燃煤污染型砷中毒患者外周血中丝裂酶原活化蛋白激酶信号通路相关基因mRNA转录表达情况.pdf

7 8 8 主堡亟随医堂苤查 Q 生2 旦筮璺Z 鲞筮 塑g 也』里堕 丛鲤，墨 P 些竺 Q 盟 燃煤污染型砷中毒患者外周血中丝裂酶原 活化蛋白激酶信号通路相关基因m R N A 转 录表达情况 罗鹏张爱华肖芸潘雪莉董学新黄晓欣 【摘要】目的检测燃煤污染型砷中毒患者外周血淋巴细胞中丝裂酶原活化蛋白激酶 M A P K 中E R K I 、E R K 2 、J N K I 、P 3 8 基因m R N A 的转录表达情况。方法2 0 0 6 年1 2 月在贵州省燃煤型砷中 毒病区兴仁县交乐村选择燃煤污染型砷中毒患者7 0 例，其中轻、中、重度患者分别为3 1 、2 5 、1 4 例，同 时选取1 2k m 以外有相似生活习惯、无燃用高砷煤史、经健康体检无异常、年龄性别匹配的大果朵村 村民3 0 名作为对照组。检测环境介质、粮食和观察对象尿、发中砷含量；采集外周血，T r i z o l 法提取外 周血淋巴细胞中总R N A ，反转录获得c D N A 。采用实时荧光定量P C R Q T - P C R 检测外周血淋巴细胞 中M A P K 信号通路中相关基因 E R K l 、E R K 2 、J N K l 、P 3 8 m R N A 转录表达。结果 燃煤型砷中毒病 区环境介质中室内空气、室外空气、煤、辣椒和玉米中砷含量[ 中位数 四分位数 ] 分别为0 ．0 7 9 0 ．0 5 3 ～0 ．1 1 7 m s ／m 3 、0 ．0 0 7 0 ．0 0 2 0 ．0 1 5 m s ／m 3 、9 3 ．0 1 0 3 9 ．4 6 0 ～2 1 1 ．7 4 0 m S ／k g 、3 ．4 6 0 0 ．5 5 0 ～1 6 ．7 6 0 m s ／k g 和1 ．5 0 0 0 ．3 0 0 ～4 ．1 4 0 m s ／k g ，均超出国家卫生标准。土壤、大米和饮用水 中砷含量分别为1 2 ．1 3 0 4 ．2 3 0 ～2 4 ．8 2 0 、0 ．6 5 0 0 ．3 0 0 0 ．9 8 0 和0 ．0 4 3 0 ．0 1 2 ～0 ．0 8 9 m s ／k g ，砷 含量均在国家卫生参考标准之内。与对照组[ 2 6 ．9 7 9 ．7 ．1 g ／g 肌酐] 相比，燃煤污染型砷中毒患 者尿砷含量[ 7 1 ．4 8 2 2 ．7 4 斗g ／g 肌酐] 较高，差异有统计学意义 F 9 0 ．3 8 ，P 2 5 0m l ；干燥处理保存的玉米、大米和辣椒在调查点 村民家内采集，每份 1 0 0 0g 。 2 ．生物样本的收集 1 发样取枕后距发根 3c m 之内的毛发2 3g ；按以下程序处理依次在 丙酮、乙醚、乙醇中浸泡2 0m i n 后，采用体积分数为 1 ％的非极性洗涤剂振摇1 5m i n ，然后蒸馏水洗净、 干燥，用于发砷的测定。 2 尿样取晨尿样2 5 0m l ， 按总体积的1 ％加入浓盐酸防腐，于一2 0 ℃冰箱中 保存用于尿砷的测定，测定时设立空白管。 3 血 样知情同意的原则下，用负压管采集清晨空腹外周 血2m l ，分离血清，于一2 0 ℃冰箱中保存。 3 ．砷含量的检测 1 采用国家标准对空气 G B 8 9 1 2 1 9 8 8 D o ] 、煤 G B ／T 3 0 5 8 1 9 9 6 ‘1 1 ] 、土壤 G B ／T 8 9 1 5 1 9 8 8 ⋯、水 G B ／T 8 5 3 8 1 9 9 5 引、食 品 G B ／T S 0 0 9 ，1 1 1 9 9 6 u 4 1 环境介质和粮食中砷含 量进行检测。 2 尿及头发中砷负荷检测采用二 乙基二硫代氨基甲酸银法 A g - D D C 法 ，采用国家 标准测量法 W S ／T 2 8 1 9 9 6 纠测定尿砷和发砷， 其中尿砷结果经尿肌酐校正，单位为斗g ／g 肌酐。 