测 DNA 条带提取质量［10］。 2.2.2 宏基因组 454 序列分析 将提取到的 DNA 经过试剂盒纯化，纯化后的 DNA 稀释 10 倍作为 PCR 扩增模板，成功得到 PCR 产物。由于煤炭中生物量低，选取的虎峰、双柳、镇 城三处煤矿，仅双柳煤矿通过 454 测序质量检测。将 454焦磷酸测序得到的原始序列通过RDP数据库剔除 低质量序列，去除引物及标签序列，分别获得 1866 条古菌序列、8500 条细菌序列。细菌和古菌物种丰度 指数 Chao1 分别比对应 OTU 高出 72％、33％，以序 列相似性≥97％作为 OTU 分类指标， 细菌和古菌分别 可分为 148、158 个 OTU，其测序结果信息见表 2。 双柳煤矿古菌都属于广古菌门类，检测古菌结果见 表 3，主要以乙酸营养型产甲烷菌为主。细菌主要类 群依次为厚壁菌门 Firmi cutes（54.4％）、变形菌门 Proteobacteria（30.9％）、未培养微生物（10.8％）、热袍 菌门 Thermo togae （1.26％）。 厚壁菌门主要以氨基酸杆 菌属 Acidaminobacter 为主，占 88.3％。变形菌门包括 互营菌科 Syntrophaceae 下 Smithella 属（44.9％），脱硫 ChaoXing 66 煤田地质与勘探 第 44 卷 弧菌属 Desulfovi brio （31％）（表 4）。 表 2 双柳煤矿微生物多样性指数覆盖率表 Table 2 Comparison of diversity estimators and coverage of coal samples in Shuangliu mine 分类 序列数目 /条 OUTs /个 平均读取 长度 覆盖率 /％ Chao1 古菌 1 866 158 491 0.971 236.79 细菌 8 500 448 523 0.912 769.08 表 3 双柳煤矿焦磷酸 454 测序古菌群落检测结果 Table 3 Phylogenetic classication of the pyrosequencing analysis with archaeal composition 菌名 菌属 占总序列比例/％ Methanoculleuss 乙酸营养型产甲烷菌 85.4 Methanosaeta 乙酸营养型产甲烷菌 10.2 Methanolinea 氢营养型产甲烷菌甲烷绳菌属 0.1 Haloferax 极端嗜盐微生物类群 0.1 未培养古菌类群 4.1 表 4 焦磷酸 454 测序细菌群落检测结果 Table 4 Phylogenetic classication of the pyrosequencing analysis with bacterial composition 菌名 菌属 占总序列比例/％ Chlorobi 绿菌门 0.012 Verrucomicrobia 疣微菌门 0.024 Acidobacteria 土壤酸杆菌 0.095 Chloroflexi 绿弯菌门 0.166 Tenericutes 无壁菌类 0.190 Synergistetes 革兰氏专性厌氧杆菌 0.012 Actinobacteria 放线菌门 0.213 Thermotogae 热袍菌门 1.256 Bacteroidetes 拟杆菌 0.249 Caldiserica - 1.505 Deinococcus-Thermus 异常球菌目 0.142 Proteobacteria 变形菌门 30.869 Firmicutes 厚壁菌门 54.426 Unclassified Bacteria - 10.843 2.3 无机培养基组成及配制 依次称量蒸馏水 1 L、NaCl 0.5 g、MgCl26H2O 0.5 g、CaCl22H2O 0.1 g、NH4Cl 0.3 g、KCl 0.5 g、 KH2PO4 0.2 g、 Soil extract 5 mL、 Trace elements 284 2 mL［10］， 煮沸后稍微冷却， 加入 Cysteine-HCl 和 KOH （5 mol） 调节 pH 至6.0～6.5； 然后加入Resazurine 观 察颜色由蓝色至红色最后至无色，继续加热煮沸后， 通入无氧 N2， 调节温度保持培养基微沸 30 min 左右； 继续通入 N2/CO2混合气，并转移到加冰水桶冷却； 在 N2保护下分装，121℃灭菌 30 min［11］。 2.4 实验思路设计 将煤样研磨至 60 目，除去煤层中残余气，进行 样品分装，每组均 10 g 煤与 50 g 无机培养基，然后 添加不同的外源物质， 模拟不同条件对产气的影响， 第 1 组是在不添加外源物质的情况下模拟煤利用自 身营养物质产气进行本源菌产气潜力分析；第 24 组是添加外源菌刺激的条件下进行增产潜力分析； 第 57 组是添加不同的营养物质增产效果潜力分 析；第 8 组是空白实验作为对照组。所有样品均在 15℃、35℃条件下静止暗处理，整个操作过程都在 无氧无菌的操作箱中完成。然后每隔一段时间进行 产气量测试并改进测试频率。 表 5 生物气模拟实验设计表 Table 5 Design of biogas simulation experiment 编号实验条件 实验目的 1 本源菌产气潜力分析 2410 mL 厌氧烃降解富集物 在实验室条件下 培养菌种煤产气潜力分析 5 H2 60 mL 6 NaAc（0.5 mmol）1 mL 7 CH3OH（0.5 mmol）1 mL 添加营养物质条件下 产气潜力分析 8 对煤样进行灭菌处理 对照组 注模拟实验的添加物为10 g 煤50 g 无机培养基 3 微生物提高煤层气产量潜力分析 经过 172 d 的室内培养，大部分煤样都有不同 程度的产气现象， 说明煤利用微生物产气是可能的， 生物气的生成过程在地层条件下普遍存在。