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2 4 生国丝直痘堂盘查垫1 2 生 旦垫旦筮31 鲞筮 魍￡b 地J 量B d 照Q ，I 墅g 型 垫，垫1 2 ，y Q 3 1 。盥垒 燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织P 1 4 和M D M 2 及突变型P 5 3 蛋白表达 夏玉洁张爱华韩雪黄晓欣 【摘要】目的观察燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织突变型P 5 3 P 5 3 m t 蛋白及其下游基因 P 1 4 “、M D M 2 蛋白的表达水平。为揭示砷致皮肤损害的分子机制提供依据。方法以自愿手术治疗的6 0 例燃 煤污染型地方性砷中毒患者作为观察对象，依据皮肤病理学诊断分为一般皮肤病变组 3 5 例 、癌前病变组 1 9 例 、癌变组 6 例 ；以某医院经病理学诊断无异常的非肿瘤手术患者的9 例皮肤组织为对照，采用免疫组织化 学E n V i s i o n 二步法检测皮肤组织中P 1 4 “r 、M D M 2 和P 5 3 m t 蛋白的表达情况。结果4 组皮肤组织P 1 4 A r * “ 蛋白 表达阳性率比较，差异有统计学意义 x 2 9 ．3 9 ，P 0 ．0 5 ；其中癌前病变组、癌变组[ 4 6 ．1 ％ 6 ／1 9 、3 3 ．3 ％ 2 ／6 ] 明显低于对照组[ 8 8 ．9 ％ 8 ／9 ，P 均 0 ．0 5 ] ；且随着皮肤病变程度的加重，P 1 4 “r 蛋白表达呈降低趋势 P 0 ．0 5 。4 组皮肤组织M D M 2 、P 5 3 m t 蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义 X 2 值分别为6 ．2 1 、2 0 ．6 4 ， P 均 0 ．0 5 ；其中一般病变组、癌前病变组和癌变组[ 5 4 ．2 ％ 1 9 ／3 5 、6 3 ．2 ％ 1 0 ／1 9 、6 6 ．7 ％ 4 ／6 和2 5 ．7 ％ 9 ／3 5 、7 3 ．7 ％ 1 4 ／1 9 、8 3 ．3 ％ 5 ／6 ] 明显高于对照组 O 、0 ，P 均 0 ．0 5 ；随着皮肤病变程度的加重，M D M 2 和P 5 3 m t 蛋白表达呈增强趋势 P 均 0 ．0 5 。结论燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织P 5 3 m t 蛋白表达 阳性率升高。且P 1 4 埘和M D M 2 蛋白表达异常，后者所致的细胞周期和凋亡调控失常町能是砷致皮肤病损发 生发展的原因之一。 【关键词】砷中毒；煤；基因，p 5 3 ；肿瘤抑制蛋白质p 1 4 A R F ； 原癌基因蛋白质c m d m 2 E x p r e s s i o no fP 1 4 , a w 。M D M 2a n dm u t a n tt y p eP 5 3i ns k i nt i 龉l l eo fc o a l - b u r n i n g - t y p eo fe n d e m i ca r s e n i a s i s p a t i e n t s X ／AY u 4 ‘。Z H A N GA i - h u a ，H A NX u e ，H U A N GX i a o - x i n ． “ D e p a r t m e n to f T o x c i c d g y ，S c h o o lo f P u b l i cH e a l t h ，G u i y a n gM e d i c dU n i v e r s i t y ，G u i y a n g5 5 0 0 0 4 ，C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r Z H A N GA i - h ∽．E m a i l a i h u a g y y a h o o ．c o m ．