4 ．M A P K 信号通路中相关基因m R N A 转录表达 检测 1 总R N A 提取及完整性和纯度鉴定常规 分离淋巴细胞，T r i z o l 提取总R N A ，检测R N A 纯度、 浓度并用质量浓度为1 ％琼脂糖凝胶电泳检测R N A 完整性。 2 合成按照P r i m e S c r i p t l MR Tr e a g e n tK i t 逆转录试剂盒的操作方法进行c D N A 合成；将E P 管 放置冰上，分别加入5 P r i m e S c r i p t 。M 缓冲液6I x l 、 P r i m e S e r i p t l MR T 酶混合液1 ．5 l 、5 0t x m o l ／LO l i g o d T 引物1 ．5 l 、1 0 0 斗m o l ／L 随机的6 核苷酸引物 1 ．5 斗l 和总R N A1 ．5 g ，然后用R N a s eF r e edH 2 0 补充至3 0 斗l ，反应液在3 7 ℃1 5m i n ，8 5 ℃5S 的反 应条件下合成c D N A ，合成的c D N A 一2 0o C 保存。 3 引物设计与合成从G e n e B a n k 获取人E R K l 、 E R K 2 、J N K l 和p 3 8 基因的全长c D N A 序列，利用 P r i m e rP r e m i e r5 ．0 软件设计引物，选取相对保守、同 源性高的区域设计引物，以p 一肌动蛋白 p a c t i n 作 内参物，引物均委托宝生物工程 大连 有限公司合 成，见表1 。 4 实时荧光定量P C R 检测反应体 系S Y B RP r e m i xE xT a q ⅢU1 2 ．5 斗l 、1 0 斗m o l ／L 的 上、下游引物各1 斗l ，加入1i l l 模板c D N A ，灭菌 d d H 2 0 补足反应总体积至2 5 斗l 。反应条件9 5o C 预变性1m i n ，9 5 ℃变性1 5S 、6 2o C 退火1 5S 、7 2o C 延伸1 5S ，共4 0 个循环。扩增完毕后进行熔解曲线 分析，起始温度6 5 ℃，终止温度9 5 ℃，每个循环增 加0 ．5 ℃保持1 0S 并检测荧光，共6 0 个循环。每个 样品重复3 次，每次设无模板对照。标准曲线的建 立将正常组c D N A 作为标准，按1 0 倍比例进行倍 比稀释，按上述体系和条件分别扩增相应基因，制作 标准曲线，仪器自动计算每个基因实际扩增效率 E 和相关系数 r 。结果计算目标基因m R N A 的 相对表达量采用B i o R a d C F X - 9 6 软件自动计算，以 对照组为1 ，计算方法为P f a f f lM e t h o d0 1 6 - 1 7 ] ，通过 C t 值和每个基因的扩增效率并用B a c t i n 校正后自 动计算。 表1 引物序列和产物长度 万方数据 生堡亟堕匿堂盘查 Q 生 旦筮垒 鲞筮 翅￡ 也』旦型丛鲤 P 里 竺 Q 丛 盟堡竺 四、统计学分析 采用S P S S1 7 ．0 统计软件进行统计学分析。环 境介质和粮食中砷含量数据呈偏态分布，以中位数 四分位数 表示；尿砷、发砷数据以元s 表示，组间 比较采用单因素方差分析，两两比较采用S N K - q 检 验；E R K l 、E R K 2 、J N K l 、p 3 8m R N A 转录实验数据呈 偏态分布，用中位数 四分位数 表示，组间比较采 用K r u s k M W a l l i sH 检验，检验水准仅 0 ．0 5 ，两两 比较调整检验水准仅 0 ．0 1 7 。 结果 一、燃煤型砷中毒病区环境介质和粮食中砷含 量测定结果 由表2 可见，燃煤型砷中毒病区环境介质中室 内空气、室外空气、煤、辣椒和玉米中砷含量超出国 家卫生标准2 ．1 4 ．9 倍。土壤、大米和饮用水中砷 含量分别为1 2 ．1 3 、0 ．