通过添 加营养物质或菌类，原本不产气的煤样也能继续产 气；而原本产气的煤样有可能继续产气或者产气受 到抑制，可能是外源物质的添加促进或破坏了之前 的产气平衡。 3.1 原煤利用本源菌产气潜力分析 在不添加任何物质的情况下，虎峰、双柳、镇城 三处煤样产气良好， 其它地区效果不明显， 可能与煤 岩的显微组分有关，产气较好的煤样镜质组含量较 高， 而产气较差的煤样惰质组含量高。 产甲烷菌是一 种厌氧微生物，可能会优先降解煤岩的镜质组部分。 从产气实验可以看出（图 1），在培养的开始一段时间 里，产气较为迅速，在培养 150 d 后产气速度减缓。 在不同温度条件下产气有明显差别， 35℃条件下产气 量要大于 15℃时的产气量，说明 35℃的温度更适合 微生物利用煤样产气，总产气量为 0.49 mmol，折合 为含气量为 0.78 m3/t。 3.2 添加菌类的增产潜力分析 通过在煤样中添加外源产甲烷菌、煤样中不添加 外源产甲烷菌、CK 组（不添加煤样，只含产甲烷菌、 无机盐）进行产气对比。其中，接种物（AHB）大部分细 菌克隆属于 5 个系统进化类群未培养的 WWE1 （4.8％～36.7％）、Clostridiales （8.9％～22.8％）、Spiroch- aetales（7.2％～10.1％）、Thermotogaceae （4.8％～6.3％）和 ChaoXing 第 4 期 陈浩等 微生物提高煤层气产量模拟实验研究 67 图 1 无机盐富集培养产甲烷试验产气趋势图 Fig.2 Gas production tendency of inorganic salt enrichment and culture Proteobacteria （5.1％～6.3％），古菌包括乙酸营养型产 甲烷古菌（Methanosaeta）、Methanomicrobia 未培养类 群及氢营养型甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）， 同时存在乙酸营养型和氢营养型产甲烷古菌。 从产 气曲线可以看出（图 2），添加外源产甲烷菌后产气 量增加，说明外源菌类的加入对产气有促进作用。 图 2 在加入外源菌后的产气曲线 Fig.2 Gas production curve of adding exogenous bacteria 3.3 添加外源营养物质的增产潜力分析 通过对不加碳源、 加氢营养基、 NaAc、 Methanol 的四组对照实验分析， 在实验室条件下累计培养135 d（图 3），通过产气曲线可以看出，在不加碳源时产 气量为 0.1 mmol，在添加 NaAc、氢营养基时产气 量有增加的现象，但添加氢营养基的产气量要大于 添加 NaAc 的产气量。而在添加 Methanol 后产气反 而有下降的趋势，说明对产气过程有抑制作用，由 此可以得出，此煤样可能以氢营养型为主。 图 3 添加不同营养基的产气曲线 Fig.3 Gas production curve of adding different nutrients 3.4 结 论 通过生物气模拟实验发现，在实验室条件下， 煤可以利用自身的微生物进行产气活动，同时也可 以在人工干预的条件下大幅度提高产量。与原煤自 然产气组相比，在添加外源菌种的条件下，产气量 可达 1.68 m3/t，增产比例可达 115％，而通过添加营 养物质可产气 1.9 m3/t，增产比例可达 144％（表 6）。 表 6 不同条件下微生物产气量 Table 6 Gas production of microorganisms under different conditions 项目 摩尔 /（mmol） 体积 /mL 折合含气量 /（m3t-1） 增产比例 /％ 本源菌 0.35 7.84 0.78 - 添加外源菌种0.75 16.8 1.68 115 添加营养物质0.85 19.04 1.9 144 4 生物气模拟实验展望 我国煤炭资源丰富，但由于部分煤层含气量偏 低，无法达到煤层气工业开采的价值［12-14］。通过对生 物气产气机理的研究，借助人工方法改善煤层的条 件， 在微生物少的地区可采取煤层微生物注入进行产 气活动。 而在某些具有生物菌的地区可通过添加营养 物质来促进生物菌的产气［15］。通过模拟实验可以看 出，理论上可使产甲烷菌利用煤层产生生物甲烷气； 此外煤层的埋藏浅， 孔隙较为发育， 注入营养物质和 菌类在技术上证明是可行的， 目前国内煤层气开发区 已大量发现有生物气的存在， 通过一定的技术手段可 以显著提高煤层气产量。 因此， 首先选取一些地质条 件满足生物气发育的地区，如地下水补给相对活跃， 煤储层厚度较大， 渗透率较高， 顶板封盖性较好的地 区， 通过室内模拟产气， 然后采取不同的注营养物质 或微生物的方案， 加快煤层自身产气或激活内源菌群 ChaoXing 68 煤田地质与勘探 第 44 卷 加速产气，以达到增产目的。 需要说明的是，通过改善煤层环境实现煤炭转 化为甲烷的技术方法目前仅在室内模拟阶段，应用 到现场仍存在很多问题，但其潜力巨大，将是未来 煤层气产业化发展的主要方向之一。 参考文献 ［1］ AHMED M，SMITH J W. 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