c n 【A b s t r a c t 】 O b j e c t l v e T od e t e r m i n et h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fP 1 4 A r 8 ，M D M 2a n dm u t a n tt y p eP 5 3 P 5 3 m t i ns k i ns p e c i m e n so fc o a l - b u r n i n g t y p eo fe n d e m i ca r s e n i a s i sp a t i e n t s a n dt or e v e a l t h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo ft h ed i s e a s e ．M e t h o d s S i x t ys k i ns p e c i m e n sf r o m6 0e n d e m i ca r s e n i a s i sp a t i e n t si n c l u d i n g3 5o f s k i nl e s i o n sp a t i e n t s ，1 9o fp r e c a n c e r o u sl e s i o na n d6o fs k i nc a n c e ra n d9n o r m a ls k i ns p e c i m e n sf r o mn o n - c a n c e r p a t i e n t sw e r es t u d i e d ．E x p r e s s i o no fP 1 4 肺．M D M 2a n dP 5 3 m tw a se v a l u a t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yu s i n g c o r r e s p o n d i n gm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ．R e s u l t s T h e r eW a s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ep o s i t i v er a t e so fP 1 4 舳r ， M D M 2a n dP 5 3 m ta m o n gt h e4g r o u p s X 2 9 ．3 9 ，6 ．2 1 ，2 0 ．6 4 ，a l lP 0 ．0 5 ．’1 1 1 ep o s i t i v er a t e so fP 1 4 舸i n p r e c a n c e r o u sl e s i o na n ds k i nc a n c e rs p e c i m e n sw e r e4 6 ．1 ％ 6 ／1 9 a n d3 3 ．3 ％ 2 ／6 ，r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to ft h en o r m a ls k i ns p e c i m e n s [ 8 8 ．9 ％ 8 ／9 ，a l lP 0 ．0 5 ] ．D e c r e a s e de x p r e s s i o no f P 1 4 懈w a sc o r r e l a t e dw i t ht h ed e v e l o p m e n to fd e r m o p a t h y P 0 ．0 5 ．T h ep o s i t i v er a t e so fM D M 2a n dP 5 3 m ti n s k i nl e s i o n s 。p r e c a n c e r o u sl e s i o na n ds k i nc a n c e rs p e c i m e n sw e r e5 4 ．2 ％ 1 9 ／3 5 ，6 3 ．2 ％ 1 0 ／1 9 。6 6 ．7 ％ 4 ／6 a n d 2 5 ．7 ％ 9 ／3 5 ，7 3 ．7 ％ 1 4 ／1 9 ，8 3 ．3 ％ 5 ／6 ，r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo ft h ec o n t r o l O ，O ，a l lP 3 为免疫组织 化学E n v i s i o n 二步法阳性[ 1 2 ] 。 1 ．4 统计学分析采用S P s S1 3 ．O 软件对实验数据 进行分析，组间比较采用x 2 检验，P 0 ．0 5 为差异 有统计学意义。 