6 5 和0 ．0 4 3m g ／k g ，砷浓度在 国家卫生参考标准之内。 二、尿砷、发砷检测结果 由表3 可见，与对照组相比，燃煤型砷中毒患者 尿砷、发砷含量增高，差异有统计学意义 P 0 ．0 1 ；随患者病情程度的加重，患者体内尿砷、发 砷含量增加，与轻度组相比，重度组尿砷、发砷含量 增高，差异有统计学意义 P 0 ．0 1 。 三、E R K l 、E R K 2 、J N K l 、p 3 8m R N A 的标准曲 线、熔解曲线 熔解曲线的分析结果显示E R K l 、E R I 2 、J N K l 、 p 3 8 基因扩增产物的熔解曲线为单峰，无引物二聚 体及杂带，说明在反应条件下各基因具有较好的特 异性；B a c t i n 、E R K l 、E R K 2 、J N K l 和p 3 8 基因的扩 增效率分别为8 9 ．9 ％、8 0 ．3 ％、8 6 ．0 ％、9 2 ．7 ％和 8 7 ．0 ％，以此实际扩增效率计算样本中各靶基因相 对表达量。根据所测定的标准曲线，以上各基因的 r 值分别为0 ．9 9 7 、0 ．9 8 7 、0 ．9 8 9 、1 ．0 0 0 和0 ．9 9 6 ，具 有良好线性关系。 表3 不同组别调查对象尿砷、发砷测定结果 元s 注与对照组比较3 P O ．0 1 ；与轻度组比较“P O ．0 1 四、砷中毒患者外周血淋巴细胞中E R K l 、 E R K 2 、J N K l 和p 3 8m R N A 的转录表达 由表4 可见，与对照组相比，病例组除E R K 2 、 J N K lm R N A 相对表达量减少外，病例组的E R K l 和 p 3 8m R N A 相对表达量差异无统计学意义；将病例 组分层分析，E R K l 、p 3 8m R N A 转录表达在对照组 及轻、中、重度砷中毒组差异无统计学意义；E R K 2 m R N A 转录表达在轻、中、重度砷中毒患者组低于对 照组 z 值分别为一2 ．8 9 、一3 ．1 9 、一2 ．6 7 ， 表2燃煤型砷中毒病区各检测项目中砷含量 表4 不同组别调查对象外周血淋巴细胞中相关基因的相对表达量[ 中位数 四分位数 ] 注与对照组比较，8 P 0 ．0 1 万方数据 主堡亟堕匡堂苤查 Q 生 旦筮兰 鲞筮 翅堡 也』￡堕 丛型 乜 尘竺 Q ， 尘垒 盟 P 0 ．0 1 ；J N K lm R N A 转录表达在轻、重度砷中毒 组低于对照组，差异有统计学意义 Z 一3 ．7 2 ， P 0 ．0 1 。 讨论 外源化合物从暴露开始到致机体发生疾病的连 续过程中，在不同阶段、不同环节、不同水平上可呈 现不同程度的异常、可测量的信号指标【l6 。“ J 。检测 这些信号指标对早期发现某些特异性损害、早期诊 断、判断疾病的病情变化以及阐明其毒作用机制等 均有重要理论意义和实用价值。 在本研究中，村民所用燃煤、室内、外空气及辣 椒、玉米中砷含量仍超过国家卫生标准的2 ．1 4 ．9 倍，表明砷中毒病区环境中低浓度砷污染情况仍然 存在，病区居民仍可能通过呼吸道、消化道以及皮肤 等途径接触过量砷，提示除仍需加强煤砷监测工作、 禁绝高砷煤的开采和燃用等预防控制关键措施和手 段的实施之外，尚应重视对病区砷暴露者进行定期 体内砷负荷的监测并酌情驱砷；对高砷负荷的患者 则应采取驱砷及针对性治疗，以减轻砷对机体的持 续损害。 M A P K 信号转导通路是真核生物信号传递网络 中的重要途径之一，神经递质、激素、生长因子、细胞 因子、缺血、应激等多种因素均可通过该通路调节转 录因子的磷酸化，以及胞质蛋白激酶、磷脂酶、骨架 蛋白等的转录和翻译，是细胞外信号引起细胞凋亡 甚至导致细胞死亡的共同通路盯1 9J 。目前已至少 发现有3 条M A P K 家族通路ⅢJ 细胞外信号调节蛋 白激酶通路、c - j u n 氨基末端激酶通路和p 3 8 M A P K 通路等亚族。