2 结果 2 ．1皮肤组织P 1 4 埘蛋白表达检测结果4 组 P 1 4 A a F 蛋白表达阳性率比较．差异有统计学意义 x 2 9 ．3 9 ，P 0 ．0 5 。3 个病例组P 1 4 删蛋白表达 总阳性率为4 6 ．7 ％ 2 8 ／6 0 ，其中癌前病变组和癌变 组明显低于对照组 P 均 0 ．0 5 。见表1 、图l 。 表1 对照组和砷中毒患者皮肤组织P 1 4 A ”、M D M 2 、 P 5 3 m t 蛋白表达检测结果[ 凡 ％ ] 注与对照组比较，日P 0 ．0 5 ；与一般病变组比较，b p 0 ．0 5 2 ．2 皮肤组织M D M 2 蛋白表达检测结果4 组 M D M 2 蛋白表达阳性率比较。差异有统计学意义 X 2 6 ．2 1 ，P O ．0 5 。3 个病例组M D M 2 蛋白表达 万方数据 生国些直瘟堂壁查垫1 2 生 显垫口筻31 鲞蔓 塑￡b 也j 垦 d ￡Ⅲ趔，J 垫M g ，2 Q 1 2 ， 13 L ⅨQ 总阳性率为5 5 ．0 ％ 3 3 ／6 0 ，其中一般病变组、癌前 病变组和癌变组明显高于对照组 P 均 O ．0 5 。见 表l 、图2 。 2 ．3 皮肤组织P 5 3 m t 蛋白表达检测结果4 组 P 5 3 m t 蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义 x 2 2 0 ．6 4 ，P 0 ．0 5 。3 个病例组P 5 3 m t 蛋白表达 总阳性率为4 6 ．7 ％ 2 8 ／6 0 ，其中一般病变组、癌前 病变组和癌变组明显高于对照组 J D 均 0 ．0 5 ，且癌 前病变组和癌变组高于一般病变组 P 均 0 ．0 5 。 见表1 、图3 。 3 讨论 有报道．细胞D N A 损伤后，机体通过阻滞细胞 周期、诱导细胞凋亡，避免D N A 突变以及促进D N A 修复，维持遗传的稳定性和防止细胞的恶性转化， 在这一过程中p 5 3 基因及其通路 p 1 4 ”一M D M 2 一 D 5 3 发挥了极其重要的作用[ 52 。近年来研究发现在 人类多种肿瘤中都有P 5 3 m t 、M D M 2 蛋白的过度表 达和P 1 4 。．r r 蛋白的缺失，推测它们可能参与了肿瘤 的发生过程[ 8 - 1 0 ．1 3 - 1 4 1 。 p 5 3 是一种重要的肿瘤抑制基因，主要通过其 编码的蛋白质产物 即P 5 3 蛋白 发挥功能，P 5 3 蛋 白可以抑制细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡。野生 型P 5 3 P 5 3 w t 蛋白可以监控细胞的生长，一旦细胞 D N A 发生损伤．它能阻止细胞通过G I - S 关卡，使其 停滞于G ．期，以修复损伤，或活化诱导凋亡的基因 使细胞凋亡[ 6 1 。P 5 3 m t 则失去了这一功能，带有D N A 损伤的细胞进入S 期，导致突变和癌变的发生。此 外，P 5 3 m t 蛋白还能与P 5 3 w t 蛋白聚合生成无功能 ∽Ⅲ{ 目l 应肤} 【纵．P 1 4 ”- 生n 阳r { 表达细胞棱生椋莪色；l b 砷r 1 一虹患扦应肤组织，P 1 4 ⋯“蛋n I 卅性表达，细胞梅来符色 图1光镜下免疫组织化学E n V i s i o n 法检测观察对象皮肤组织P 1 4 脚蛋白表达I D A Bx2 0 0 l 2 a ．州H f { 州止肤组织，M I M 2 斯F l ⋯悱轰选．细胞{ 磅来着色；2 b 酬I 巾雌患者皮肤组织．M D M 2 蛋白阳性表达．细胞梭哩镓黄也 图2 光镜下免疫组织化学E n V i s i o n 法检测观察对象皮肤组织M D M 2 蛋白表达l D A B 2 0 0 3 a 对照组皮肤组织。P 5 3 m t 蛋白阴性表达，细胞校未着色；3 b 砷中毒患者皮肤组织，P 5 3 m 蛋白阳性表达．细胞棱呈棕黄色 圈3 光镜下免疫组织化学E n V i s i o n 法检嗣观察对象皮肤组龈P 3 m t 蛋白表达l D A Bx2 0 0 万方数据 的聚合体，阻止P 5 3 w t 蛋白的功能[ 7 ] 。由于P 5 3 w t 蛋 白极不稳定，半衰期仅为数分钟，难以检测，因此通 常将半衰期较长的P 5 3 m t 蛋白作为研究的靶蛋白。 本研究发现，燃煤型砷中毒患者皮肤组织中P 5 3 m t 蛋白表达阳性率明显高于正常皮肤组织，并随着皮 肤病损程度的加重蛋白表达阳性率逐渐增强，提示 P 5 3 m t 蛋白可能通过抑制细胞凋亡和干扰P 5 3 w t 蛋 白功能参与燃煤型砷中毒致皮肤病损的发生和发 展。癌前病变与癌变组P 5 3 m t 蛋白表达阳性率显著 高于一般病变组．提示P 5 3 m t 蛋白作为监测砷中毒 患者皮肤恶变的早期预警生物学标志具有重要参 考意义。 p 5 3 除发生突变造成功能异常外，其他蛋白对 其调节作用的失常也可能是导致P 5 3 蛋白功能异 常的原因之一。M D M 2 是一种进化上保守的癌基 因。正常情况下，P 5 3 蛋白可以诱导M D M 2 基闪的 转录表达。M D M 2 蛋白可与P 5 3 w t 蛋白结合，促使 P 5 3 w t 蛋白经泛素化途径降解，从而阻断P 5 3 w t 的 生理功能[ 7 】。本研究未观察到M D M 2 蛋白在正常皮 肤组织中的阳性表达。而在砷中毒患者各皮肤病变 组中均有M D M 2 蛋白表达，并且随皮肤病损的加重 阳性表达率呈逐渐升高趋势，提示M D M 2 蛋白过度 表达参与了砷中毒的发生发展。其可能原因如下 高表达的M D M 2 与P 5 3 w t 蛋白结合．促进其降解， 导致P 5 3 w t 功能丧失。从而阻断P 5 3 w t 蛋白的细胞 周期阻滞和凋亡诱导功能，引起细胞的过度增殖。 进而发生癌变。 P 1 4 p 咀r 是一种具有细胞周期调节功能的蛋白． 它能减弱M D M 2 在细胞核与细胞质中的穿梭功能。 抑制M D M 2 对P 5 3 m 蛋白的降解作用，进而上调 P 5 3 w t 蛋白的活性同时P 1 4 s R r 还可加速M D M 2 的 降解，提高P 5 3 w t 蛋白的表达，增强P 5 3 的抗肿瘤 作用[ 7 ] 。本研究发现，P 1 4 埘蛋白在正常皮肤组织中 高表达，而在砷中毒各病变组中观察到不同程度的 P 1 4 柚s 表达缺失．且随着皮肤病变程度的加重蛋白 表达呈下降趋势。说明P 1 4 A R r 的表达缺失与砷致皮 肤损害的发生发展密切相关。一方面P 1 4 A R F 的表达 缺失可使P 5 3 w t 因失去P 1 4 A R F 蛋白的保护而降解． 另一方面，P 1 4 埘“ 蛋白的缺失减缓了M D M 2 的降 解，促使其在细胞内积累，进一步加速P 5 3 w t 蛋白 的降解．干扰P 5 3 w t 蛋白发挥其功能．导致癌症的 发生发展。但是，由于本研究样本量有限，其结果还 需扩大样本进一步深入探讨。 本研究结果提示，p 1 4 A 褂 - M D M 2 一p 5 3 通路与砷 中毒致病机制密切相关，P 1 4 A s r 、M D M 2 和P 5 3 任一 2 7 蛋白的异常改变，都有可能引起细胞周期调控失常 和凋亡异常，进而导致砷中毒患者皮肤病损的发生 和发展。该研究为探讨p 5 3 通路在砷中毒发生发展 中作用提供了实验基础．深入研究p 5 3 调控网络相 关分子的改变不仅对揭示砷中毒作用及其机制有 重要的科学意义。而且对寻找砷中毒早期诊断的生 物学标志具有实际应用的潜在价值。 参考文献 [ 1 ] 孙殿军，申红梅，高彦辉，等．我国“十一五”重点地方病防治成 就、存在的问题及建议[ A ] ．中华医学会地方病学分会第七次 全国地方病学术会议论文集 上册 [ M ] ．哈尔滨中国地方病 学杂志杂志社，2 0 1 l l - 6 ． [ 2 ] 张爱华．砷与健康[ M ] ．北京科学出版社，2 0 0 8 1 - 8 ． [ 3 ]刘晓立，孙殿军．砷的致癌机制[ J ] ．中国地方病学杂志，2 0 0 4 ．2 3 6 6 2 4 - 6 2 6 ． [ 4 ] 曹亚．细胞周期与肿瘤[ J ] ．国外医学- 生理、病理科学与临床 分册，2 0 0 2 ．2 2 2 1 0 3 1 0 5 ． [ 5 ] H o l l s t e i nM 。S i d r a n s k yD ，V o g e l s t e i nB 。e ta 1 ．p 5 3m u t a t i o n si n h u m a ne a n c e r s [ J 】．S e i e n c e ，1 9 9 1 。2 5 3 5 0 1 5 4 9 - 5 3 ． [ 6 ] T o l e d oF ，w a l I lG M ．R e g u l a t i n gt h ep 5 3p a t h w a y i nv i t r o h y p o t h e s e s ，i nv i v ov e r i t a s [ J ] ．