E R K l ／2 是M A P K 通路一重要途径， 主要介导细胞的增殖和分化，J N K 、p 3 8 途径主要介 导细胞凋亡，与细胞损伤、氧化应激反应密切有关， 激活的J N K l 和p 3 8 通路在细胞凋亡过程中起重要 作用‘2 。 笔者采用R T P C R 技术检测了燃煤污染型砷中 毒患者外周血淋巴细胞中M A P K 信号通路相关基 因在m R N A 水平上的表达情况，结果发现与对照 组相比，轻、中、重度砷中毒患者外周血淋巴细胞中 E R K 2 、J N K lm R N A 相对表达量的差异有统计学意 义；表明砷进入机体后引起了患者体内外周血淋巴 细胞M A P K 信号通路相关m R N A 的表达水平发生 改变，提示M A P K 信号转导通路与砷中毒的发病机 制有关，因为M A P K 信号转导通路的改变可通过级 联放大作用而影响其下游信号分子的改变，从而导 致机体正常细胞的生长受到影响，进而诱导细胞凋 亡，导致机体内细胞增殖与凋亡失衡，细胞增殖失 控，最终导致疾病甚至癌症的发生。 M A P K 信号通路中E R K 、J N K 和p 3 8 等通路均 有其特异性的阻断剂，其中任何一个环节有所突破， 都将会对揭示砷致机体损伤作用的机制和砷中毒的 外周生物标志物的筛选、诊断和治疗乃至利用砷治 疗疾病产生深远意义。因样本量的限制，本次研究 未能系统的检测M A P K 信号通路中相关因子的变 化，但由于样本具有其特殊性，是来自于不同于广泛 流行的饮水型砷中毒的燃煤污染型砷中毒病区患 者，其研究结果为砷中毒的发病机制研究提供了宝 贵的人群实验资料，有利于进一步探讨砷中毒与 M A P K 的相互关系。 参考文献 [ 1 ] 张爱华．砷与健康．北京科学出版社，2 0 0 8 1 8 ． 『2 ] 孙殿军，高彦辉，于光前，等．中国“十一五”地方性砷中毒主 要防治与研究任务的探析．中国地方病学杂志，2 0 0 6 ，2 5 1 3 - 5 ． [ 3 ] 胡昌军，张爱华，黄晓欣，等．砷中毒患者皮肤组织增殖细胞 核抗原的表达．中国地方病学杂志，2 0 0 0 ，1 9 4 2 4 1 - 2 4 2 ． [ 4 ] 杨大平，张爱华，李军，等．燃煤型污染砷中毒与肝损害关系． 中国公共卫生，2 0 0 9 ，2 5 9 1 1 4 0 一1 1 4 1 ． [ 5 ] 李远，刘起展．砷化物所致细胞恶性转化的信号通路研究进 展．中华预防医学杂志，2 0 1 1 ，4 5 7 6 5 7 - 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6 0 1 ． [ 1 7 ] P f a f f lM W ．An e wm a t h e m a t i c a lm o d e lf o rr e l a t i v eq u a n t i f i c a t i o ni n r e a l t i m eR T P C R ．N u c l e i cA c i d sR e s ，2 0 0 l ，2 9 9 e 4 5 ． [ 18 ] C a r l o n iV ，P i n z a n iM ，G i u s t iS ，e ta 1 ．T y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o no f 万方数据 生堡亟堕匿堂盘查 Q 生 旦筮盟鲞筮 翅垦 也』里望 丛塑墨 P 堂堕 Q 丛塑盟生竺 f o c a la d h e s i o nk i n a s eb yP D G Fi s d e p e n d e n to n r a si nh u m a n h e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ．H e p a t o l o g y ，2 0 0 0 ，3 1 1 1 3 1 1 4 0