N a tB e yC a n c e r ，2 0 0 6 ，6 1 2 9 0 9 ．9 2 3 ． [ 7 ] M o l lU M ，P e t r e n k o O ．T h eM D M 2 一p 5 3i n t e r a c t i o n [ J ] ．M o l C a n c e rR e s ，2 0 0 3 ，l 1 4 1 0 0 1 1 0 0 8 ． [ 8 ] A g r a w a lA ，Y a n gJ ，M u s h yR F ，e ta 1 ．R e g u l a t i o no ft h e p 1 4 A R F M d m 2 一p 5 3p a t h w a y a no v e r v i e wi n b r e a s tc a n c e r [ J ] ． E x pM o lP a t h o l 。2 0 0 6 ，8 1 2 1 1 5 - 1 2 2 ． [ 9 】B u c h ”s hL G 。N e s i n a1 P ，K a s h u b aE V ．D i f f e r e n tt r e n d so fp 5 3 ， M D M 2a n d p 1 4 A R Fe x p r e s s i o np a t t e r n si ne n d o m e t f i a l a d e n o c a r c i n o m a sv e i s u 8h y p e r p l a s i a [ J ] ．E x pO n e o l 。2 0 0 7 。2 9 4 2 8 7 2 9 4 ． [ 1 0 ] C h e n gT H ，H s uP K 。L iA F ，e ta 1 ．C o r r e l a t i o no fp 5 3 ，M D M 2 a n dp 1 4 A R F p r o t e i ne x p r e s s i o ni nh u m a ne s o p h a g e a ls q u a r n o u s c e l lc a r c i n o m a [ J ] ．J C a n c e r R e s C l i n O n c o l 。2 0 0 9 ，1 3 5 1 1 1 5 7 7 1 5 8 2 ． [ I l 】张爱华，潘雪莉．夏禾洁，等．p 5 3 基因甲基化和突变与燃煤污 染型砷中毒荚系研究[ J ] ．中华预防医学杂志，2 0 1 l 。4 5 5 3 9 3 3 9 8 ． [ 1 2 ] 徐建云，周彩云．宫颈鳞状上皮癌变过程中细胞周期调节通路 p 1 4 A R F M D M 2 一p 5 3 作用的研究[ J ] ．科技通报，2 0 0 7 ，2 3 1 5 8 ．6 2 ． [ 1 3 ] C a r r - W i l k i n s o nJ ，O ’T o o l eK ，W o o dK M ，e la 1 ．H i g I lf r e q u e l l c y o fp 5 3 ／M D M 2 ／p 1 4 A R Fp a t h w a ya b n o r m a l i t i e si n r e l a p s e d n e u r o b l a s t o m a [ J ] ．C l i nC a n c e rR e s ．2 0 1 0 。1 6 4 1 1 0 8 1 1 1 8 ． [ 1 4 ] V a nM a e r k e nT ，V a n d e s o m p e l eJ ，R i h a n iA ，e ￡a 1 ．E s c a p ef r o m p 5 3 一m e d i a t e dt u m o rs u r v e i l l a n c ei nn e u r o b l a s t o m a s w i t c h i n go f f t h ep 1 4 A R F 一M D M 2 一p 5 3a x i s [ J ] ．C e l lD e a t hD i f f e r 。2 0 0 9 ，1 6 1 2 1 5 6 3 1 5 7 2 ． 收稿日期2 0 11 - 0 6 - 1 5 本文编辑李颖 万方数据
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